一种利用甘草粉末粒度分布进行品质评价的方法

摘要

本发明公开了一种利用甘草粉末粒度分布进行品质评价的方法。本发明通过粒度分析仪对甘草粉末的粒度分布进行测定，对粒度分布特性与甘草有效成分含量的相关性进行探讨。结果表明甘草粉末粒度分布与甘草有效成分含量之间存在显著相关性，由此可推测，甘草粉末粒度在50‑200um和500‑1000um范围内分布，表征了甘草粉性的强弱，与甘草质量直接相关。50‑200um范围内分布越少，500‑1000um范围内分布越多，同时在更高的粒度范围内分布越多，甘草质量可能越好。采用粒度分析仪检测甘草粉末粒度分布，以此表征甘草“粉性”特征，具有一定的可行性，为规范中药材质量评价体系提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用甘草粉末粒度分布进行品质评价的方法。

背景技术

甘草始载于《神农本草经》，列为上品，为豆科多年生植物甘草Glycyrrhizauralensis Fisch.、胀果甘草G.inflata Bat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根和根茎

自古以来甘草以粉性为佳

早期对中药质量优劣的评价主要是通过传统的性状鉴别，以药材的外在性状来表征内在的质量优劣，即“辨状论质”

发明内容

本发明的目的是提供一种利用甘草粉末粒度分布进行品质评价的方法。

本发明提供的利用甘草粉末粒度分布进行品质评价的方法，包括：

1)用粒度分析仪测得待测甘草根及根茎粉末的粒度分布；

2)所述品质评价以所述待测甘草粉末中甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙 元-7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷的含量为标准；

根据步骤1)所得粒度分布，若所述待测甘草粉末的粒度在50-200um(包括区间 端点值)范围内分布越少，则说明所述待测甘草粉末中甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、 甘草甙元-7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷含量越高，品质越好；

若所述待测甘草粉末的粒度在500-1000μm(包括区间端点值)及大于1000μm范 围内分布越多，则说明所述待测甘草粉末中甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元 -7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷含量越高，品质越好。

上述方法所述步骤1)中，所述用粒度分析仪测得甘草粉末粒度分布的方法为常规方法，具体步骤可包括：

a、将甘草样品干燥，粉碎，过24目筛；

b、按照仪器默认的土壤设定参数，蓝光折射率设为1.336，残差均小于0.5％，遮光度范围1.5％～4.5％，将烧杯中加满蒸馏水，超声3分钟，将待测甘草粉末加入到测 量烧杯中稀释至质量百分浓度为7％～15％，待溶液稳定且没有粉末沉淀时，边超声边 进样测量。

所用待测甘草根及根茎具体可为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch干燥根 及根茎。

另外，本发明还要求保护甘草粉末粒度分布在对甘草进行品质评价中的应用；具体的，所述品质评价以所述待测甘草粉末中甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元 -7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷的含量为标准；

根据所得待测甘草粉末粒度分布，若所述待测甘草粉末的粒度在50-200um(包 括区间端点值)范围内分布越少，则说明所述待测甘草粉末中甘草酸、甘草皂苷G2、 甘草苷、甘草甙元-7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷含量越高，品质越好；

若所述待测甘草粉末的粒度在500-1000μm(包括区间端点值)及大于1000μm范 围内分布越多，则说明所述待测甘草粉末中甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元 -7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷含量越高，品质越好

本发明以甘草为研究材料，建立了甘草粉末粒度分析的方法。利用甘草粉末粒度分布来表征甘草的粉性强弱，同时以甘草酸和甘草苷类化合物的含量来表征不同产地 甘草的品质优劣，通过分析甘草粉末粒度分布与甘草有效成分含量之间的相关性，为 快速、准确评价甘草品质提供理论指导，同时也为粒度分析仪在中药领域的应用提供 借鉴。

