沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株

摘要

本发明涉及沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株，属于微生物检测领域。沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、与样品垫连接的金标垫、与金标垫连接的硝化纤维素膜、与硝化纤维素膜连接的吸水纸，所述金标垫上设有与胶体金偶联的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株分泌产生，所述硝化纤维素膜上设置有检测线和质控线，在靠近金标垫的一端设置检测线，远离金标垫的一段设置质控线，所述检测线由单克隆抗体构成，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株分泌产生，所述质控线由羊抗鼠抗体构成。本发明沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条对沙门氏菌具有广谱性的检测，且检测的灵敏度较高。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其是涉及沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠道杆菌，可引起人和动物患病。据统计，在全世界范围内各类细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌引起的食物中毒常居首位。沙门氏菌感染可引起腹泻、胃肠炎、发烧以及败血症等，严重时可致人死亡。该致病菌主要存在于生鲜肉类、奶类和蛋类等成品和半成品中。在食物的生产、加工和运输中，由于交叉感染，易导致沙门氏菌感染事件的大规模爆发。此外，沙门氏菌种类众多，目前发现的沙门氏菌大约有2600多种血清型。因此，沙门氏菌的广谱性检测至关重要。

目前，沙门氏菌检测主要依赖于国标规定的传统培养法及生化鉴定，其被视为沙门氏菌检测的金标准，但是，检测周期长、操作繁琐，不适合大量样品的检测。此外，实验室常用的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)进行沙门氏菌的检测，其灵敏度高，但是依赖专业的设备和操作人员且操作时间较长。免疫学检测由于其检测周期短、操作简便、灵敏度较高，近年来成为发展迅速的检测手段。但是，沙门氏菌的免疫学检测一般是单一菌种的检测或单一血清型的检测，目前尚未有可针对多种沙门氏菌实现快速检测的国产化产品。

发明内容

针对现有技术中缺乏可针对多种沙门氏菌实现快速检测产品的现状，本发明提供一种沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条，同时提供用于该试纸条的一种单抗和产生该单抗的杂交瘤细胞株。本发明所提供的沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条可用于多种沙门氏菌的检测，检测范围广。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种杂交瘤细胞株，命名为2D6，分类命名为沙门氏菌杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.22303，于2021年4月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，为稳定分泌沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施方式中，以沙门氏菌免疫BALB/C小鼠，经杂交瘤融合、杂交瘤筛选得到保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株，即杂交瘤细胞株2D6，此杂交瘤细胞株可经小鼠腹腔培养，并提取得到单克隆抗体。

本发明还提供一种单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株产生，为沙门氏菌单克隆抗体，称之为抗体2D6。

本发明还提供一种沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、与样品垫连接的金标垫、与金标垫连接的硝化纤维素膜、与硝化纤维素膜连接的吸水纸，所述金标垫上设有与胶体金偶联的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株分泌产生。

在本发明的一个实施方式中，所述硝化纤维素膜上设置有检测线和质控线，在靠近金标垫的一端设置检测线，远离金标垫的一段设置质控线。

在本发明的一个实施方式中，所述检测线由单克隆抗体构成，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株分泌产生，所述质控线由羊抗鼠抗体构成。

本发明中，胶体金偶联抗体和构成检测线的抗体为同一单克隆抗体。

在本发明的一个实施方式中，所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条背面设置一个用以支撑的底板。

在本发明的一个实施方式中，与胶体金偶联的单克隆抗体中，单克隆抗体和胶体金的质量体积比为15-20μg/mL，优选为18μg/mL。

在本发明的一个实施方式中，与胶体金偶联的单克隆抗体中，胶体金的粒径为30～40nm。

本发明还提供一种沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试剂盒，包括所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条。

本发明所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条的检测原理为：当样品滴加到样品垫上时，随着层析作用，样品沿着样品垫、金标垫、硝化纤维素膜、吸水纸的方向层析。若样品中含有目标细菌，目标菌与金标垫上的胶体金偶联的单克隆抗体结合，形成胶体金偶联抗体-细菌复合物，此复合物流经检测线时，被检测线的单克隆抗体所捕获，形成胶体金偶联单克隆抗体-细菌-捕获抗体的三元复合物，使检测线出现可视化的颜色；随着继续层析，此三元复合物被质控线上的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色。若样品不含目标细菌，当样品流经金标垫时，胶体金偶联的单克隆抗体随样品层析，最终到达质控线，被质控线的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色。

