DNA去甲基化酶DNG701和704在水稻育种中的应用

摘要

本发明涉及一种DNA去甲基化酶DNG701和DNG704在水稻育种中的应用。本发明敲除了两个与水稻生殖生长发育相关的去甲基化酶基因，通过转化水稻本身，获得这两个敲除突变的转基因植株；同时构建了这两个基因的双敲除突变植株。通过对转基因水稻整个发育期表型观察分析以及相关分子机理的研究，确定了这两个基因在水稻生殖生长发育以及胚、胚乳发育中具有重要的作用，为水稻提升产量、优化品质等提供了参考。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻育种领域，更特别地，涉及DNA去甲基化酶DNG701和DNG704在水稻育种中的应用。

背景技术

DNA甲基化修饰是表观遗传修饰中一种重要的修饰类型,可能在调控生物的生长发育、基因表达、相应逆境胁迫等方面起着重要作用。在拟南芥中的DNA去甲基化酶主要包括ROS1、DME、DML2以及DML3。这四个甲基化酶均被证实具有去甲基化酶酶活性，能够调控全基因组甲基化水平，并且各自在植物中执行不同的生物学功能，产生相应的生物学效应。

水稻中也存在DNA去甲基化酶包括四个主要基因，分别为DNG701、DNG702、DNG703以及DNG704。但是，这些去甲基化酶具体对水稻产生什么样的生物学影响，目前尚不清楚。

专项资金的资助

本申请的研究得到了中央高校基本科研业务费专项资金(2012ZYTS057)的资助。

发明内容

本发明提供了DNA去甲基化酶DNG701和DNG704在水稻育种中的应用。

本发明还提供了一种获得籽粒败育水稻品系的方法，包括将原始水稻品系中的DNG701和DNG704进行双敲除的步骤。

在一个具体实施方案中，通过CRISPR的方法对所述原始水稻品系中的DNG701和DNG704进行双敲除。

在一个具体实施方案中，敲除靶点的序列如SEQ ID NO：1或2所示。

在一个具体实施方案中，所述原始水稻品种为Dongjin。

本发明敲除了两个与水稻生殖生长发育相关的去甲基化酶基因，通过转化水稻本身，获得这两个敲除突变的转基因植株；同时构建了这两个基因的双敲除突变植株。通过对转基因水稻整个发育期表型观察分析以及相关分子机理的研究，确定了这两个基因在水稻生殖生长发育以及胚、胚乳发育中具有重要的作用，为水稻提升产量、优化品质等提供了参考。

附图说明

图1转基因植株中的DNG701和704的测序图谱。

图2为双突变株和野生型所产籽粒中正常籽粒、败育籽粒和发育迟缓籽粒占比的统计图。

图3为T1代籽粒中不同类型的籽粒在各发育阶段的照片。

图4为T3代籽粒中不同类型的籽粒在各发育阶段的照片。

图5为野生型的正常籽粒与双突变株的发育迟缓籽粒的对比照片。

图6为双突变株后代进行切片和染色得到的染色照片。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、DNG701和DNG704突变株的构建

以水稻品种Dongjin作为原始株系，进行遗传操作。

在研究过程中，我们获得两个DNA去甲基化基因DNG701和DNG704，核酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，两者有93％的序列一致性。

根据摸索，确定对DNG701和DNG704进行CRISPR双敲除的靶位点如下：

dng701/704-target1：5’-ggctgacggggaggggatcc-3’(SEQ ID NO：1)；

dng701/704-target2：5’-ggaggtgagtcctccctagc-3’(SEQ ID NO：2)。

根据上述靶位点，设计相应的引物，以DNG701和DNG704的cDNA为模板，融合扩增与U6启动子连接的相应序列，得到含有相应序列表达框的片段(长度均为898bp)。然后将含有相应序列表达框的片段插入载体pCXUN中，得到相应的敲除质粒(dng701-pCXUN、dng704-pCXUN以及dng701/704-pCXUN)。用来扩增的引物如表1所示。

表1构建敲除质粒的引物

通过根瘤农杆菌介导敲除质粒转入到水稻品种Dongjin中，得到转基因植株。

将所获得的转基因植株进行基因型鉴定，结果如图1所示，共获得两个纯合家系。其中第一个家系，其突变类型是在DNG701的外显子上插入一个碱基，同时在DNG704的外显子上缺失4个碱基从而导致两个基因同时移码突变。第二个家系的突变类型是在DNG701的外显子上缺失4个碱基，同时在DNG704的外显子上缺失38个碱基，从而引起两个基因的移码突变。

2、DNG701/704双突变产生的生理水平影响

将由实例2获得的dng701/704纯合突变体植株进行田间种植，并对其进行表型考察。结果如图2所示，对于野生型的植株，共统计1855个颖壳，其中有1765颗是形态和育性较为正常的。在dng701/704双突变株中，申请人共统计了2108颗颖壳，其中，有1066颗是发育正常的，约有500颗是发育迟缓的，有542颗是败育的。上述结果说明，dng701/704双突变以后导致结实率下降。