附图说明

图1为甘草粉末粒度分布测试结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获 得。

实施例1

1 材料

1.1 试验材料

试验样品为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch干燥根及根茎。样品收集于 新疆、内蒙古、甘肃，3个省区21个产地(县/市)药材收购商/合作社，共48份，包 括13个一等(编号01)、21个二等(编号02)、14三等(编号03)。具体信息见表1。

表1甘草样品信息汇总表

1.2试剂

1.2.1对照品

22β-Acetoxyl-glycyrrhizin(1、22β-乙酰氧基-甘草酸CAS：938042-17-2)，licorice- saponin G2(2、甘草皂苷G2，CAS：118441-84-2)，glycyrrhizin(3、甘草酸或称乌 拉尔甘草皂苷A，CAS：103000-77-7)，4、甘草甙元-7,4'-二葡萄糖甙CAS：93446-18- 5)、glucoliguiritin apioside(5、甘草甙元-7-葡萄糖4'-芹糖甙CAS：157226-47-6)、vicenin(6、维采宁CAS：23666-13-9)、liquiritin(7、甘草苷CAS：551-15-5)、glycyroside (8、黄甘草苷CAS：125310-04-5)、ononin(9、芒柄花苷CAS：486-62-4)、isoliquiritin apioside(10、芹糖异甘草苷CAS：120926-46-7)、isoliquiritin(11、异甘草苷CAS:5041- 81-6)。5、6、9、10、11对照品购自上海贝吉斯生物科技有限公司；1、2、4武汉中标 科技有限公司；3、7、8对照品购自上海源叶生物有限公司。

1.2.2其他试剂

乙醇、甲醇、乙腈均为色谱纯；水为实验室自制超纯水。

1.3仪器

Mastersizer 2000激光衍射粒度分析仪，超声搅拌器，ACQUITY UPLCTM H- CLASS系统(美国Waters公司)；电子天平(梅特勒-托利多公司)；超纯水系统(赛 默飞世尔科技有限公司)；SB-800DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限 公司)。

2 方法

2.1 样品处理

每份样品随机取30根干燥甘草药材粉碎，过2号筛(24目)。

2.1甘草粉末粒度检测

按照仪器默认的土壤设定参数，蓝光折射率设为1.336，残差均小于0.5％，遮光度范围1.5％～4.5％。将烧杯中加满蒸馏水，超声3分钟，排除仪器气泡，防止影响测 量结果，将甘草粉末加入到测量烧杯中稀释至粒度仪测量所需的浓度(7％～15％)，待 溶液稳定且没有粉末沉淀时，边超声边进样测量。

2.2有效成分含量测定

2.2.1甘草酸类3种皂苷类化合物(代号1-3)的检测方法

样品提取：取约200mg甘草粉末于10ml 50％甲醇，超声提取(25℃，30min)。

液相条件：色谱仪H-Class UPLC system；色谱柱Acquity UPLC HSS T3 column(150×2.1mm I.D.,1.8μm)；预柱VanGuard precolumn(5×2.1mm I.D.,1.8μm)。流 动相：乙腈-甲醇(4:1，v/v，A)和0.1％甲酸水(v/v，B)。洗脱梯度：0–1min，30％ A；1–8min，30–40％A；8–16min，40–52％A；16.2–17.6min，100％A。流速0.40 mL/min，柱温55℃，进样量1uL，样品盘温度15℃，全波长扫描190-600nm，定量 分析检测波长254nm。

拟指认成分：22β-Acetoxyl-glycyrrhizin(1、22β-乙酰氧基-甘草酸CAS：938042-17-2)，licorice-saponin G2(2、甘草皂苷G2，CAS：118441-84-2)，glycyrrhizin(3、 甘草酸或称乌拉尔甘草皂苷A，CAS：103000-77-7)。

