一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT‑PCR方法。本方法为提升检测灵敏度和特异性，引入TaqMan探针；为降低成本，将2对引物改为1对半引物，即：2条上游引物分别靶向突变位点和原始未变异位点，1条下游引物为2条上游引物共用。为增强变异检测的灵敏度，在上游突变引物变异位点5’方向第3个位点引入突变，通过降低反应体系中变异引物与未变异病毒核酸和未变异引物与变异病毒核酸的匹配度，造成反应体系中变异引物扩增变异病毒核酸的扩增曲线早于扩增非变异核酸的扩增曲线，同理，非变异引物扩增非变异核酸的扩增曲线早于变异核酸的扩增曲线。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法。

背景技术

基因测序是目前最常用新冠病毒变种鉴定技术，该技术存在如下缺点

基因测序的上述缺点在应用于新冠肺炎疫情防控，会大幅影响变种检测时效、通量和成本，并可能对检测结果造成影响，直接影响新冠肺炎疫情防控工作

参考文献：

[1]Bezerra et al,A Sanger-based approach for scaling up screening ofSARS-CoV-2variants of interest and concern.Infection,Genetics and Evolution,2021,92:104910.

[2]Vega-Magana,et al.RT-qPCR Assays for Rapid Detection of the N501Y,69-70del,K417N,and E484K SARS-CoV-2Mutations:A Screening Strategy to IdentifyVariants with Clinical Impact.Frontiers in Cellular and InfectionMicrobiology,2021,11:672562.

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

采用名为扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)的改进PCR方法，通过病毒核酸提取-qRT-PCR替代基因测序的病毒核酸提取-RT-PCR扩增-PCR产物纯化-上机测试等繁琐操作步骤，应用多数检测单位配备的荧光定量PCR仪即可完成对病毒变种的准确鉴定，克服对昂贵测序仪的依赖，增加方法的普适性。通过96孔或384孔qRT-PCR反应板，并借助TaqMan探针法的高灵敏度、低成本的点，实现新冠病毒变种的高灵敏度、高通量、低成本检测。

基础方法技术体系由2对引物组成，其中一对引物结合变异位点，另一对引物结合原始未变异位点，根据有无扩增片段及片段长度判定是否有变异。

本方法为提升检测灵敏度和特异性，引入TaqMan探针；为降低成本，将2对引物改为1对半引物，即：2条上游引物分别靶向突变位点和原始未变异位点，1条下游引物为2条上游引物共用。为增强变异检测的灵敏度，在上游突变引物变异位点5’方向第3个位点引入突变，通过降低反应体系中变异引物与未变异病毒核酸和未变异引物与变异病毒核酸的匹配度，造成反应体系中变异引物扩增变异病毒核酸的扩增曲线早于扩增非变异核酸的扩增曲线，同理，非变异引物扩增非变异核酸的扩增曲线早于变异核酸的扩增曲线。应用变异引物和非变异引物两套实验体系检测样品，变异引物体系扩增曲线早于非变异引物出现即判定该检测样品含出现该变异的病毒。

一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法，包括以下步骤：

步骤1，使用Trizol法提取新冠病毒RNA；

步骤2，基于ARMS的qRT-PCR引物探针设计：

步骤2.1，引物设计：按照引物设计通用原则，结合新型冠状病毒印度变种的变异位点附近核苷酸序列，对每个变异位点设计两对引物，其中上游引物3’端分别匹配变异和非变异点，即变异上游引物和非变异位上游引物，两对上游引物共用一个下游引物；

当需要鉴别的变异位点为L452R时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTATCG-3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：5’-GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT-3’，下游引物如SEQ ID NO.3所示：5’-GGAAACCATATGATTGTAAAGGAAAGTAAC-3’；

当需要鉴别的变异位点为T478K时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-TATCAGGCCGGTAGGAA-3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-TATCAGGCCGGTAGCAC-3’，下游引物如SEQ ID NO.6所示：5’-TTGCTGGTGCATGTAGAAGTTC-3’；

当需要鉴别的变异位点为P681R时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：5’-GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCACG-3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示：5’-GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCC-3’，下游引物如SEQ ID NO.9所示：5’-CAAGTGACATAGTGTAGGCAATG-3’；

