百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂用途

摘要

本发明公开了百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂用途。本发明提供了百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物的应用：在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。本发明提供了百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒抗病毒药物的新用途，实现了老药新用的新思路。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂用途。

背景技术

新型冠状病毒，是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与重症急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β-冠状病毒，具有较高的传染性和一定的致死率。新型冠状病毒，世界卫生组织称其为2019-nCoV，世界病毒分类委员会称其为SARS-CoV-2。

COVID-19大流行是21世纪以来人类面临的最大全球公共卫生危机，但目前仍无安全有效的药物应用于临床治疗。所以急需筛选出具有明显抗新冠病毒的药物，药物研发面临的主要挑战包括：

(1)目前的新冠相关的文献报导中，大多以综述或基于数据库的理论分析，在中医药方面体现的更为明显，这些说法只能说在理论上提供了一些参考数据，但实际上却没有确切证据证明药物可改善病毒清除率；

(2)现有的新冠相关的文献报导中，大部分都是参考药物对β冠状病毒属SARS-CoV和MERS-Cov的相关研究，虽然COVID-19也属于β冠状病毒，但序列分析显示,2019-nCoV与SARS-CoV的核苷酸同源性为79.0％,与MERS-CoV的同源性为51.8％,也明显看出COVID-19与二者在序列方面就有所不同，故药物研发上应逐一研究，不能一概而论；

(3)缺乏新药，故大多科研文章会主张使用老药新用或是多联合策略，但同时未在临床试验中显示出明显优势，没有确切证据证明哪种药物真正有效。

发明内容

本发明的目的是提供百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂用途。

本发明提供了百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物的应用；所述应用为以下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)：

(a1)百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；

(a2)百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；

(a3)百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；

(a4)百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；

(a5)百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种药物，其活性成分包括百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物；

所述药物的功能为以下(b1)和/或(b2)和/或(b3)和/或(b4)：

(b1)治疗新型冠状病毒所致疾病；

(b2)治疗新型冠状病毒感染；

(b3)预防新型冠状病毒所致疾病；

(b4)预防新型冠状病毒感染。

本发明还提供了一种新型冠状病毒抑制剂，其活性成分包括百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物。

以上任一所述百蕊草提取物为以百蕊草为原料采用有机试剂提取得到的。

以上任一所述百蕊草提取物为以百蕊草为原料采用有机试剂提取出来的物质。

所述有机试剂可为醇或醇溶液。

所述醇具体可为乙醇。

所述醇溶液具体可为乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为乙醇浓度大于50％(体积比)小于100％(体积比)的乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为50％-99％(体积比)乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为70％-95％(体积比)乙醇水溶液。

以上任一所述百蕊草提取物具体可为以下任一所述方法甲制备得到的。

本发明还提供了一种百蕊草提取物的制备方法(方法甲)，包括如下步骤：以百蕊草为原料采用有机试剂进行提取。

所述有机试剂可为醇或醇溶液。

所述醇具体可为乙醇。

所述醇溶液具体可为乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为乙醇浓度大于50％(体积比)小于100％(体积比)的乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为50％-99％(体积比)乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为70％-95％(体积比)乙醇水溶液。

具体的，所述方法甲包括如下步骤：取百蕊草，采用有机试剂进行单次提取，然后过滤并收集滤液。

具体的，所述方法甲包括如下步骤：取百蕊草，采用有机试剂进行多次提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。所述多次提取中，从第二次提取开始，以前一次提取的滤渣为原料进行提取。所述多次具体可为2-6次，例如4次。

具体的，所述方法甲包括如下步骤：取百蕊草，依次采用95％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液和70％乙醇水溶液进行提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。