对照品：1和2溶于50％甲醇，3溶于75％甲醇，配制浓度为5mg/mL的储存液。 用50％的甲醇将其稀释到使用浓度，1和2为0.5mg/mL，3为2.5mg/mL。然后用50％ 的甲醇按照1，1.25，2.5，5，10，20，40，80和160的稀释因子进行稀释，以峰面积 为y，各个化合物质量(g)为x，获得标准曲线。

2.2.2甘草苷类8种黄酮苷类化合物(代号4-11)的检测方法

样品提取：取约200mg甘草粉末于10ml 50％甲醇，超声提取(25℃，30min)。

液相条件：色谱仪H-Class UPLC system；色谱柱Acquity UPLC HSS T3 column(150×2.1mm I.D.,1.8μm)；预柱VanGuard precolumn(5×2.1mm I.D.,1.8μm)。流动 相：乙腈(A)和0.1％甲酸水(v/v，B)。洗脱梯度：0min，10％A；1min，15％A； 6min，25％A；8.5min，30％A；10min，32％A。流速0.30mL/min，柱温50℃，样 品盘温度15℃，进样量1uL，全波长扫描190-600nm,检测波长365nm(化合物10和 11)、270nm(化合物4-9)。

拟指认成分：liquiritigenin-7,4'-diglucoside(4、甘草甙元-7,4'-二葡萄糖甙CAS： 93446-18-5)、glucoliguiritin apioside(5、甘草甙元-7-葡萄糖4'-芹糖甙CAS：157226- 47-6)、vicenin(6、维采宁CAS：23666-13-9)、liquiritin(7、甘草苷CAS：551-15-5)、 glycyroside(8、黄甘草苷CAS：125310-04-5)、ononin(9、芒柄花苷CAS：486-62-4)、isoliquiritin apioside(10、芹糖异甘草苷CAS：120926-46-7)、isoliquiritin(11、异甘草 苷CAS:5041-81-6)。

对照品：4-11均溶于50％甲醇中配制浓度为3mg/mL的存储液，用50％的甲醇分 别将他们稀释到使用浓度4，5，6，8为0.18mg/mL，7，9，10，11为0.42mg/mL。 然后用50％的甲醇按照1，1.25，2.5，5，10，20，40，80和160的稀释因子进行稀 释，以峰面积为y，各个化合物质量(g)为x，获得标准曲线。

3结果与分析

3.1甘草粉末粒度检测结果

检测结果如2所示，可以计算出粉末样品中粒度在，0.01-2um，2-20um，20-50 um，50-100um，100-200um，200-250um，250-500um，500-1000um，1000-2000um 范围内的体积百分数，即粉末样品的粒度分布。以此来表征甘草样品粉性的强弱。甘 草粉末样品中，小粒度直径范围体积越大，大粒度直径范围体积越小，说明粉性越强。

表2甘草粉末粒度分布表(体积百分比％)

40份甘草粉末样品的粒度分布在2-20 um，20-50 um，50-100 um，100-200 um，250-500 um，500-1000 um几个区段内的粒子分布体积比较大(均值大于10％)，且在 40个样品当中2-20 um，50-100 um，100-200 um，500-1000 um几个区段内的粒子分 布体积的波动比较大(波动大于10％)。见表2。

这些甘草粉末样品在这些区段的分布可能与甘草的品质有关联。

3.2有效成分含量测定结果

3.2.1标准曲线结果

各化合物(甘草酸、22-β-乙酰氧基-甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元-7,4'-二葡萄糖甙、维采宁、芒柄花苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、黄甘草苷) 线性关系良好，见表3。

表3甘草各化合物标准曲线的回归方程

3.2.2有效成分含量

2020版《中国药典》规定，甘草中甘草酸含量不得低于2％、甘草苷含量不得低 于0.5％，根据测量值，此40批甘草中甘草酸不合格率32.5％，甘草苷不合格率35％。 甘草酸不合格的产地主要集中在新疆，包括新疆29团、30团、和硕、精河、轮南和伊 犁等地的部分样品，并与等级无明显相关。甘草苷不合格的产地也主要集中在新疆， 尤其以新疆29团、30团、轮南、精河、伊犁比较严重。