步骤2.2，TaqMan探针设计：按照TaqMan探针设计通用原则，结合步骤1.1中上下游引物所限定病毒基因组区域序列特点设计TaqMan探针，每个变异位点的两对引物共用一条TaqMan探针；

当需要鉴别的变异位点为L452R时，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：5’-CTATCAGGCCGGTAGCACACCTTG-3’；

当需要鉴别的变异位点为T478K时，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示：5’-CCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACC-3’；

当需要鉴别的变异位点为P681R时，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：5’-CGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAG-3’；

步骤3，基于ARMS进行qRT-PCR实验；

步骤4，结果判读：

步骤4.1，变异引物体系的扩增曲线出现时间早于非变异引物体系2个循环以上，判定检测样品中发生变异；

步骤4.2，非变异引物体系的扩增曲线出现时间早于变异引物体系2个循环以上，判定检测样品中未发生变异。

进一步，所述步骤3基于ARMS进行qRT-PCR实验，具体步骤为：

步骤3.1，配制反应体系：每个反应体系体积为20μl，其中含2X反应液10μl，50μM上游引物0.2μl，50μM下游引物0.2μl，50μM TaqMan探针0.1μl，无菌无RNase水7.5μl，RNA模板2μl，每个变异位点的检测由两个反应体系构成，一个含变异上游引物，另一个含非变异下游引物，其他上述成分相同；

步骤3.2，qRT-PCR反应条件：在荧光定量PCR仪上执行以下反应程序：95℃，3分钟；45个循环的95℃，15秒-60℃，30秒。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

1.提升检测速度、降低对贵重仪器的依赖。应用本专利申请技术，将新型冠状病毒变种鉴定速度从4-6小时缩短至2小时，且本技术方法不依赖于昂贵的测序仪，仅需普通荧光定量PCR仪即可完成，降低了对测序仪等贵重仪器的依赖，使得病毒检测用户在本单位内部即可完成病毒变种鉴定，省去了样本转运等时间，并最大程度降低了不可控因素；

2.提升检测灵敏度。基于TaqMan探针法qRT-PCR检测病毒核酸变异，检测灵敏度可达1-10拷贝/微升，qRT-PCR有扩增信号即可实现病毒核酸变异的检测，避免了弱扩增信号对基于基因测序的核酸变异检测的影响。

3.降低检测成本，提升检测通量。本技术全部实验过程仅包括病毒核酸提取和qRT-PCR两步，实验步骤少，所需物资和人力成本大幅降低，且可通过96孔或384孔反应板，方便实现样品的高通量。

4.操作污染几率小，易于高通量操作。现有一代测序技术检测病毒变异需病毒RNA提取、RT-PCR扩增、PCR产物纯化、上机测序等多个步骤，批量操作易引入操作污染，本方法仅有病毒RNA提取和qRT-PCR两步操作，步骤减少相应的操作污染几率也降低，较少的操作步骤易于实现一次检测大量样品。

附图说明

图1为本发明方法灵敏度实验结果图。

具体实施方式

实施例1

一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法，包括以下步骤：

步骤1，使用Trizol法提取新冠病毒RNA；

步骤2，基于ARMS的qRT-PCR引物探针设计：

步骤2.1，引物设计：按照引物设计通用原则，结合新型冠状病毒印度变种的变异位点附近核苷酸序列，对每个变异位点设计两对引物，其中上游引物3’端分别匹配变异和非变异点，即变异上游引物和非变异位上游引物，两对上游引物共用一个下游引物；

当需要鉴别的变异位点为L452R时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTATCG-3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：5’-GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT-3’，下游引物如SEQ ID NO.3所示：5’-GGAAACCATATGATTGTAAAGGAAAGTAAC-3’；

当需要鉴别的变异位点为T478K时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-TATCAGGCCGGTAGGAA-3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-TATCAGGCCGGTAGCAC-3’，下游引物如SEQ ID NO.6所示：5’-TTGCTGGTGCATGTAGAAGTTC-3’；

当需要鉴别的变异位点为P681R时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：5’-GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCACG-3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示：5’-GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCC-3’，下游引物如SEQ ID NO.9所示：5’-CAAGTGACATAGTGTAGGCAATG-3’；