所述提取中，百蕊草和每次提取的有机试剂的配比可为2300g：5-50L。

所述提取中，百蕊草和每次提取的有机试剂的配比可为2300g：10-30L。

所述提取中，百蕊草和每次提取的有机试剂的配比可为2300g：18-20L。

所述方法甲中，所述百蕊草的量以干重计。

每次提取的条件具体可为：浸泡，然后超声提取。

具体的，浸泡的时间可为2-20h。

具体的，浸泡的时间可为2-15h。

具体的，浸泡的时间可为2-12h。

所述浸泡具体可为20-25℃浸泡。

具体的，超声提取的时间可为1-5h。

具体的，超声提取的时间可为2-4h。

具体的，超声提取的时间可为3h。

所述超声提取具体可为40-60℃超声提取。

所述超声提取具体可为50℃超声提取。

所述超声提取的参数具体可为500W，40KHZ。

所述过滤的孔径具体可为120mm。

所述方法甲还可包括如下步骤：将滤液依次进行浓缩和干燥，获得产物。

所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：50-60℃。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55℃。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。

所述干燥具体可为冷冻干燥。

示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

示例性的，所述方法甲包括如下步骤：

(1)取百蕊草2300g，切碎，加入95％乙醇溶液20L，室温浸泡12h，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(2)取步骤(1)得到的滤渣，加入85％乙醇溶液18L，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(3)取步骤(2)得到的滤渣，加入75％乙醇溶液18L，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(4)取步骤(3)得到的滤渣，加入70％乙醇溶液18L，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液；

(5)将步骤(1)得到的滤液、步骤(2)得到的滤液、步骤(3)得到的滤液和步骤(4)得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪浓缩。

所述方法甲还包括如下步骤：(6)取步骤(5)得到的浓缩液，-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

所述方法甲制备得到的百蕊草提取物也属于本发明的保护范围。

以上任一所述百蕊草萃取物为以所述百蕊草提取物为原料进行萃取得到的。

以上任一所述百蕊草萃取物为以所述百蕊草提取物为原料萃取出来的物质。

所述百蕊草萃取物可为石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物或正丁醇萃取物。

所述石油醚萃取物为以所述百蕊草提取物为原料采用石油醚进行萃取得到的。

所述石油醚具体可为60～90℃沸腾规格的石油醚。

所述乙酸乙酯萃取物为以完成石油醚萃取后的水相为原料，采用乙酸乙酯进行萃取得到的。完成石油醚萃取后的水相即以所述百蕊草提取物为原料采用石油醚进行萃取后剩余的水相。

所述正丁醇萃取物为以完成乙酸乙酯萃取后的水相为原料，采用正丁醇进行萃取得到的。完成乙酸乙酯萃取后的水相即以完成石油醚萃取后的水相为原料采用乙酸乙酯进行萃取后剩余的水相。完成石油醚萃取后的水相即以所述百蕊草提取物为原料采用石油醚进行萃取后剩余的水相。

本发明还提供了一种百蕊草萃取物的制备方法，包括如下步骤：以所述百蕊草提取物为原料进行萃取。

所述百蕊草萃取物为石油醚萃取物时，所述方法(方法乙)包括如下步骤：以所述百蕊草提取物为原料采用石油醚进行萃取，收集有机相。

所述石油醚具体可为60～90℃沸腾规格的石油醚。

所述方法乙还包括如下步骤：取有机相，进行旋转蒸发至所有溶剂全部蒸出。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：50-60℃。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55℃。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。

所述方法乙制备得到的石油醚萃取物也属于本发明的保护范围。

所述百蕊草萃取物为乙酸乙酯萃取物时，所述方法(方法丙)包括如下步骤：以完成石油醚萃取后的水相(即完成方法乙剩余的水相)为原料采用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相。

所述方法丙还包括如下步骤：取有机相，依次进行浓缩和干燥，获得产物。

所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：50-60℃。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55℃。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。

所述干燥具体可为冷冻干燥。

示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

所述方法丙制备得到的乙酸乙酯萃取物也属于本发明的保护范围。

所述百蕊草萃取物为正丁醇萃取物时，所述方法(方法丁)包括如下步骤：以完成乙酸乙酯萃取后的水相(即完成方法丙剩余的水相)为原料采用正丁醇进行萃取，收集有机相。

所述方法丙还包括如下步骤：取有机相，依次进行浓缩和干燥，获得产物。

所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：50-60℃。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55℃。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。

