一种CaIFN-αTα1融合蛋白、载体及其重组菌和应用

摘要

本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种CaIFN‑α&Tα1融合蛋白、载体及其重组菌和应用。所述CaIFN‑α&Tα1融合蛋白包括犬α干扰素、Linker、以及Tα1基因；所述Linker和Tα1之间包括裂解或酶解位点，羟胺裂解位点Asn‑Gly、Kex2位点及Ste13、肠激酶位点中的一个。本发明利用密码子优化策略对犬α干扰素与Tα1进行密码子优化，利用高效的毕赤酵母甲醇诱导表达系统表达犬α干扰素与Tα1融合蛋白，增加羟胺裂解位点或酶解位点使得该融合蛋白可高效地获得Tα1单体，所述CaIFN‑α&Tα1融合蛋白兼具有犬α干扰素的生物学作用及胸腺肽α1的免疫增强功效，且具有高表达量。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种 CaIFN-α&Tα1融合蛋白、载体及其重组菌和应用。

背景技术

犬α干扰素(CaIFN-α)是一种具有光谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性的蛋白，抗病毒活性为犬α干扰素的主要生物学活性，广泛用于犬病毒性疾病的防止，包括：犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬腺病毒、犬副流感、犬冠状病毒感染、犬疱疹病毒感染、犬病毒性角膜炎及其他病毒性疾病。其作用机制为犬α干扰素通过一系列的信号传导刺激机体产生ISG(干扰素刺激基因)产物，ISG类产物包括多种抗病毒蛋白，能够有效抑制病毒的复制。同时还可通过提高机体的免疫效应和调整病毒转录过程等有效方式来实现其抗病毒作用。天然干扰素包括CaIFN-α具有半衰期短的特性，为4h左右，而现有技术中犬α干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。犬α干扰素的外源表达主要在大肠杆菌、毕赤酵母、动物细胞三种表达系统中的表达，在大肠杆菌表达系统存在变复性、去除内毒素及热源等繁琐的蛋白纯化工艺；同时大肠杆菌表达系统无法有效形成二硫键，不利于犬α干扰素的正确折叠，影响其天然构象及稳定性，进而影响其生物学活性；利用动物细胞表达则存在着工业复杂、成本较高、大规模产业化生产较为困难的情况，在相应表达系统中由于蛋白的翻译折叠等过程中还普遍存在表达的犬α干扰素生物活性低的现象。

在犬病毒病预防方面，国内运用较多的是疫苗和抗体，但是由于母源抗体的干扰及毒株的抗原漂移，有时会导致免疫失败，因此研制安全高效的干扰素抗病毒制剂具有重大意义。

胸腺肽(Tα1)广泛分布于哺乳动物各组织中，不同物种之间具有高度保守性。1977年，Goldstein等首次在胸腺肽组分5(Thymosin fraction 5，TF5)中分离得到单一多肽-胸腺肽α1，其活性比TF5提高10～1000倍，分子量是3108KD。Tα1通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，在活体内能使刀豆蛋白A(ConA) 激活后的小鼠淋巴细胞增加白细胞介素-2(IL-2)受体的表达作用；配伍其他细胞因子形成抗肿瘤作用。胸腺肽α1是一个高度保守酸多肽结构，主要分布在胸腺组织，尤其是胸腺上皮细胞中，另外，也存在于淋巴组织(如脾、淋巴结)和非淋巴组织(如肺、肾和脑)中，其分泌和释放并不受其他激素或者释放因子所调节。

大量实验证明具有强大的免疫调节作用，同时兼具有抗肿瘤抗炎作用。研究证实胸腺肽α1对某些疾病如感染性休克、急性呼吸窘迫综合征、腹膜炎、巨细胞病毒感染、结核病、严重急性呼吸综合症、肺感染、败血症、胃肠及全身感染、肝硬化自发性腹膜炎等具有临床应用价值。

目前市场上现有胸腺肽α1(Tα1)的制备可通过牛胸腺上提取、固相多肽合成以及基因工程等多种方法加以制备。目前临床上应用的Tα1，主要是通过固相多肽合成技术来合成，生产成本高，合成周期长。犬α干扰素具有广谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性。但其自身的半衰期短及现有技术限制了犬α干扰素的临床应用。Tα1前期的研究主要集中于原核的串联表达及融合表达，以包涵体的形式表达，活性低，难以获得理想的Tα1单体。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白、载体及其重组菌和应用，所述CaIFN-α&Tα1融合蛋白利用犬α干扰素与Tα1进行融合表达，形成一种生物学活性高、半衰期延长、稳定性好的犬α干扰素融合蛋白，兼具有犬α干扰素的生物学作用及胸腺肽α1的免疫增强功效。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白，所述CaIFN-α&Tα1 融合蛋白包括α干扰素(CaIFN-α)、Linker、以及胸腺肽α1(Tα1) 基因；

