一种引物探针组合及基于qRT-PCR的HPIV-3特异性中和抗体滴度的检测方法

摘要

本发明公开了一种引物探针组合及基于qRT‑PCR的HPIV‑3特异性中和抗体滴度的检测方法，一种引物探针组合，探针为：FAM‑ACCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACC‑TARAMA，引物为：上游引物：ATATTGGACCCACAAAAATCGA，下游引物：CTGAGAGTGTTTCGTTTCGGAT；引物探针组合可用于qRT‑PCR检测HPIV‑3病毒RNA拷贝数，且测定HPIV‑3HN基因具有高度的专一性；基于qRT‑PCR的HPIV‑3特异性中和抗体滴度的检测方法，将基于qRT‑PCR的病毒感染滴度的检测方法用于病毒特异性中和抗体的检测，使中和抗体的检测摆脱了对噬斑实验的依赖，同时具备了qRT‑PCR，准确、快速和重复性好的优点，具有广阔的应用前景；免提取，针对咽拭子样本和血清样本的病毒RNA无需核酸提取，可直接对样本进行扩增。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学技术领域，具体涉及一种引物探针组合及基于 qRT-PCR的HPIV-3特异性中和抗体滴度的检测方法。

背景技术

人三型副流感病毒(Human parainfluenza virus type 3，HPIV-3)是世界范围内仅次于呼吸道合胞病毒的引起1岁以内婴幼儿下呼吸道感染(肺炎，支气管炎)的主要病因，HPIV-3还是引起老年人、免疫力低下成年人下呼吸道疾病的重要病因。迄今，还没有批准上市的HPIV-3疫苗。目前，减毒活疫苗是HPIV-3 疫苗研发的主要目标。病毒感染滴度的测定对活疫苗感染效力的测定，以及疫苗研制过程中质量控制至关重要。目前，病毒感染滴度测定的方法主要有 CCID50法和蚀斑实验法。这两种方法都是基于病毒感染易感宿主细胞产生细胞病变。虽然具有敏感、专一等特点，但易受细胞状态和细胞种类的影响，而且存在实验周期长，实验重复性差等缺点。

实时定量PCR(qPCR)技术是一种通过PCR过程中动态监测扩增产物荧光浓度，来精确测定模板中DNA或RNA拷贝数的方法，具有快速、敏感、特异和重复性高等优点。目前已广泛应用于病毒滴度检测。qPCR主要包括染料法 (SYBR Green)，探针法(TaqMan)和分子信标法(Molecular Beacons)等，由于具有更高的敏感性和特异性，TaqMan探针法是最常用的一种。但qPCR技术检测的是总病毒核酸拷贝数，并不能区分感染性病毒和非感染型病毒。将病毒感染细胞和qPCR技术相结合可以检测病毒感染滴度，其原理是将待测样品和已知滴度参考品作相同的系列稀释后，分别同时接种于同一细胞板中培育，提取RNA后再进行qPCR，在待测样品和参考品复制效力相同的情况下，通过双平行线分析，测定待测样品的感染滴度。目前已应用于轮状病毒减毒活疫苗和麻疹病毒减毒活疫苗中病毒感染滴度的检测。中和抗体是疫苗免疫接种后机体产生的能够与目标病毒结合，可以清除和阻止病毒感染的抗体，是评价疫苗保护效力的重要指标。经典的中和抗体检测方法是噬斑减少实验，因此检测方法同样也存在，试验周期长、重复性差的缺点。

本发明的目的就是建立一种基于qRT-PCR方法能快速准确检测HPIV-3中和抗体的方法。

发明内容

为了部分解决上述技术问题，本发明提供了一种引物探针组合及基于 qRT-PCR的HPIV-3特异性中和抗体滴度的检测方法，具体技术方案如下：一种引物探针组合，

上述探针为：

FAM-ACCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACC-TARAMA

上述引物为：

上游引物：ATATTGGACCCACAAAAATCGA

下游引物：CTGAGAGTGTTTCGTTTCGGAT；

上述引物探针组合，上述引物探针组合可用于qRT-PCR检测HPIV-3病毒 RNA拷贝数，且测定HPIV-3HN基因具有高度的专一性。

上述qRT-PCR检测HPIV-3病毒RNA拷贝数方法的建立包括以下步骤：(1) 引物探针设计和验证；(2)HPIV-3HNRNA标准品的制备；(3)qRT-PCR反应体系配制；(4)qRT-PCR扩增程序；(5)标准曲线的建立；(6)qRT-PCR引物探针专一性验证；(7)方法灵敏度和重复性验证。

