去铁酮在抑制氨基糖苷类药物的耳毒性中的应用

摘要

本发明公开了去铁酮在抑制氨基糖苷类药物的耳毒性中的应用，属于药物性耳聋领域。本发明公开了去铁酮(DFP)在保护氨基糖苷类药物引起的听力损失中的应用。所述的DFP是唯一口服有活性的铁螯合剂，临床用于治疗地中海贫血中的输血性铁过载。本发明首先研究了氨基糖苷类药物损伤，类毛细胞HEI‑OC1以及体外培养耳蜗组织中线粒体自噬发生水平，并在体外培养耳蜗组织上探究DFP调节线粒体自噬对毛细胞的保护作用，最后研究DFP对氨基糖苷类药物引起小鼠听力损失的保护作用，为治疗药物性耳聋提供新思路，为临床帮助患者恢复和重建听觉功能提供新靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及药物性耳聋领域，具体涉及去铁酮在抑制氨基糖苷类药物的耳毒性中的应用。

背景技术

听力障碍是全世界流行最广的一种耳疾。世界卫生组织报告显示：2005年全球有2.78亿人患有听力损失，占全世界人口的4.6％，其中80％人群生活在中低收入国。耳聋患者人数居于我国残疾人口数量的第二位，随着人口老龄化、耳毒性药物滥用、噪声以及环境污染，耳聋及听力减退人群有逐年上升的趋势，耳聋已成为影响社会政治和经济的全球性健康问题，其中感音神经性聋约占耳聋患者的63％，耳蜗毛细胞损伤是造成感音神经性聋的主要原因之一。目前，临床上常用的助听器和人工耳蜗移植虽然在一定程度上改善了患者的听力，存在一定的局限性，不能从根本上解决问题，而且其效果完全依赖于毛细胞的数量和质量，因此找到毛细胞损伤的原因及损伤机制对防治感音神经性聋至关重要。氨基糖苷类药物引起的毛细胞损伤是药物性耳聋的主要因素，在氨基糖苷类药物广泛应用的时代背景下，寻找一种药物，可以用来挽救、缓解或者抑制耳毒性药物引起的听力损失，对感音神经性耳聋治疗具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了去铁酮在抑制氨基糖苷类药物的耳毒性中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种药物或者药物组合，包括：氨基糖苷类药物与去铁酮；所述去铁酮的结构式为：

进一步地，所述去铁酮作用于类毛细胞。

一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：步骤1：在类毛细胞系HEI-OC1中加入线粒体自噬诱导剂以及新霉素，观察新霉素处理后，细胞内线粒体自噬发生情况；

步骤2：取P3小鼠，解剖耳蜗，并取出基底膜进行培养。在体外培养的小鼠耳蜗中转染mt-mKeima腺相关病毒以指示线粒体自噬，观察新霉素处理后，毛细胞内线粒体自噬发生情况；

步骤3：体外培养小鼠耳蜗组织，先用不同浓度去铁酮处理48h，通过记录毛细胞存活情况，选择合适去铁酮浓度进行后续实验；

步骤4：对体外培养的耳蜗基底膜去铁酮预处理后，加入新霉素损伤毛细胞，通过对毛细胞进行TUNEL染色以及Myosin7a染色，记录毛细胞凋亡及存活情况，结果发现去铁酮预处理可以有效的保护毛细胞；

步骤5：选用C57BL/6小鼠测听后注射去铁酮以及kanamycin,对照组注射相同浓度的生理盐水，然后进行ABR听力脑干反应检测，发现去铁酮预处理后kanamycin造成的小鼠听力损伤有明显恢复，通过解剖耳蜗，Myosin7a染色可以看出，kanamycin诱导的毛细胞死亡数目减少。

上述的方法中虽然按照步骤进行排列，但并非所有步骤的顺序一定按照上述顺序，没有必然的前后关联关系的步骤可改变顺序或并行进行。

可选地，由于本体线粒体自噬水平难以观察到，因此利用线粒体自噬诱导剂损伤线粒体，在细胞系上构建线粒体自噬模型，并通过统计Parkin聚集，线粒体相关蛋白降解情况判断线粒体自噬。

可选地，体外培养的基底膜毛细胞中感染mt-mKeim腺相关病毒，该蛋白在线粒体处于中性环境中会发绿色荧光，在线粒体处于酸性环境时，会发红色荧光，因此可以被用来判断线粒体自噬发生情况；在新霉素损伤组织24小时后，通过荧光共聚焦显微镜拍摄，再统计毛细胞红色荧光和绿色荧光比例判断线粒体自噬发生水平。

可选地，体外实验，注射去铁酮后，通过小鼠听力脑干反应以及毛细胞染色判断去铁酮对氨基糖苷类药物造成的听力损伤的保护作用。

去铁酮在抑制氨基糖苷类药物的耳毒性中的应用。

本发明主要有以下优势：

1.揭示线粒体自噬对新霉素诱导的毛细胞损伤的作用。

2.阐明线粒体自噬对新霉素诱导的毛细胞损伤的机制。

3.调控线粒体自噬，获得抑制新霉素诱导毛细胞损伤的新方向。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1：在类毛细胞系HEI-OC1细胞系中，损伤的线粒体通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬清除。线粒体自噬诱导剂线粒体解偶联剂处理6小时和24小时，用于造模。绿色代表线粒体，红色是Parkin,HSP60/COXIV/TOM20线粒体的标记物，BafA1自噬抑制剂。比例尺＝10μm。