所述干燥具体可为冷冻干燥。

示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

所述方法丁制备得到的正丁醇萃取物也属于本发明的保护范围。

本发明还保护百蕊草在制备所述百蕊草提取物中的应用。

本发明还保护百蕊草在制备所述百蕊草萃取物中的应用。

以上任一所述百蕊草(作为原料的百蕊草)可为可为购买的中药百蕊草。

以上任一所述百蕊草(作为原料的百蕊草)可为采集并干燥后的百蕊草全草。

以上任一所述百蕊草(作为原料的百蕊草)可为新鲜采集的百蕊草全草。

百蕊草(学名：Thesium chinense Turcz.)是檀香科、百蕊草属植物。分布于中国、日本和朝鲜。在中国大部省区均产。生长于荫蔽湿润或潮湿的小溪边、田野、草甸，也见于草甸和砂漠地带边缘、干草原与栎树林的石砾坡地上。

中药百蕊草，为百蕊草的全草。春、夏采收，晒干。

本发明的发明人制备了百蕊草提取物并检测了其细胞毒性以及其对于新型冠状病毒的抗病毒效果。结果表明，百蕊草提取物的细胞毒性较弱(对Vero细胞的IC50值为849.441μg/mL)同时抗病毒效果非常显著(640μg/mL药物浓度)。发明人开展进一步的研究，以百蕊草提取物为原料制备了石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，均具有较好抗新冠病毒效果，且细胞毒性相对较弱。本发明提供了百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒抗病毒药物的新用途，实现了老药新用的新思路。

附图说明

图1为不同浓度BS-1、BY-2、BZ-3、BS-4、BDT对Vero细胞的抑制率。

图2为不同浓度的BRY对Vero细胞的抑制率。

图3为不同浓度的RD-1对Vero细胞的抑制率。

图4为不同浓度的LH-2、JH-3对Vero细胞的抑制率。

图5为不同浓度的RD-1对病毒RNA拷贝数的影响。

图6为不同浓度的LH-2对病毒RNA拷贝数的影响。

图7为不同浓度的JH-3对病毒RNA拷贝数的影响。

图8为不同浓度的BS-1对病毒RNA拷贝数的影响。

图9为不同浓度的BY-2对病毒RNA拷贝数的影响。

图10为不同浓度的BZ-3对病毒RNA拷贝数的影响。

图11为不同浓度的BS-4对病毒RNA拷贝数的影响。

图12为不同浓度的BDT对病毒RNA拷贝数的影响。

图13为不同浓度的BRY对病毒RNA拷贝数的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中采用的酶标仪为荷兰雷勃MK3酶标仪。实施例中用于荧光定量PCR的为ABI QuantStudio5 Q5实时荧光定量PCR仪。实施例中的乙醇溶液均指的是乙醇水溶液，其中的％代表体积百分含量。实施例中的双抗均指的是青霉素和链霉素。如无特殊说明，实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。室温的含义：20-25℃。如无特殊说明，实施例中提及的培养基均为含10％胎牛血清和2％双抗的DMEM培养基。如无特殊说明，实施例中的细胞培养条件均为：37℃，5％CO

Vero细胞：非洲绿猴肾细胞，是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的一种细胞系。实施例中所用的新型冠状病毒均为COVID-19(SZ005)，是安徽省疾病预防控制中心实验室从病人分离出的毒株，记载于如下文献：Low dose of emetine as potentialantiSARS-CoV-2virus therapy:preclinical in vitro inhibition and in vivopharmacokinetic evidences；Wang et al.Molecular Biomedicine(2020)1:14。实施例中所用的百蕊草为市售中药(干燥的百蕊草全草)(计量重量为干重)，产地为湖北襄阳。

瑞德西韦(Remdesivir，用RD-1表示)：上海源叶生物科技有限公司,C20A11L121820。连花清瘟颗粒(用LH-2表示)：北京以岭药业有限公司，2012077。金花清感颗粒(用JH-3表示)：聚协昌(北京)药业有限公司，20200910。

实施例1、百蕊草提取物的制备

一、百蕊草乙醇提取物的制备

1、取百蕊草2300g，切碎，加入95％乙醇溶液20L，室温浸泡12h，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

2、取步骤1得到的滤渣，加入85％乙醇溶液18L，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

3、取步骤2得到的滤渣，加入75％乙醇溶液18L，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

4、取步骤3得到的滤渣，加入70％乙醇溶液18L，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

5、将步骤1得到的滤液、步骤2得到的滤液、步骤3得到的滤液和步骤4得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪(负压、55℃、55rpm)浓缩，得到1.8L浓缩液。