诸多产地中甘肃榆中的一等甘草质量最佳，其甘草酸含量最高达4.68％、甘草苷含量最高达5.14％，在测定的成分中22-β乙酰氧基-甘草酸、甘草甙元-7,4'-二葡萄糖 甙均为峰值，且甘草皂苷G2含量为0.4560％仅次于内蒙古乌拉特前旗GC07-01样品(0.4681％)。见表4。

表4甘草中甘草酸及甘草苷类化合物含量(％)

3.3甘草酸及甘草苷类化合物与甘草粉末粒度的相关性

表5甘草粒度分布与化学成分的相关性分析

由表5可知，甘草粒度分布与有效成分的含量具有显著相关性。在甘草粒度分布在50-100um范围内，粒子分布数越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元- 7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷的含量越低；在100-200um范围内和在200-250 um范围内，粒子分布越多，同样甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元-7,4'-二葡 萄糖甙、维采宁和异甘草苷的含量越低；与此同时，在100-200um范围内，粒子分布 越多，22-β乙酰氧基-甘草酸的含量越高；但是在500-1000um范围内，粒子分布越多， 甘草苷及异甘草苷的含量越高；到1000-2000um范围时，粒子分布越多，甘草酸、甘 草皂苷G2、甘草苷、维采宁和异甘草苷的含量均越高，仅22-β乙酰氧基-甘草酸的含 量越低。

说明甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草甙元-7,4'-二葡萄糖甙、维采宁和异甘草苷含量与50-250um范围内的粒子分布呈负相关，而与1000-2000um范围内分布的粒 子呈正相关；甘草苷及异甘草苷的含量与500-1000um范围内分布的粒子呈正相关。 根据前面1.3.3的结果已知，40份甘草粉末样品的粒度分布在2-20um，20-50um，50- 100um，100-200um，250-500um，500-1000um几个区段内的粒子分布体积比较大(均 值大于10％)。由此可推测，甘草粉末粒度在50-200um和500-1000um范围内分布， 表征了甘草粉性的强弱，与甘草质量直接相关。50-200um范围内分布越少，500-1000 um范围内分布越多，同时在更高的粒度范围内分布越多，甘草质量可能越好。

4讨论

甘草以大而紧实、富粉性的粉草为最优，“粉性”对甘草质量的鉴别至关重要，但是如何科学的客观的量化甘草的“粉性”是一个难题。中药材粒度相关的研究主要集中 在药材的粒度分布影响中药材有效成分的溶出，进而影响中药制剂的质量等方面。由 于中药材中的活性成分在药材不同组织中的量存在差异，而药材组织结构的差异会导 致其颗粒学性质不完全相同。如某些易碎组织在粉碎过程中易于形成小颗粒，而一些 不易粉碎的组织则在大颗粒粉末中较多，会导致药材活性成分在不同粒径粉末中分布 不均匀，使得相关中药制剂批次内的均一性较差。此外，研究表明改变中药材的粒度 可促进其有效成分的溶出释放、减少用药量、提高生物利用度。有研究表明甘草苷和 甘草酸的含量随粒径减小而增大，2种成分的含量在300～900μm、105～300μm及小 于105μm这3种粒径间波动比较平稳，且粒径105～150μm样品有效成分有良好的 体外释放度

本研究以甘草为例，引入粒度分析仪，确定了甘草粉末粒度分布测量方法，测量结果准确、可靠，适用于将中药材“粉性”鉴别指标客观化、量化。通过分析甘草粉末 粒度分布与有效成分含量之间的相关性，发现甘草粉末粒度分布与有效成分的含量具 有显著相关性，将粒度分布同中药材品质相关联，提供客观的数据支持，为现代中药 鉴定数字化发展提供了新方法、新思路。