苏云金芽孢杆菌几丁质酶chi9602突变体的表达及初步晶体学研究

摘要

几丁质酶属于糖基水解酶家族的一种，其分子大小因物种的不同而不同。几丁质酶能催化几丁质水解成为N-乙酰氨基葡萄糖和几丁寡糖。随着几丁质酶在农业和工业方面的重要应用，特别是植物真菌防治，植物病原害虫的防治，农业杀虫剂的研发，几丁寡糖的生产，单细胞蛋白的生产，因而引起了研究人员越来越多的重视。
　　在本研究中，将经过分子定向改造的苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chitinase连接在载体pET-28a(+)上构建新的表达载体，然后将构建的载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，分别针对pET-28a(+)-chitinase和pTrcHisB-chitinase进行表达条件的优化（诱导剂浓度，诱导温度，诱导时间），最终确定了目的蛋白的最佳表达条件：pET-28a(+)-chitinase在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件为：0.1mM IPTG，16oC，16h；pTrcHisB-chitinase在E.coli TOP10中的最佳表达条件为：1mM IPTG，28oC，6h。接着在最佳的表达条件下诱导目的蛋白大量表达，并通过Western blot验证了表达的蛋白是目的蛋白。随后通过亲和层析、凝胶层析等一系列纯化，获得了大量高纯度的几丁质酶。对几丁质酶进行了酶活性的测定：pET-28a(+)-chitinase的比酶活为71U/mg，pTrcHisB-chitinase的比酶活为68U/mg。并分别通过圆二色谱检测表明几丁质酶在两种不同载体上表达时，二级结构发生了一定的变化。最后，通过蛋白结晶试剂盒的筛选，初步得到了几丁质酶的蛋白晶体，并通过X-ray衍射证明了此晶体是蛋白晶体。
　　对几丁质酶蛋白结晶条件的初步筛选，为进一步得到有高衍射质量的晶体奠定了一定的基础，得到几丁质酶的蛋白结构将有助于揭示酶的结构与功能的关系并为其他类似蛋白质结构和功能的研究提供参考。

目录

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1 研究概述

1.1 课题背景

1.2 蛋白质的表达

1.3 生物大分子晶体学

1.4 课题研究的目的及意义

1.5 课题研究的技术路线

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1载体构建

3.2 几丁质酶表达条件的优化

3.3 几丁质酶的纯化及其检测

3.4 结晶条件的初筛

4 讨论

4.1 表达载体的选择

4.2 目的蛋白表达的纯化

4.3 蛋白质生物活性的保持

4.4 蛋白质的纯化

4.5 蛋白质的稳定性检测

4.6 蛋白质结晶的问题

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致谢

参考文献

附录1 序列

附录2 实验中所用到的质粒图谱