6、取1L步骤5得到的浓缩液，置于-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到产物357.52g，即为百蕊草乙醇提取物，用BRY表示。

二、各个萃取物以及剩余物的制备

1、取250mL步骤一的5得到的浓缩液，加250mL水并混匀，然后用石油醚萃取4次。每次萃取的步骤均为：加入500mL石油醚，25℃萃取30min，然后收集有机相。将4次萃取收集的有机相合并，用旋转蒸发仪进行旋转蒸发(负压、55℃、55rpm)至所有溶剂全部蒸出，得到浸膏状产物11.8g，即为石油醚萃取物，用BS-1表示。

2、完成步骤1后，取剩余水相(约500mL)，用乙酸乙酯萃取4次。每次萃取的步骤均为：加入500mL乙酸乙酯，25℃萃取30min，然后收集有机相。将4次萃取收集的有机相合并，用旋转蒸发仪(负压、55℃、55rpm)浓缩至约100mL，然后收集浓缩液并置于-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到粉末状产物5.13g，即为乙酸乙酯萃取物，用BY-2表示。

3、完成步骤2后，取剩余水相(约500mL)，用正丁醇萃取3次。每次萃取的步骤均为：加入500mL正丁醇，25℃萃取30min，然后收集有机相。将3次萃取收集的有机相合并，用旋转蒸发仪(负压、55℃、55rpm)浓缩至约50mL，然后收集浓缩液并置于-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到粉末状产物13.19g，即为正丁醇萃取物，用BZ-3表示。

4、完成步骤3后，剩余的水相(约500mL)，用旋转蒸发仪进行旋转蒸发(负压、55℃、55rpm)至所有溶剂全部蒸出，得到浸膏状产物39.18g，即为萃取后的水相剩余物，用BS-4表示。

三、百蕊草水提物的制备

1、取步骤一的4得到的滤渣，加蒸馏水18L并混匀，室温浸泡3h，然后60℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣；

2、取步骤1得到的滤渣，加蒸馏水18L并混匀，室温浸泡1h，然后60℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

3、取步骤2得到的滤渣，加蒸馏水18L并混匀，室温浸泡1h，然后60℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，收集滤液。

4、将步骤1得到的滤液、步骤2得到的滤液和步骤3得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪(负压、55℃、55rpm)浓缩至约280mL，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到粉末状产物89.14g，即为百蕊草水提物，用BDT表示。

实施例2、百蕊草提取物对新型冠状病毒的抑制作用

一、细胞毒性试验

(一)样本液的制备

取80mg实施例1制备的BS-1，溶解于500μl DMSO，得到BS-1母液(BS-1浓度为160mg/mL)。取BS-1母液，用培养基稀释，得到各个浓度的BS-1样本液。

取80mg实施例1制备的BY-2，溶解于500μl DMSO，得到BY-2母液(BY-2浓度为160mg/mL)。取BY-2母液，用培养基稀释，得到各个浓度的BY-2样本液。

取80mg实施例1制备的BZ-3，溶解于500μl DMSO，得到BZ-3母液(BZ-3浓度为160mg/mL)。取BZ-3母液，用培养基稀释，得到各个浓度的BZ-3样本液。

取80mg实施例1制备的BS-4，溶解于500μl DMSO，得到BS-4母液(BS-4浓度为160mg/mL)。取BS-4母液，用培养基稀释，得到各个浓度的BS-4样本液。

取80mg实施例1制备的BRY，溶解于500μl DMSO，得到BRY母液(BRY浓度为160mg/mL)。取BRY母液，用培养基稀释，得到各个浓度的BRY样本液。