所述Linker和Tα1之间还包括裂解或酶解位点；

所述裂解或酶解位点包括羟胺裂解位点Asn-Gly、Kex2位点及 Ste13、肠激酶位点Enterokinase site中的一个；

所述羟胺裂解位点Asn-Gly位于Linker之后Tα1前，并在Tα1 后加入甘氨酸Gly；

所述Kex2位点及Ste13、或肠激酶位点Enterokinase site位于 Linker之后，Tα1之前；

所述CaIFN-α&Tα1融合蛋白经酶解或裂解之后得到Tα1单体；

所述CaIFN-α&Tα1融合蛋白包括CaIFN-α-LNGTα1GH、 CaIFN-α-LKSTα1H或CaIFN-α-LETα1H，其氨基酸序列分别如序列表 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，分别进行密码子优化之后的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；

所述CaIFN-α&Tα1融合蛋白还包括标签、终止密码子以及酶切位点；所述CaIFN-α、Linker、裂解或酶解位点、Tα1、标签、终止密码子以及酶切位点在合成之前分别进行毕赤酵母密码子优化；

所述标签包括组氨酸标签，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7 所示，密码子优化之后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

所述柔性Linker的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，密码子优化之后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；

所述CaIFN-α的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，密码子优化之后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；

所述Tα1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，密码子优化之后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示；

所述肠激酶位点Enterokinase site氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，密码子优化之后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；

所述终止密码子的组成包括TAA；

所述上游酶切位引入EcoRI，下游酶切位点引入XbaI。

本发明还提供了一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白载体，包含CaIFN-α&Tα1融合蛋白基因序列和毕赤酵母表达载体；

所述毕赤酵母表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、 pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、 pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pPIC3.5K、pPIC3K、pPIC9K、pPIC9、 pHIL-S1、pYAM75P、pHIL-D2、pA0815、pHWO10、Pichiapink-hc 的一种；

本发明还提供了一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白重组菌，包含 CaIFN-α&Tα1融合蛋白载体和毕赤酵母感受态细胞；

所述毕赤酵母感受态细胞包括X33、KM71、KM71H、GS115、 GS190、GS200、SMD1168、SMD1168H、SMD1163、Pichiapink-1、 Pichiapink-2、Pichiapink-3、Pichiapink-4的一种。

一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白载体以及重组菌的构建方法，包括如下步骤：

将CaIFN-α、Tα1、柔性Linker、标签、终止密码子以及酶切位点在合成之前分别进行毕赤酵母密码子优化，将CaIFN-α和Tα1序列之间采用柔性Linker进行连接，在C端引入标签及终止密码子，上游、下游引入酶切位点，合成于质粒上，之后双酶切后克隆至毕赤酵母载体质粒上，即得到含有CaIFN-α&Tα1融合蛋白的表达载体；

所述含有CaIFN-α&Tα1融合蛋白的表达载体经酶切、纯化，转化至毕赤酵母感受态细胞得到CaIFN-α&Tα1重组酵母菌。

本发明还提供了一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白的应用，其应用于 Tα1单体的工业化生产以及制备免疫增强剂。

本发明的有益效果如下：

本发明的CaIFN-α&Tα1融合蛋白，利用犬α干扰素与Tα1进行融合表达，形成一种生物学活性高、半衰期延长、稳定性好的犬α干扰素融合蛋白，兼具有犬α干扰素的生物学作用及胸腺肽α1的免疫增强功效，具有高表达量，解决了现有生物技术制备的犬α干扰素含量低的问题；

本发明的CaIFN-α&Tα1融合蛋白载体以及重组菌，利用酵母的糖基化修饰及二硫键的形成帮助干扰素在成熟过程中折叠成正确构象，使其能够抵抗消化酶的作用，增加稳定性及生物学活性，延长半衰期；

本发明的CaIFN-α&Tα1融合蛋白，其构建为首先利用密码子优化策略对犬α干扰素与Tα1进行密码子优化，利用高效的毕赤酵母甲醇诱导表达系统表达犬α干扰素与Tα1融合蛋白，增加羟胺裂解位点或酶解位点使得该融合蛋白可高效地获得Tα1单体。为Tα1的工业化生产提供技术支撑；毕赤酵母诱导表达上清无内毒素，杂蛋白少；毕赤酵母的糖基化修饰及二硫键形成使得犬α干扰素与Tα1融合蛋白，具有高活性及高稳定性，解决现有表达系统及相关生物技术制备的生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题。