上述步骤(2)中包括体外转录引物序列、HN RNA的体外转录、体外转录RNA 提取和纯化。

上述步骤(3)中qRT-PCR反应体系如下：2×One Step RT-PCR Buffer III 10 ul，TaKaRa Ex Taq HS(5U/ul)0.4ul，PrimerScript RT Enzyme Mix II 0.4ul， RealHNS(10uM)0.6ul，RealHNA(10uM)0.6ul，HNProbe(10uM)0.2ul，ROX Reference Dye II(50×)0.4ul，模板2ul，DEPC-H

上述步骤(4)中扩增反应条件为Stage 1,Reverse transcription Reps:1 42℃5min 95℃10sec,Stage 2,PCR Reps:40 95℃5sec,57℃34sec。

一种采用引物探针组合进行基于qRT-PCR的HPIV-3特异性中和抗体滴度的检测方法，检测方法如下：(a)96孔板Vero细胞板的制备；(b)HPIV-3标准参考品的稀释；(c)HPIV-3特异性抗血清的稀释；(d)HPIV-3病毒和血清中和试验； (e)qRT-PCR检测HPIV-3拷贝数；(f)中和抗体滴度的确定。

上述步骤(b)中HPIV-3标准参考品125倍稀释，作为中和抗体检测用病毒。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、本发明提供了一套qRT-PCR检测HPIV-3病毒RNA拷贝数的引物对和探针的核苷酸序列，以HNRealS/HNRealA为引物，HPIV-3病毒培养液提取RNA 为模板，扩增出了预期大小的100bp的特异性DNA条带，测序结果显示， 100bpDNA条带核苷酸序列与HPIV-3HN基因对应序列的同源性为100％，说明本实验设计筛选的HNRealS/HNRealA/HNprobe引物探针组合，测定HPIV-3HN 基因具有高度的专一性；

2、本发明提供了一种测定HPIV-3病毒感染滴度的方法、一种测定HPIV-3 特异性中和抗体的方法，本发明将基于qRT-PCR的病毒感染滴度的检测方法用于病毒特异性中和抗体的检测，使中和抗体的检测摆脱了对噬斑实验的依赖，同时具备了qRT-PCR，准确、快速和重复性好的优点，具有广阔的应用前景；

3、免提取，针对咽拭子样本和血清样本的病毒RNA无需核酸提取，可直接对样本进行扩增。

附图说明

图1为本发明HNRealS/HNRealA引物的RT-PCR扩增结果；

图2为HN基因的扩增和HN RNA的体外转录结果；

图3为HNRNA标准扩增曲线；

图4为HNRNA标准曲线；

图5为HNRNA标准品扩增产物的电泳结果；

图6为HPIV-3HNRNA拷贝数检测

图7为HPIV-3HNRNA拷贝数检测

图8为Ct值与稀释度对数值的线性图；

图9为qRT-PCR检测HPIV-3病毒感染滴度的双平行线图；

图10为5X系列稀释HPIV-3参考标准品稳定性；

图11为5X系列稀释HPIV-3参考标准品稳定性；

图12为噬斑减少实验测定HPIV-3特异性中和抗体滴度的噬斑图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.qRT-PCR测定HPIV-3RNA拷贝数方法的建立

1.1 引物探针设计和验证

q-RT-PCR引物和探针位于HPIV-3的HN基因上，使用Primer5设计引物，使用PrimerExpress 3.0验证引物/探针退火温度，使用Blast验证引物特异性。经过对数套引物和探针序列的筛选，选定如表1所列的位于HPIV-3HN基因上的一套引物和探针组合用于实验；