使用本发明所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条，结果判读为：阳性样品既显示检测线又显示质控线，阴性样品只显示质控线(若仅出现检测线或检测线和质控线均不显色则结果判定为无效)。

本发明还提供所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条在食品检测中的用途。

在本发明的一个实施方式中，所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条在食品检测中使用时，滴加样品时，样品中含菌液浓度高于10

本发明以沙门氏菌为检测靶标，所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条能够实现沙门氏菌的快速检测，适用范围广。

与现有技术相比，本发明提供的沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别设置于检测线和金标垫，结果表明对沙门氏菌具有广谱性的检测，且检测的灵敏度较高。

附图说明

图1是本发明实施例2中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的胶体金的全波长扫描图(400nm-700nm)。

图2是本发明实施例2中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的单克隆抗体偶联胶体金的pH结果。

图3是本发明实施例2中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的单克隆抗体与胶体金偶联结合量结果。

图4是本发明实施例2中制备的沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的结构示意图。

图5是本发明实施例2中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度结果。

图6是本发明实施例2中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的检测41株沙门氏菌的广谱性结果。

图7是本发明实施例2中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条检测其他15株食源性致病菌(非沙门氏菌)的交叉反应结果。

图8是本发明实施例2中模拟沙门氏菌感染鸡肉样品后免疫胶体金试纸条检测结果。

具体实施方式

本发明提供一种杂交瘤细胞株，命名为2D6，分类命名为沙门氏菌杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.22303，于2021年4月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，为稳定分泌沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明还提供一种单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株产生，为沙门氏菌单克隆抗体，称之为抗体2D6。

本发明还提供一种沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、与样品垫连接的金标垫、与金标垫连接的硝化纤维素膜、与硝化纤维素膜连接的吸水纸，所述金标垫上设有与胶体金偶联的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株分泌产生。所述硝化纤维素膜上设置有检测线和质控线，在靠近金标垫的一端设置检测线，远离金标垫的一端设置质控线。所述检测线由单克隆抗体构成，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株分泌产生，所述质控线由羊抗鼠抗体构成。

在本发明的一个实施方式中，所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条背面设置一个用以支撑的底板。

在本发明的一个实施方式中，与胶体金偶联的单克隆抗体中，单克隆抗体和胶体金的质量体积比为15-20μg/mL，优选为18μg/mL。

在本发明的一个实施方式中，与胶体金偶联的单克隆抗体中，胶体金的粒径为30～40nm。

本发明还提供一种沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试剂盒，包括所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条。

本发明还提供所述沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条在食品检测中的用途。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中所使用的菌株、试剂与仪器介绍如下：

使用的沙门氏菌菌株如表1所示。

表1本发明所用沙门氏菌菌株

使用的其它食源性致病菌(非沙门氏菌)菌株如表2所示。

表2本发明所用其它食源性致病菌

主要试剂：

BSA、PEG、TWEEN-20来自Sigma；氯金酸来自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135S Millipore；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠生工生物工程股份有限公司。

主要仪器：

酶标仪SpectraMax M2购自Molecular Devices；Nanodrop 2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；扫描仪Phantom V9购自MICROTEK；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。

实施例1

沙门氏菌单克隆抗体的制备

1.免疫原的准备

猪霍乱沙门氏菌在营养肉汤中培养12-18h，随后进行PCR鉴定，用灭菌的PBS洗涤菌液三次，并调节其浓度使OD

2.单克隆抗体的制备过程

1)实验动物：选3只6-8周龄、体重25g左右、雌性BALB/C小鼠为实验动物。

2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.4mL免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。

3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。

4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5：1的比例在50％PEG作用下常规融合，随后铺于96孔酶标板，置于37℃、5％CO

5)杂交瘤细胞筛选：采用HAT进行杂交瘤细胞的筛选，采用有限梯度稀释法进行杂交瘤细胞亚克隆，亚克隆2次后改为HT培养基进行筛选，采用间接非竞争酶联免疫法测定，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，经过3～4次亚克隆，直至阳性率达到100％。将最终的阳性杂交瘤细胞扩大培养后冻存于液氮中，即得到了杂交瘤细胞株。