图2：新霉素损伤破坏Parkin的聚集及损伤线粒体的清除。新霉素处理24小时，绿色代表线粒体，红色是Parkin聚集,HSP60/COXIV/TOM20线粒体的标记物。Parkin的聚集及线粒体标记蛋白减少都能代表线粒体自噬水平；

图3：新霉素损伤破坏线粒体自噬水平。mt-mKeima是线粒体自噬荧光探针，将GFP-Parkin与mt-mKeima质粒转入HEI-OC-1细胞，新霉素处理6h和24h，并通过激光共聚焦显微镜技术活细胞观察细胞内mt-mKeima荧光变化；

图4：新霉素处理破坏线粒体自噬受体的识别。细胞中转染HA-Ub(泛素)、EGFP-Parkin、EGFP-OPTN、mCherry-LC3B，观察它们与TOM20共定位情况；

图5：新霉素抑制了线粒体自噬关键蛋白PINK1的活性；

图6：组织上，新霉素处理后，线粒体自噬变化Math1-EGFP小鼠耳蜗基底膜，感染Anc80L65-CAG-mNeonGreen-P2A-mt-mKeima，绿色为毛细胞，红色是线粒体进入溶酶体的毛细胞；

图7：组织培养中，DFP合适浓度筛选。图中选取的是不同浓度DFP处理体外培养的基底膜24h，毛细胞被标记为绿色；

图8：DFP增强体外培养组织中线粒体自噬，保护新霉素诱导的毛细胞死亡，毛细胞被标记为红色，绿色为凋亡细胞；

图9：体内实验，C57BL/6小鼠注射DFP和kanamycin，抑制氨基糖苷类引起的听力损失。图为小鼠听力检测与内耳毛细胞数量统计。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一些实例中，DFP(Deferiprone)指的是去铁酮，所用的DFP直接购于MCE公司，结构式可以是：

本发明的一些示例中，所述的氨基糖苷类药物可以是氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides)，是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。

首先，在类毛细胞HEI-OC1细胞中构建PINK1/Parkin介导的线粒体自噬模型。由于正常细胞内线粒体自噬比较难以观测到，首先在HEI-OC1细胞中，利用线粒体自噬诱导剂(CCCP，carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)处理成功表达Parkin的细胞诱导线粒体自噬的发生，线粒体自噬诱导剂处理6h后，用TOM20标记线粒体，免疫荧光和计数结果显示(图1A和1B)：Parkin聚集到线粒体上(60％左右)，24h后，免疫荧光图(图1A)可以看出，Parkin均匀地分布在细胞中，且有80％左右Parkin阳性细胞的线粒体被清除(图1D)，western blot结果显示线粒体相关蛋白的表达量降低(图1C和图1E)。以上结果表明，线粒体自噬诱导剂处理后，HEI-OC-1细胞中受损伤的线粒体被清除。为了判断受损线粒体是否通过自噬途径被清除，先用线粒体自噬诱导剂处理12h后，再用自噬抑制剂Bafilomycin A1处理12h后，免疫荧光结果(图1F)显示：自噬抑制剂处理后，Parkin仍然聚集在线粒体上，线粒体也没有被清除。Western blot结果表明，与线粒体自噬诱导剂单独处理相比，Bafilomycin A1和线粒体自噬诱导剂共同处理后，线粒体相关蛋白(TOM20/Hsp60/COX IV)的表达量是升高的(图1G\1H\1I\1J)。这些结果表明，线粒体自噬诱导剂处理后，HEI-OC-1细胞中受损伤的线粒体由自噬途径降解。上述结果表明，在HEI-OC-1细胞系中，线粒体自噬诱导剂处理，受损伤的线粒体可通过线粒体自噬被清除。