附图说明

图1为本发明CaIFN-α&Tα1融合蛋白的构建示意图；

图2为本发明CaIFN-α&Tα1重组大肠杆菌的PCR鉴定结果图；

图3为本发明CaIFN-α&Tα1重组酵母菌液的PCR鉴定结果图；

图4为本发明CaIFN-α-H组及CaIFN-α-LNGTα1GH组诱导上清 SDS-PAGE结果图；

图5为本发明CaIFN-α-LKSTα1H组及CaIFN-α-LETα1H组诱导上清SDS-PAGE结果图；

图6为本发明CaIFN-α&Tα1融合蛋白羟胺裂解后SDS-PAGE结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白、载体以及重组菌的构建：

1)重组质粒及重组菌的建立

根据CaIFN-α(GenBank上登陆号为DQ520882)及Tα1序列 (E00106.1)及表达载体pPICZαA图谱，在目的基因的C端引入组氨酸标签及终止密码子TAA，上游引入EcoRI酶切位点，下游引入 XbaI，构建示意图如图1所示；

犬α干扰素与Tα1融合蛋白之间采用柔性Linker(GGGGS)进行连接，融合策略共三个方案：

1、羟胺裂解位点：在Linker后Tα1前加入羟胺裂解位点 (Asn-Gly)，在Tα1后加入甘氨酸(Gly)，羟胺裂解后为Tα1单体，同时为了便于纯化融合His-Tag；

2、Kex2位点及Ste13序列：在Linker后Tα1前加毕赤酵母自身的酶系识别的Kex2位点及Ste13序列，获得Tα1单体，同时为了便于纯化融合His-Tag；

3、Enterokinase site(肠激酶位点)：在Linker后Tα1前加肠激酶特异性地识别的DDDDK序列，获得Tα1单体，同时为了便于纯化融合His-Tag；

将以上相关序列送广州金唯智生物科技有限公司进行毕赤酵母密码子后全基因合成至pUC57质粒上：

获得四种重组质粒CaIFN-α-H-pUC57、 CaIFN-α-LNGTα1GH-pUC57、CaIFN-α-LKSTα1H-pUC57、 CaIFN-α-LETα1H-pUC57；

以上重组质粒经EcoRI、XbaI双酶切后获得的目的片段克隆至经相同双酶切的毕赤酵母表达载体pPICZαA上，并进行T4连接酶连接及转化感受态DH5α；

所述毕赤酵母表达载体还可以为pPICZαB、pPICZαC、pPICZA、 pPICZB、pPICZC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pGAPZA、 pGAPZB、pGAPZC、pPIC3.5K、pPIC3K、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1、 pYAM75P、pHIL-D2、pA0815、pHWO10、Pichiapink-hc的一种，在此不做重复赘述；

2)重组菌的PCR鉴定

采用由广州金唯智生物科技有限公司合成的鉴定引物α-factor和 3’Aox1，核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示， PCR鉴定体系及程序如下表所示，PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。

表1 PCR鉴定体系

表2 PCR鉴定程序

挑取PCR鉴定为阳性菌进行质粒抽提并测序鉴定，如图2所示，PCR鉴定结果显示：各组质粒CaIFN-α-H-pPICZαA、 CaIFN-α-LNGTα1GH-pPICZαA、CaIFN-α-LKSTα1H-pPICZαA、CaIFN-α-LETα1H-pPICZαA均为阳性，质粒测序结果显示各组测序正确，质粒构建成功。

3)重组质粒的酶切线性化及纯化回收

参考TAKARA公司酶切试验手册，用Sac I单酶切各重组质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检测线性化完全。对线性化产物进行纯化回收，纯化回收方法参考试剂盒使用说明书。

4)毕赤酵母X33感受态细胞的制备

4.1)接种酵母受体菌单菌落X33于YPD平板，30℃培养2天；

所述毕赤酵母感受态细胞还可以为KM71、KM71H、GS115、 GS190、GS200、SMD1168、SMD1168H、SMD1163、Pichiapink-1、 Pichiapink-2、Pichiapink-3、Pichiapink-4的一种，操作同本实施例；