对后代种子发育进程进行严谨的考察，对T1代种子发育情况进行统计，如图3所示，双突变株T1代种子中产生三种类型的种子，其中一种是发育状态与野生型相差无几的较为正常的种子，第二种是相对于同时期的野生型来说种子发育较为迟缓的，第三种是子房不进行涨大的种子类型。前两种种子可以进行发芽，并且可以长成完整的植株，但是第三种不可以进行发芽。进一步统计T3代种子发育情况，如图4所示，仍然存在三种类型的种子，说明该材料的表型可以稳定遗传。发育迟缓的种子生长到其发育后期时，其胚乳发生明显的生长异常现象如图5。以上结果均表明DNG701/704在水稻生殖发育中具有重要的功能，能够控制水稻胚乳的积累。

对后代种子进行石蜡切片，观察到其细胞学水平上的影响。具体步骤如下：

1)取材与固定：将所需材料尽量剪小，加入预冷的FAA固定液中，固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上，抽真空15min，缓慢放气，再重复两次，直到材料沉底。注意抽真空时要避免固定液沸腾，以免破坏细胞形态。因为抽真空时会导致固定液大量挥发，成分改变，抽完真空要将固定液倒出，换新鲜的固定液，固定过夜。

2)FAA固定液固定样品2天，可直接用于下面的操作。

3)脱水：将样品移至做蜡切片的小瓶中，进行脱水步骤前，首先要用相应浓度的乙醇溶液洗去固定液中的甲醛、乙酸。如用50％FAA固定的，要先用50％乙醇替换固定液，一般换三次，每次30min；如果是用70％FAA固定，先用70％乙醇洗掉固定液，换三次，每次30min。然后梯度乙醇脱水：

4)70％乙醇孵育至少1hr，可过夜,亦可长期保存；85％乙醇孵育1h，95％乙醇(含伊红或曙红)孵育1h。

5)继续脱水和透明(可以用二甲苯或氯仿)，二甲苯透明；然后浸蜡。

6)包埋：预先折好纸盒，并在电磁炉上熔化新的石蜡，置于60℃温箱中备用，注意包埋蜡温度不要过高，以免烫坏组织。包埋时，先铺一层包埋蜡，再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中，镊子稍加热，均匀排列材料。让材料自然冷却，可第二天再收。注意包埋蜡不要倒太多，蜡块厚度以1-2cm为宜，太厚不好切片。

7)修蜡块：将冷却好的蜡块从纸盒中取出，翻过来，可看到被伊红或曙红染色的材料。用单面刀将材料修成上窄下宽的梯形台。注意上面被刀片切割的平面要呈长方形，如果被切割的面不平行，切出的蜡带将不能成为直带。修块时要根据需要将材料摆成纵切或横切的方向，比如切子房、SAM需要纵切，而花药需要横切。

8)然后进行粘片和展片；进而通过脱蜡和复水，染色后进行透明以及封片。拍照封存。

结果如图6所示，DNG701/704双突变株的种子中，发育正常的种子其细胞学切片与野生型一致；发育迟缓的种子，相对于野生型来说，其胚和胚乳的积累较为迟缓；败育的种子无法看到明显的胚和胚乳等器官，说明无法完成受精作用或者完成受精作用以后合子无法发育。

3、DNG701/704双突变产生的分子水平影响

3.1、对DNG701/704双突变株的配子体和合子进行全基因组的甲基化二代测序

具体步骤如下：

1)精细胞的提取：(1)收集成熟花粉于50ml离心管中，使其总体积达到5ml左右。(2)加入10ml 45％蔗糖溶液，用玻璃棒轻轻捣碎花粉，在冰上静置5min。(3)900g离心3min，收集上清，然后将上清转移到新的50ml离心管中，放置于冰上。(4)向含有上清的离心管中加入5倍体积的15％蔗糖溶液，轻轻混匀，静置于冰上。(5)配置FDA工作溶液。(6)吸取步骤(4)中获得的细胞混合液10μl，加入1μl FDA工作液，混匀，滴到干净的载玻片上(7)在显微镜下找到发绿色荧光的精细胞，然后用显微操作仪吸出来，放入无RNA酶的离心管中保存。可直接进行建库过程，若不直接进行建库过程，需要放到-80℃中保存。此样品最多可保存一个月。

2)卵细胞提取：(1)收集未受精的子房，在解剖镜下用解剖针取出胚囊，将取出的完整胚囊放入等渗缓冲液溶液中。(2)在显微镜下将胚囊戳破，然后释放出所有细胞。(3)加入FDA溶液，在GFP荧光场下找到卵细胞，然后用显微操作仪吸出来，放入无RNA酶的离心管中。