表1：q-RT-PCR引物和探针序列

以HNRealS/HNRealA为引物，HPIV-3病毒培养液提取RNA为模板，扩增出了预期大小的100bp的特异性DNA条带，见图1。测序结果显示，100bpDNA 条带核苷酸序列与HPIV-3HN基因对应序列的同源性为100％。说明 HNRealS/HNRealA引物，可以用于HPIV-3HN基因片段的扩增，具有高度的特异性。

1.2 HPIV-3HNRNA标准品的制备

1.2.1 体外转录引物序列

表2为HPIV-3全长HN基因转录引物，上游引物HNT7S 5’端添加T7 RNA 聚合酶起始位点(下划线)，下游引物HNT7A5’端添加oligo(dT)(15个)，转录RNA长度为1419bp；

表2 HN RNA体外转录引物序列

本实验所用引物和探针均由大连宝生物合成。

1.2.2 HN RNA的体外转录

以HNT7S/HNT7A为引物，HPIV-3病毒培养液提取RNA为模板，RT-PCR 扩增出与预期大小1420bp相同的DNA条带，见图2Lane2。基因测序显示，扩增条带核苷酸序列与HPIV-3HN基因序列的同源性为100％。以切胶纯化的HN DNA为模板，在T7RNA聚合酶(Takara，D2540)作用下，体外转录合成预期大小HN RNA，见图2lane4。说明体外转录HN RNA成功。

1.2.3 体外转录RNA提取和纯化

采用RNeasy mini kit(QIAGENT，Cat no.74104)纯化体外转录RNA。具体方法见试剂盒使用说明。Nanodrop测定体外转录HN RNA的浓度和纯度均符合qRT-PCR实验对标准品RNA的要求，见表3；

表3 体外转录HN RNA浓度和纯度

HN RNA拷贝数按下列公式计算：RNAcopies/ul＝(6.02× 1023x455x10-6g/ml)/584460＝4.7x1014copies/ml＝4.7x1011copies/ul用DEPC处理去离子水，10x系列稀释HNRNA，以4.7×107copies/μl～4.7×100copies/μl 标准品为模板，进行qRT-PCR反应。

1.3 qRT-PCR反应体系配制

用one-step primeScript RT-PCR Kit(Takara，DRR064A)试剂盒，经过对引物、探针工作浓度的优化，确定如下的RT-PCR反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer III 10ul，TaKaRa Ex Taq HS(5U/ul)0.4ul，PrimerScript RT Enzyme Mix II 0.4ul，RealHNS(10uM)0.6ul，RealHNA(10uM)0.6ul，HNProbe(10uM)0.2ul，ROX Reference Dye II(50×)0.4ul，模板2ul，DEPC-H

1.4 qRT-PCR扩增程序

于7500real-time PCR system(Applied Biosystem)上，通过对退火温度、退火时间的优化，确定了如下的扩增程序：Stage 1,Reverse transcription Reps:1 42℃ 5min95℃10sec,Stage 2,PCR Reps:40 95℃5sec,57℃34sec。

1.5 标准曲线的建立

One-step primeScript RT-PCR Kit(Takara，DRR064A)在优化反应体系下，于7500real-time PCR system(Applied Biosystem)上进行qRT-PCR反应，扩增曲线 (图3)、标准曲线(图4)均由设备所带软件自动绘制。结果表明在4.7×10

1.6 qRT-PCR引物探针专一性验证

qRT-PCR检测结果显示，无论是标准品HN RNA还是HPIV-3病毒培养液均检测到了荧光信号(图6)；反应产物凝胶电泳，在100bp处有扩增条带，DNA 测序表明扩增条带核苷酸序列与HPIV-3HN基因上的对应序列同源性为 100％(图7)。而阴性对照物(WI-38细胞、Vero细胞、MA104细胞)，RSV培养液、FluA1，FluA2，FluB型病毒培养液、AV阳性标本以及MP阳性标本均未检出荧光信号，也无特定扩增条带。说明本实验设计筛选的 HNRealS/HNRealA/HNprobe引物探针组合，测定HPIV-3HN基因具有高度的专一性。