步骤2.2，TaqMan探针设计：按照TaqMan探针设计通用原则，结合步骤1.1中上下游引物所限定病毒基因组区域序列特点设计TaqMan探针，每个变异位点的两对引物共用一条TaqMan探针；

当需要鉴别的变异位点为L452R时，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：5’-CTATCAGGCCGGTAGCACACCTTG-3’；

当需要鉴别的变异位点为T478K时，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示：5’-CCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACC-3’；

当需要鉴别的变异位点为P681R时，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：5’-CGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAG-3’；

步骤3，基于ARMS进行qRT-PCR实验：

步骤3.1，配制反应体系：每个反应体系体积为20μl，其中含2X反应液10μl，50μM上游引物0.2μl，50μM下游引物0.2μl，50μM TaqMan探针0.1μl，无菌无RNase水7.5μl，RNA模板2μl，每个变异位点的检测由两个反应体系构成，一个含变异上游引物，另一个含非变异下游引物，其他上述成分相同；

步骤3.2，qRT-PCR反应条件：在荧光定量PCR仪上执行以下反应程序：95℃，3分钟；45个循环的95℃，15秒-60℃，30秒。

步骤4，结果判读：

步骤4.1，变异引物体系的扩增曲线出现时间早于非变异引物体系2个循环以上，判定检测样品中发生变异；

步骤4.2，非变异引物体系的扩增曲线出现时间早于变异引物体系2个循环以上，判定检测样品中未发生变异。

实施例2

对本发明的方法做灵敏度实验(模板稀释度10

实施例3

重复性实验评价方法的精密度，是指同一标本在一定条件下多次重复测定得到一系列单次测定值之间的接近程度，是反应随机误差大小的指标，分为批内重复性实验、批间重复性实验(日内、日间重复性实验)、操作者/仪器间重复性实验等。

我们对本方法的重复性(精密度)进行了考察，以变异系数进行衡量，实验结果见表2。

表2.本方法的重复性(精密度)

变异系数的计算方法为：

变异系数(％)＝(Ct标准差/Ct平均值)×100％

由表2可知：L452R的批内实验变异系数范围为0.20％-1.25％，批间实验变异系数范围为0.66％-1.77％；

T478K的批内实验变异系数范围为0.26％-1.45％，批间实验变异系数范围为1.12％-2.77％；

P681R的批内实验变异系数范围为0.39％-1.84％，批间实验变异系数范围为0.74％-2.82％；

本方法各突变检测引物的批内实验变异系数均小于2％，批间实验变异系数均小于3％。因此本方法具备良好的重复性(精密度)。

实施例4

本方法的线性定量范围考察，线性与范围(linearity and range)分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的实验结果的能力，即与实验结果成线性关系的供试物浓度范围，是反应方法检测性能的重要指标。

我们对本方法的线性检测范围进行了考察，实验结果见表3。其中斜率可知，本方法各体系在模板10

表3.本方法的线性检测范围

序列表

SEQ ID NO.1：

GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTATCG

SEQ ID NO.2：

GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT

SEQ ID NO.3：

GGAAACCATATGATTGTAAAGGAAAGTAAC

SEQ ID NO.4：

TATCAGGCCGGTAGGAA

SEQ ID NO.5：

TATCAGGCCGGTAGCAC

SEQ ID NO.6：

TTGCTGGTGCATGTAGAAGTTC

SEQ ID NO.7：

GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCACG

SEQ ID NO.8：

GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCC

SEQ ID NO.9：

CAAGTGACATAGTGTAGGCAATG

SEQ ID NO.10：

CTATCAGGCCGGTAGCACACCTTG

SEQ ID NO.11：

CCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACC

SEQ ID NO.12：

CGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAG

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gattctaagg ttggtggtaa ttataattat cg 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gattctaagg ttggtggtaa ttataattac ct 32

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaaaccata tgattgtaaa ggaaagtaac 30

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatcaggccg gtaggaa 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatcaggccg gtagcac 17

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgctggtgc atgtagaagt tc 22

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctagttatc agactcagac taattcacg 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctagttatc agactcagac taattctcc 29

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagtgacat agtgtaggca atg 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctatcaggcc ggtagcacac cttg 24

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccaacccact aatggtgttg gttaccaacc 30

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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