在建立线粒体自噬模型后，加入新霉素处理，用1mM新霉素处理成功表达Parkin的HEI-OC-1细胞后，免疫荧光和计数结果显示：新霉素单独处理24h，Parkin阳性细胞的细胞线粒体仍然存在，线粒体自噬诱导剂处理24h后，Parkin阳性细胞中大部分细胞的线粒体被清除(图2A和2B)。Western blot结果也显示：与线粒体自噬诱导剂处理组相比，线粒体自噬诱导剂和新霉素共同处理组，线粒体蛋白TOM20/Hsp60的表达有所升高(图2C和2D)。这些结果表明，新霉素处理后，受损线粒体的清除被抑制。为了进一步探究新霉素损伤对线粒体自噬的变化，利用线粒体自噬荧光探针mt-mKeima检测线粒体自噬水平，该探针中mKeima是一种稳定表达的、在酸性和中性条件下分别发射红色和绿色荧光的天然蛋白，通过连接一个线粒体靶向序列(mitochondria target sequence)构成一种融合基因mt-Keima，使其表达的Keima蛋白定位于线粒体基质，当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima蛋白的荧光信号由绿色转为红色，用来检测线粒体自噬水平。将GFP-Parkin与mt-mKeima质粒转入HEI-OC-1细胞，新霉素处理6h和24h，并通过激光共聚焦显微镜技术活细胞观察细胞内mt-mKeima荧光变化，处理6h后(图3A和3C)，对照组和新霉素单独处理组，mt-mKeima蛋白标记线粒体，可看出线粒体形态为丝状，且561nm激发波长几乎没有信号；线粒体自噬诱导剂组Parkin聚集，且线粒体(458nm)形态也变成短的点状，561nm激发波长出现较强信号，说明损伤线粒体开始已经进入溶酶体，但是，新霉素和线粒体自噬诱导剂共同处理后，线粒体形态虽然改变，但Parkin无聚集，损伤的线粒体也未进入溶酶体。24h后(图3B和3D)，线粒体自噬诱导剂组，线粒体大部分进入溶酶体，561nm激发波长信号很强，线粒体自噬诱导剂和新霉素处理组，线粒体仍然存在，且561nm激发波长信号依旧很弱。在组织水平研究了新霉素损伤对线粒体自噬的影响。此外，取出生后3天的Math1-EGFP小鼠，解剖出耳蜗进行组织培养，用Flag-Parkin以及mt-mKeima腺相关病毒感染培养的耳蜗组织48h，再用线粒体自噬诱导剂和新霉素处理6h之后，激光共聚焦显微镜观察发现(如图6)，对照组和新霉素处理后，561nm激发波长信号很低，而线粒体自噬诱导剂处理后，561nm激发波长信号很强，线粒体自噬诱导剂和新霉素共同处理后，561nm信号减弱，说明线粒体自噬水平降低。

当线粒体损伤时，被泛素标记的线粒体外膜会通过OPTN与LC3相连接，为了确定新霉素损伤后，自噬泡与损伤线粒体之间的识别有没有被破坏，检测了泛素与线粒体的共定位(图4A和4B)，发现新霉素处理后，被泛素标记的线粒体减少；此外，还转染了自噬受体OPTN以及自噬泡标记蛋白LC3B，用TOM20标记线粒体，激光共聚焦显微镜观察发现OPTN与LC3的共定位减少(图4C和4D)，说明新霉素处理还影响了自噬受体OPTN的募集。以上结果都表明新霉素抑制了线粒体自噬的发生。通过western blot以及QPCR结果，进一步发现，新霉素处理后，线粒体自噬关键因子PINK1的转录及翻译都受到了抑制，泛素的磷酸化也受到了影响。

为了进一步确定组织上线粒体自噬是否受到影响，先接下来，选用P3小鼠，解剖耳蜗并取出基底膜，分别加入不同浓度的DFP，培养24小时，通过免疫荧光结果显示，DFP浓度超过0.25mM就会引起毛细胞死亡(图7)，后面选用0.25mM进行体外培养组织中挽救实验。培养的基底膜用DFP预处理24小时后，加入新霉素(0.5mM)继续处理24小时，收集样本，Myosin7a标记毛细胞，TUNEL染色标记凋亡细胞，具体如图8所示，发现新霉素处理后，细胞凋亡率明显增加，而DFP预处理后再加入新霉素，毛细胞凋亡率明显降低。对不同处理后的基底膜进行RNA提取，并逆转录为cDNA进行QPCR检测DFP预处理，毛细胞RNA水平的凋亡情况，发现DFP预处理组与未预处理组相比，加入新霉素后，促凋亡基因Bax/Caspase9/Caspase3明显降低，用到的QPCR序列如下表1所示。

表1

为了进一步验证DFP的保护作用，选用8周大的C57BL/6小鼠进行实验，将小鼠分为4组，测听后，对实验组小鼠进行腹腔注射80mg/kg DFP，半小时后，皮下注射800mg/kgkanamycin，之后再腹腔注射200mg/kg利尿剂；对照组注射相同浓度的生理盐水。7天后，测听后解剖耳蜗，进行免疫荧光，Myoin7a标记毛细胞，结果如图9所示，DFP预处理后进行kanamycin损伤与单独kanamycin损伤相比，DFP能减少kanamycin导致的毛细胞缺失，且能在一定程度上恢复小鼠听力。

综上所述，本发明构建小鼠模型，探究DFP激活线粒体自噬对毛细胞保护作用，从而确定DFP对毛细胞的保护，为治疗耳聋提供新的理论思路，最终代替助听器和人工耳蜗帮助患者恢复和重建听觉功能。

在本发明的另一些示例中，还公开了一种药物或者药物组合，其有效成分可以包括氨基糖苷类药物，更具体地说，所述的氨基糖苷类药物并不限于上述示例中指出的新霉素，还可以是链霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星、异帕米星等。另外该药物或者药物组合中还包括去铁酮，其结构式可以是：

通过去铁酮抑制或者缓解氨基糖苷类的耳毒性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。