1.7 方法灵敏度和重复性验证

采用模板为4.7x10

表4 实验内标准曲线重复性

表5 实验间标准曲线重复性

2.基于qRT-PCR的HPIV-3感染滴度检测方法的建立

2.1 HPIV-3病毒参考标准品

HPIV-3病毒株VR-93,购自ATCC，噬斑法测定滴度为7.2x10

2.2 最适检测用宿主细胞、最佳样品稀释倍数以及最佳检测线性范围收获时间的确定

将参考标准品分别作5X和10X系列稀释，分别接种至WI-38、Vero和 MA104细胞，每块细胞板接种两种系列稀释样品，每个稀释度重复三孔，每种细胞板重复两块，共六块板，每孔接种80ul，37℃5％CO

2.3 96孔板Vero细胞板的制备

Vero细胞，用含EDTA0.25％胰酶消化3分钟，倒去胰酶，用吸管吸取含10％胎牛血清MEM细胞培养液，将贴壁的细胞轻柔反复吹打成悬液，用

2.4 待测样品和参考标准品的稀释和Vero细胞的感染

将待测样品(三型副流感病毒临床标本分离株HPIV3-C68)、参考标准品和 Vero细胞培养上清从-70℃冰箱取出，室温融化，分别吸取200ul，用800ulMEM 进行5x倍系列稀释5

2.5 qRT-PCR检测HPIV-3感染滴度

2.5.1 反应模板的制备

将2.4冻存的96孔板从冰箱取出，室温放置40min，然后将96孔板在振荡器上震荡15s，3000rpm离心3min使培养物收集至孔底。裂解上清 15ul+585ulDEPC水稀释，作为检测模板。

2.5.2 qRT-PCR反应体系配制

用one-step primeScript RT-PCR Kit(Takara，DRR064A)试剂盒。反应体系： 2×One Step RT-PCR Buffer III 10ul，TaKaRa Ex Taq HS(5U/ul)0.4ul， PrimerScript RTEnzyme Mix II 0.4ul，RealHNS(10uM)0.6ul，RealHNA(10uM) 0.6ul，HNProbe(10uM)0.2ul，ROX Reference Dye II(50×)0.4ul，模板7.4ul，总体积20，混匀后进行反应。

2.5.3 qRT-PCR扩增程序

同1.4。结束后，用7500real time PCR system自带的软件进行分析。

2.6 HPIV-3感染滴度的计算

根据7500real-time PCR system给出的待测样品和参考标准品各稀释度的 Ct值，按照中国药典(2015版，第四部)的描述的双平行线法，用combistats 软件(EuropeanDirectorate for the Quality of Medicines)通过参考标准品的滴度计算待测样品的感染滴度，图9为检测结果的双平行线图。

2.7 参考标准品稳定性验证

HPIV-3参考标准品按照检测用量分装于灭菌离心管中，冻存于-80℃，冻存后0年、1年、2年和3年取出，5x系列稀释，按照2.3的方法接种细胞，检测每个稀释度的Ct值，测定其线性范围。结果显示，4个参考标准品稀释倍数对数值/Ct值曲线的斜率和截距没有显著性差异(p>0.05)图10，4条曲线基本重叠(图11)，说明系列稀释的HPIV-3参考标准品在-80℃冰箱保存具有很好稳定性。

2.8 qRT-PCR检测HPIV-3感染滴度方法的验证

HPIV-3标准参考品5X系列稀释，分别用噬斑法和qRT-PCR检测滴度，结果见表6。每种方法分别检测10次，qRT-PCR检测的平均滴度为8.24copies/ml,10 次检测的C.V％为1.12％。噬斑法检测的平均滴度为8.55pfu/ml，10次检测的 C.V％为2.13％。

表6 两种检测方法重复性和精确性的验证

3.基于qRT-PCR的HPIV-3特异性中和抗体滴度的检测方法

3.1 96孔板Vero细胞板的制备同2.3。

3.2 HPIV-3标准参考品的稀释

HPIV-3标准参考品5

3.3 HPIV-3特异性抗血清的稀释

待测血清为HPIV-3免疫小鼠血清。用MEM培养基先将待测血清20X稀释， 0.22μm针式滤器除菌过滤，再进行2X系列稀释，稀释倍数分别为20x、40x、 80x、160x、320x、640x、1280x、2560x。