3)细胞的预处理：在建库之前需要对细胞进行预处理，首先向取出的细胞中加入两倍体积的裂解溶液，同时加入0.5μl蛋白酶K；然后37℃孵育1h。

4)甲基化文库构建：甲基化文库的构建步骤如下：(1)加入65μl CT转化溶液，进行如下程序：98℃，8min；65℃，180mim；4℃保存。该步骤所用的CT转化溶液采购于Zymo公司，货号为D5003。(2)将上步反应液进行柱子纯化，最后向柱子中加入33μl水。12000rpm离心2mim到新的1.5ml离心管中，然后转移到0.2ml无核酸的离心管中，加入4μl Blue buffer，1.6μl dNTP mix，1.6μl Preamp primer。65℃反应3min，冰上孵育2min。加入1μl klenowexo-酶。此过程所用的纯化回收的DNA回收试剂盒采购于Invitrogen,货号K310050。(3)进行如下程序：4℃反应5min；4℃-37℃进行温度梯度孵育，每分钟上升4℃；37℃孵育30min；4℃保存。(4)95℃，45s；冰上2min。配置Master mix。Master mix配方：2.5μl Blue buffer，1μl dNTP mix，10μl Preamp primer，5μl klenow exo-，6.5μl水。向(2)反应产物中加入2.5μl Master mix。进行步骤(3)。(5)将步骤(4)再进行四次。(6)将上步产物进行beads纯化。最后加入40μl水进行洗脱。此过程所用beads采购于Beckman Coulter，货号：A63881。(7)加入5μl Blue buffer，2μl dNTP mix，2μl Adapter 2-lx；95℃反应2min，冰上2min。(8)进行如下程序：4℃反应5min；4℃-37℃进行温度梯度孵育，每分钟上升4℃；37℃孵育90min；4℃保存。(9)将上步产物进行beads纯化。最后加入36μl水进行洗脱。(10)加入10μl KAPAbuffer，1μl dNTP mix，1μl PE1.0，1μl INDEX primer，1μl KAPA polymerase。(11)进行如下反应：95℃，120s。(12)94℃，80s，65℃，30s，72℃，30s。(13)将(12)步骤进行10-14次。(14)72℃，180s。(15)4℃保存。(15)进行beads纯化，加入15μl进行洗脱。

结果显示，在各个细胞类型中，双突变株的全基因组甲基化水平的均远高于野生型。由此可知，水稻中这两个DNA去甲基化酶在其生殖发育过程中起着不可或缺的作用。

3.2、构建转录组文库，检测双突变对转录组的影响。

具体步骤如下:

1)细胞的预处理：在建库之前需要对细胞进行预处理，首先向取出的细胞中加入1μl RNA酶抑制剂，室温孵育5min；可直接进行转录组建库过程。若不进行建库过程，可放在-80℃保存2-3天。

2)单细胞RNA反转录：(1)向样本中加入1μl 10X Lysis Buffer，室温孵育5min。(2)加入2μl 3’SMART-Seq CDS Primer II A，混匀，72℃反应3min。然后冰上2min。(3)加入4μl 5X Ultra Low First-Strand Buffer、1μl SMART-Seq v4 Oligonucleotide、0.5μlRNase Inhibitor、2μl SMARTScribe Reverse Transcriptase。(4)进行如下程序：42℃，90min；70℃,10min；4℃保存。(5)加入25μl 2X SeqAmp PCR Buffer OR 2X SeqAmp CB PCRBuffer、1μl PCR Primer II A、1μl SeqAmp DNA Polymerase、3μl Nuclease-Free water。(6)95℃，1min。(7)98℃，10s；65℃，30s；68℃，3min。(8)将步骤⑦进行17个循环。(9)72℃，10min。然后4℃保存。此过程所用的所有的试剂购自TAKARA公司。

3)转录组文库构建：转录组文库的构建步骤如下：(1)将反转录出的cDNA用超声波进行打断。(2)将上步反应液进行beads纯化，加入40μl重悬buffer进行重悬。(3)加入30μlrepair mix，5μl重悬buffer混匀；30℃反应30min。(4)加入120μl beads进行纯化，用16μl重悬buffer进行重悬。(5)加入9μl AT mix，37℃反应30min，70℃反应5min，然后4℃保存。(6)加入2.5μl重悬buffer，2.5μl Adaptor，2.5μl连接mix。30℃反应10min。(7)加入3.5μlstop ligation buffer，混匀。(8)加入35μl beads，并用15μl重悬buffer进行重悬。(9)将上步产物加入3.5μl primer，17μl PCR mix。(10)98℃，30s。(11)98℃，10s，60℃，30s，72℃，30s.(12)将(11)步骤进行10-14次。(13)72℃，5min。4℃保存。(14)加入28μl beads，然后用17μl水进行洗脱。此过程所用的所有的试剂购自illumina公司。

结果显示，与野生型相比，在卵细胞中，双突变株中有1824个基因下调表达，同时有1854个基因上调表达；在合子细胞中，1061个基因下调表达，1152个基因上调表达。

以上实验证明，DNG701和704在水稻配子体中起着不可或缺的作用。DNG701和704的双突变会导致水稻品种发生败育和胚乳发育不良的情况。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> DNA去甲基化酶DNG701和704在水稻育种中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctgacggg gaggggatcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggaggtgagt cctccctagc 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgacggg gaggggatcc gttttagagc tagaaatagc aagtta 46

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatcccctc cccgtcagcc aacctgagcc tcagcgcagc 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaggtgagt cctccctagc gttttagagc tagaaatagc aagtta 46

<210> 6

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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