取80mg实施例1制备的BDT，溶解于500μl双蒸水，得到BDT母液(BDT浓度为160mg/mL)。取BDT母液，用培养基稀释，得到各个浓度的BDT样本液。

取1mg RD-1，溶解于1000μl DMSO，得到RD-1母液(RD-1浓度为1mg/mL)。取RD-1母液，用培养基稀释，得到各个浓度的RD-1样本液。

取20mg LH-2，溶解于1000μl双蒸水，得到LH-2母液(LH-2浓度为20mg/mL)。取LH-2母液，用培养基稀释，得到各个浓度的LH-2样本液。

取20mg JH-3，溶解于1000μl双蒸水，得到JH-3母液(JH-3浓度为20mg/mL)。取JH-3母液，用培养基稀释，得到各个浓度的JH-3样本液。

(二)细胞毒性试验

1、取96孔板，接种Vero细胞(5.0×10

2、完成步骤1后，吸弃上清，用1×PBS缓冲液冲洗2次，加入样本液(100μl/孔)，培养24小时。

样本液分别为步骤(一)制备的各个样本液。每种样本液设置3个平行处理。

3、完成步骤2后，吸弃上清，用1×PBS缓冲液冲洗2次，然后加入培养基(80μl/孔)和5mg/mL的MTT水溶液(20μl/孔)，培养4h。

4、完成步骤3后，吸弃上清，加入DMSO(100μl/孔)，均匀振荡以使结晶物充分融解，然后采用酶标仪在570nm波长下,测定并记录各孔光吸收值。

设置空白孔：即步骤1中不加入Vero细胞，步骤2中用等体积培养基代替样本液，其他步骤同上。

设置对照孔：即步骤2中用等体积培养基代替样本液，其他步骤同上。

计算半抑制浓度(IC50值)。

BS-1样本液、BY-2样本液、BZ-3样本液、BS-4样本液、BDT样本液的细胞抑制率结果见图1。BS-1、BY-2、BZ-3、BS-4、BDT的IC50值见表1。根据IC50值筛选出BS-1、BY-2、BZ-3、BS-4、BDT进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度，见表2。

BRY样品液的细胞抑制率结果见图2。BRY的IC50值为849.441μg/mL(见表1)。根据IC50值筛选出BRY进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度，见表2。

RD-1样本液的细胞抑制率结果见图3。RD-1的IC50值为40.865μg/mL。根据IC50值筛选出RD-1进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度，见表2。

LH-2样本液和JH-3样本液的细胞抑制率结果见图4。LH-2的IC50值为0.869mg/mL，JH-3的IC50值为0.782mg/mL。根据IC50值筛选出LH-2、JH-3进行抗病毒试验的七个合适药物浓度梯度，见表3。