3.4 HPIV-3病毒和血清中和试验

125x稀释的病毒参考品0.2ml分别加入等体积的3.3系列稀释的抗血清中， 37℃水浴2小时。

3.5 将3.4中的已中和病毒40ul接种于3.1制备的96孔Vero板中，每个稀释度重复3孔，同时在同一板的其它孔中加入不中和的125x稀释的病毒作为 mock对照，加入MEM作为阴性对照。37℃，5％CO

3.6 qRT-PCR检测HPIV-3拷贝数

3.6.1 检测用RNA模板，-80℃冻存的3.5.4的细胞培养板，室温摇床500转/分钟，解冻20分钟，3000转/分钟离心3分钟，取离心上清40倍稀释，取2ul用于qRT-PCR检测。

3.6.2 qRT-PCR检测HPIV-3拷贝数，同1.3-1.5。

3.7 中和抗体滴度的确定

根据HNRNA标准曲线，由7500real-time PCR system软件计算出所有稀释度血清中和后的病毒滴度，以及未中和病毒滴度，中和抗体滴度根据N值计算。N＝(mock对照病毒滴度-血清中和病毒滴度)÷mock对照病毒滴度。各血清稀释度中，N值最接近0.5的血清稀释度为中和抗体滴度。10份HPIV-3阳性血清的中和抗体滴度的检测结果如表7所列，结果8份血清的中和抗体滴度在两种方法检测值中均一致，两份低滴度血清的中和抗体滴度qRT-PCR检测值高于噬斑减少实验。

表7 两种方法检测HPIV-3中和抗体滴度的对比

4.蚀斑法测定HPIV-3感染滴度

4.16 孔板Vero细胞板的制备

Vero细胞，用0.25％含EDTA胰酶消化3分钟，倒去胰酶，用吸管吸取含 10％胎牛血清MEM细胞培养液，反复吹打贴壁细胞至悬液，用Casy细胞计数仪测定细胞的数量和活率。要求细胞活率≥90％。并将细胞浓度调整至 5104cell/ml，加入6孔板进行细胞培养，每孔3ml，细胞数为1.5105cell/孔，37℃， 5％CO

4.2 Vero细胞的感染和蚀斑的观察

用无胎牛血清MEM将细胞板洗涤3次，将103-109 10X系列稀释的待测样品加入6孔板，每孔1ml，37℃，5％CO

5.蚀斑减少实验法测定HPIV-3特异性中和抗体滴度

5.1 Vero细胞板的制备按照4.1的方法制备。

5.2 病毒和抗血清的稀释及中和按3.2、3.3、3.4方法进行。

5.3 病毒的接种和蚀斑的观察

100％铺满的24孔板Vero细胞，吸出上清，用无血清MEM培养液洗三遍，空板，将0.2ml中和后的病毒接种于24孔板Vero细胞，37℃孵育3小时，小心吸出上清，加入1％低熔点琼脂糖0.5ml,室温待琼脂糖凝固后，放置到37℃， 5％CO

5.4 血清中和抗体滴度的计算

使蚀斑数比Mock对照减少50％的血清稀释度为中和抗体滴度。结果蚀斑减少实验测定的待检血清的中和抗体滴度为1:640(如图12)。

结论：本发明提供了一套qRT-PCR检测HPIV-3病毒RNA拷贝数的引物对和探针的核苷酸序列，以HNRealS/HNRealA为引物，HPIV-3病毒培养液提取 RNA为模板，扩增出了预期大小的100bp的特异性DNA条带，测序结果显示， 100bpDNA条带核苷酸序列与HPIV-3HN基因对应序列的同源性为100％，说明本实验设计筛选的HNRealS/HNRealA/HNprobe引物探针组合，测定HPIV-3HN 基因具有高度的专一性；本发明还提供了一种测定HPIV-3病毒感染滴度的方法、一种测定HPIV-3特异性中和抗体的方法，本发明将基于qRT-PCR的病毒感染滴度的检测方法用于病毒特异性中和抗体的检测，使中和抗体的检测摆脱了对噬斑实验的依赖，同时具备了qRT-PCR，准确、快速和重复性好的优点，具有广阔的应用前景。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。