4.2)挑取平板上的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

4.3)过夜培养后按1％左右的接种量接种到100mLYPD培养基中震荡培养至OD值1.2～1.5；

4.4)4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；

4.5)4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；

4.6)再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL 预冷无菌水重悬菌体；

4.7)20ml，1mol/L山梨醇洗涤1次；

4.8)将菌体溶于1mL，1M预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化。

5)线性化表达质粒电转化毕赤酵母X33感受态细胞

5.1)准备好80L的酵母感受态与线性化的质粒1-5g(冰上预冷 15min)混合，迅速放入0.2cm的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌)，电击；电转参数为Voltage：1500V；Capacitance：25μF；Resistance： 200Ω；Cuvette(mm)：2mm；

5.2)电击结束，迅速加入1mL山梨醇(1M)，冰上静置15min，随后30℃温箱中静置培养1h。再加入1mLYPD液体培养基，30℃， 200r/min振荡培养1小时，常温4000r/min离心收集菌体，涂至含有 100μg/μL的YPDS平板中30℃静置培养3d。

6)重组酵母菌的鉴定及高拷贝的筛选

用灭菌枪头细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，接种于2mL的YPD液体培养基中(含150μg/mLZeocin)，30℃， 200r/min振荡培养过夜。采用菌液PCR分析P.pastoris转化子，PCR 鉴定体系同表1，PCR鉴定程序表3，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定引物能扩增出目的条带的克隆定为阳性转化子。

表3 重组酵母菌液PCR鉴定程序

高拷贝的筛选需结合PCR鉴定中的条带亮度及高抗性YPD平板 (200μg/mLZeocin)试验结果。

重组菌液PCR鉴定结果显示：各组CaIFN-α-H-pPICZαA-X33、 CaIFN-α-LNGTα1GH-pPICZαA-X33、 CaIFN-α-LKSTα1H-pPICZαA-X33、CaIFN-α-LETα1H-pPICZαA-X33 均有阳性重组酵母菌株，电转化X33成功。

选取相应菌株进行YPD(含100μg/mLZeocin)平板划线。

7)高拷贝重组酵母菌的诱导表达

7.1)用灭菌枪头细挑YPD平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于20mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200r/min 振荡过夜，至OD600＝2～6，此时细胞处于对数生长期；

7.2)3000r/min室温离心5min收集沉淀，重悬于1mL的BMMY 中，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在250mL的三角锥瓶中振荡培养；

7.3)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养；

7.4)培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE或置于-80℃保存。

8)重组酵母菌诱导表达上清的SDS-PAGE

重组酵母菌诱导表达1-3d的上清SDS-PAGE分析；蛋白上样缓冲液为5×LoadingBuffer，上样量为12μL。

结果如图4、图5所示，CaIFN-α-H、CaIFN-α-LNGTα1GH、 CaIFN-α-LKSTα1H、CaIFN-α-LETα1H均在酵母表达系统中高效表达，CaIFN-α-H条带大小大于预期的20kDa，CaIFN-α-LNGTα1GH、 CaIFN-α-LKSTα1H、CaIFN-α-LETα1H均大于预期的24kDa。

表明该酵母表达系统对CaIFN-α-H、CaIFN-α-LNGTα1GH、 CaIFN-α-LKSTα1H、CaIFN-α-LETα1H进行了适度的糖基化修饰。

9)表达产物的纯化回收

诱导表达上清的纯化结合His Tag进行镍柱亲和层析方法进行蛋白的吸附、洗脱纯化，利用透析法进行咪唑的去除后测定浓度，各组样品纯化后浓度见下表4。将各组样品进行冻干保存备用。

表4 各组样品纯化后的浓度

10)生物学活性的测定

采用MDCK-VSV微量病变抑制法检测目的蛋白的活性，将消化后的MDCK细胞铺96孔细胞培养板，待细胞完全贴壁后每孔加入 100μL4倍倍比稀释的纯化后的犬α干扰素及其融合蛋白，37℃孵育 24h后每孔用100TCID50VSV攻毒，同时设置正常细胞对照组和只加病毒的病毒对照组。

48h后察细胞病变的抑制结果，以抑制50％细胞病变CPE50的最高干扰素稀释度为1个活性单位，如表5所示。

表5 各组纯化样品的活性

结果表明：纯化后的CaIFN-α-H、CaIFN-α-LNGTα1GH、 CaIFN-α-LKSTα1H、CaIFN-α-LETα1H均有较高的活性，表明适度的糖基化能够有效提高犬α干扰素的活性及CaIFN-α&Tα1融合蛋白的活性。