表1 BS-1、BY-2、BZ-3、BS-4、BDT、BRY、RD-1的IC50值(μg·mL

表2 BS-1、BY-2、BZ-3、BS-4、BDT、BRY、RD-1的体外抗病毒试验药物浓度梯度

表3 LH-2、JH-3的体外抗病毒试验药物浓度梯度

二、药物的体外抗病毒试验

(一)样本液的制备

取40mg实施例1制备的BS-1，溶解于500μl DMSO，得到BS-1母液(BS-1浓度为80mg/mL)。

取10mg实施例1制备的BY-2，溶解于500μl DMSO，得到BY-2母液(BY-2浓度为20mg/mL)。

取20mg实施例1制备的BZ-3，溶解于500μl DMSO，得到BZ-3母液(BZ-3浓度为40mg/mL)。

取80mg实施例1制备的BS-4，溶解于500μl DMSO，得到BS-4母液(BS-4浓度为160mg/mL)。

取80mg实施例1制备的BRY，溶解于500μl DMSO，得到BRY母液(BRY浓度为160mg/mL)。

取80mg实施例1制备的BDT，溶解于500μl双蒸水，得到BDT母液(BDT浓度为160mg/mL)。

取1mg RD-1，溶解于1000μl DMSO，得到RD-1母液(RD-1浓度为1mg/mL)。

取20mg LH-2，溶解于1000μl双蒸水，得到LH-2母液(LH-2浓度为20mg/mL)。

取20mg JH-3，溶解于1000μl双蒸水，得到JH-3母液(JH-3浓度为20mg/mL)。

(二)药物的体外抗病毒试验

试验在安徽省疾病预防控制中心实验室进行。

1、取96孔板，接种Vero细胞，采用培养基培养至95％汇合度(此时细胞数量约为1.0×10

2、完成步骤1后，吸弃上清，用维持培养基洗涤2遍，然后每孔加入20μL病毒液，培养1.5h(培养过程中轻轻左右摇匀，保证病毒与细胞充分接触)。

病毒液的制备方法：将新型冠状病毒加至DMEM培养基中，得到TCID

3、完成步骤2后，吸弃上清，用维持培养基洗涤2遍，然后加入含供试物的维持培养基(100μl/孔)，培养48小时。含供试物的维持培养基是将步骤(一)中制备的母液和维持培养基混合得到的。供试物(即BS-1、BY-2、BZ-3、BS-4、BDT、BRY、RD-1、LH-2或JH-3)在培养体系中的浓度采用步骤一确定的各个浓度。每个浓度设置3个平行处理。设置用等体积维持培养基代替含供试物的维持培养基的孔，作为模型组。

4、完成步骤3后，每孔加入20μl TRIZOL，反复吹吸7-8次，充分混匀，先-80℃冷冻30min然后56℃融化30min，然后提取总RNA，即为RNA样本液。

5、采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测病毒核酸的拷贝数。

反应体系的组成(20μL)：RNA样本液5μL，引物探针混合液1μL、4×

上游引物N-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；

下游引物N-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；

探针N-P：5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3’。

反应程序见表4。

表4

供试物为RD-1时的拷贝数浓度结果见图5(Virus代表模型组)。药物浓度为6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。步骤一中已确定RD-1的IC50值为40.865μg/mL，故可以选择使用12.5μg/mL药物浓度作为其他供试物的阳性对照组。

供试物为LH-2时的拷贝数浓度结果见图6(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为1.5mg/mL和2mg/mL时，与模型组相比显著性差异极大。步骤一中已确定LH-2的IC50值为0.869mg/mL。

供试物为JH-3时的拷贝数浓度结果见图7(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为1mg/mL时，与模型组相比具有显著性差异。药物浓度为1.5mg/mL和2mg/mL时，与模型组相比显著性差异极大。步骤一中已确定JH-3的IC50值为0.782mg/mL。

供试物为BS-1时的拷贝数浓度结果见图8(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为160μg/mL和320μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数明显降低，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为80μg/mL时，与模型组相比具有显著性差异。药物浓度为160μg/mL和320μg/mL时，与模型组相比显著性差异极大。步骤一中已确定BS-1的IC50值为238.314μg/mL，因此160μg/mL药物浓度可供使用。

供试物为BY-2时的拷贝数浓度结果见图9(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在逐步降低，当药物浓度为40μg/mL和80μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数明显降低，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为5μg/mL时，与模型组相比具有显著性差异。药物浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL时，与模型组相比显著性差异极大。步骤一中已确定BY-2的IC50值为28.165μg/mL，因此5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL药物浓度可供使用。

供试物为BZ-3时的拷贝数浓度结果见图10(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在逐步降低，当药物浓度为80μg/mL和160μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数明显降低，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为20μg/mL时，与模型组相比具有显著性差异。药物浓度为40μg/mL、80μg/mL和160μg/mL时，与模型组相比显著性差异极大。步骤一中已确定BZ-3的IC50值为75.058μg/mL，因此5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL药物浓度可供使用。

供试物为BS-4时的拷贝数浓度结果见图11(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。所有的药物浓度Vero细胞中病毒核酸复制数均无明显变化。

供试物为BDT时的拷贝数浓度结果见图12(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。所有的药物浓度Vero细胞中病毒核酸复制数均无明显变化。

供试物为BRY时的拷贝数浓度结果见图13(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL和960μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为160μg/mL时，与模型组相比具有显著性差异。药物浓度为320μg/mL、640μg/mL和960μg/mL时，与模型组相比显著性差异极大。步骤一中已确定BRY的IC50值为849.441μg/mL，因此80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL和640μg/mL药物浓度可供使用。BRY的IC50值较大，同时却具有明显抑制病毒增殖的作用，故此提取物有较高的研究价值。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 安徽省森湶谷药业股份有限公司

安徽医科大学

<120> 百蕊草或百蕊草提取物或百蕊草萃取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂用途

<130> GNCYX211878

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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