CaIFN-α-H与融合蛋白的活性比较可知，各组活性 CaIFN-α-LKSTα1H＞CaIFN-α-LNGTα1GH＞CaIFN-α-LETα1H＞ CaIFN-α-H，表明犬α干扰素与Tα1的融合，有利于犬α干扰素活性的提升。

11)犬α干扰素半衰期的测定

选择各组纯化后无菌真空冻干的来进行犬α干扰素及其融合蛋白半衰期的测定，测定方法采用细胞病变抑制法测定犬α干扰素及其融合蛋白的血药浓度与时间的关系。

取6只体重接近10kg的成年比格犬，雌雄各半。按1mg/mL/只剂量颈部皮下注射冻干的犬α干扰素及CaIFN-α&Tα1融合蛋白。分别在注射后1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h静脉采血。血样 4℃低温凝固后，3000r/min低温离心5min，获取上层血清。采用细胞病变抑制法测定不同时间点血清中犬α干扰素的浓度，利用DAS 药动学软件进行曲线拟合并计算相关参数。

表6 半衰期的测定

经测定经酵母表达糖基化修饰的犬α干扰素半衰期为10.2h，是文献报道的天然CaIFN-α(4.2h)的半衰期2.4倍， CaIFN-α-LNGTα1GH、CaIFN-α-LKSTα1H、CaIFN-α-LETα1H，较未融合组有一定程度的提升，较天然犬α干扰素的半衰期有大幅度的提升。利用酵母表达系统中对犬α干扰素及CaIFN-α&Tα1融合蛋白的糖基化修饰能够显著延长半衰期，犬α干扰素与Tα1的融合在毕赤酵母表达系统中的表达简化了犬α干扰素的长效性修饰工艺，具有广阔的应用前景。

12)CaIFN-α-LNGTα1GH的羟胺裂解

将纯化后的CaIFN-α-LNGTα1GH(初始浓度0.4mg/mL)进行2 倍梯度稀释后再进行羟胺裂解，稀释液为ddH

羟胺裂解条件优化为：2M羟胺，0.2M组氨酸缓冲液，pH9.0， 45℃裂解6h。

其它重组质粒的裂解方法如上，裂解后对各样品进行SDS-PAGE 分析，如图6所示，0.2mg/mL浓度条件下的裂解较为明显，图中各孔最下面条带即为Tα1单体。

表明本发明表达的CaIFN-α&Tα1融合蛋白在该裂解条件下可获得Tα1单体。

序列表

<110> 广州源博医药科技有限公司

<120> 一种CaIFN-α&Tα1融合蛋白、载体及其重组菌和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 206

<212> PRT

<213> Sequence Artificial

<400> 1

Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr

20 25 30

Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val

50 55 60

Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr

65 70 75 80

Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile

145 150 155 160

Arg Arg Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asn Gly Ser Asp Ala Ala Val

165 170 175

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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515 520 525

Gly Ala Cys Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala

530 535 540

Thr Cys Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr

545 550 555 560

Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly

565 570 575

Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly

580 585 590

Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala

595 600 605

Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr

610 615

<210> 3

<211> 209

<212> PRT

<213> Sequence Artificial

<400> 3

Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr

20 25 30

Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val

50 55 60

Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr

65 70 75 80

Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr

115 120 125

Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala

130 135 140

Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile

145 150 155 160

Arg Arg Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser

165 170 175

Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys

180 185 190

Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn His His His His His

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His

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<213> Sequence Artificial

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<212> PRT

<213> Sequence Artificial

<400> 5

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1 5 10 15

Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr

20 25 30

Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val

50 55 60

Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr

65 70 75 80

Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile

145 150 155 160

Arg Arg Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ser Asp

165 170 175

Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu

180 185 190

Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn His His His His His His

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<213> Sequence Artificial

<400> 11

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20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Arg Arg Arg Lys

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<212> DNA

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<400> 12

tgtcatttgc cagataccca tggtttacga aactggaggg tgttaacttt gcttggtcaa 60

atgagacgtc tgtcagctgg ttcttgtgat cattacacta atgactttgc tttccccaaa 120

gaactgtttg acggacagcg tttgcaagaa gctcaagctt tatctgtggt ccacgttatg 180

acacaaaagg tattccattt attttgtcct gatacctcaa gtgctccatg gaacatgacc 240

ctattagaag agctatgtag tggtttgtct gaacagctgg atgacctgga ggcatgtccc 300

ttgcaagaag ccggtttggc tgagaccccc ttgatgcacg aggattctac tttgagaact 360

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atggttagag ccgaaattgg aagaagtttc tttagttcta ctatcctgca ggaacgtatt 480

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<212> PRT

<213> Sequence Artificial

<400> 15

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 18

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