6)抗体制备：将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的BALB/C小鼠腹腔，每只2×10

筛选出1株稳定分泌沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D6，保藏编号为CGMCCNo.22303，分别进行亚型鉴定、测定浓度和效价。

3.单克隆抗体的亚型鉴定

由保藏编号为CGMCC No.22303的杂交瘤细胞株产生的抗体称为抗体2D6。

通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定抗体亚型，结果表明抗体2D6的亚型为IgG1。

4.单克隆抗体的纯度及效价测定

腹水经辛酸-硫酸铵法制备得到单克隆抗体，通过Nanodrop 2000C测得浓度为2.3mg/mL。

单克隆抗体效价测定的步骤如下：

1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μL，4℃过夜或37℃2h。

2)倒空液体并拍干残留液体，用200μL洗涤液清洗3次。

3)每个孔中加200μL 3％的脱脂奶粉，37℃封闭2h。

4)倒空液体并拍干残留液体，用200μL洗涤液清洗3次。

5)每个孔中加100μL的抗体，37℃孵育1h。

6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加200μL洗涤液洗涤3次。

7)每个孔中加100μL的HRP标记的二抗(sigma)，37℃孵育1h。

8)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加200μL洗涤液洗涤3次。

9)每个孔中加100μL底物，显色30min，加终止液50μL并立即读取OD

测定的抗体效价为1：32000。

实施例2

沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的制备

1.胶体金的制备过程

1)1％氯金酸的配制：取1g氯金酸粉末，加入100mL灭过菌的双蒸水，配成1％氯金酸溶液，放4℃备用。

2)1％柠檬酸三钠配制：取0.5679g二水合柠檬酸三钠，溶解到50mL双蒸水中，配成1％柠檬酸三钠溶液，现配现用。

3)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，198mL双蒸水的烧瓶中，调节磁力搅拌器温度到120℃，搅拌速率为700rpm，加热至沸腾(约100℃)，立即加入1％氯金酸2mL，沸腾15s，充分搅拌同时迅速加入5.4mL 1％的柠檬酸三钠，计时10min，停止加热，冷却至室温，分装后4℃避光保存。

4)将胶体金溶液采用酶标仪进行全波长扫描，结果如图1所示，其最大吸收在520nm，表明胶体金的粒径在30nm-40nm；且最大吸收峰较窄，表明粒径大小分布均匀。。

2.胶体金试纸条抗体最优pH的确定

分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，加入0.2mol/L碳酸钾调整溶液pH，加入量分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μL，每孔加入5μL浓度为2.3mg/mL的实施例1所得单克隆抗体。反应10min，各孔加入10μL 10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。

图2中从左到右的孔中碳酸钾依次为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μL。

图2得知，当碳酸钾为0.9μL/100μL胶体金时，孔中胶体金颜色最红(由于附图中没有色彩，所以通过说明书附图并不能看到红色，但是实际实验结果表示当碳酸钾为0.9μL/100μL胶体金时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象)，且无聚沉、无褪色或变色现象，即此添加量是单抗2D6偶联胶体金的最佳pH。

3.胶体金偶联抗体的最佳结合量的确定

调节胶体金溶液pH至上述中得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100μL于96孔板中，按表3加入各抗体，反应5min，各孔加入10μL 10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x×20％为最佳结合量。

表3抗体与胶体金偶联最佳结合量

由上述胶体金偶联抗体的结合量进行抗体结合量进一步详细测定，如表4所示。

表4抗体与胶体金偶联最佳结合量

本实施例中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条的单克隆抗体与胶体金偶联结合量结果如图3所示。

图3A从左到右抗体质量/金溶液体积(μg/mL)分别为0，3，6，12，24，36，48，96μg/mL，由图3A可知，胶体金偶联抗体的浓度在6μg/mL-24μg/mL，各孔中胶体金颜色保持不变。因此，进行进一步的浓度摸索。图3B从左到右抗体质量/金溶液体积(μg/mL)分别为6，9，12，1 5，18，21，24，27μg/mL，由图3B得知，胶体金偶联抗体的浓度在≥18μg/mL，各孔中胶体金颜色保持不变，即胶体金偶联抗体2D6的最小结合量为18μg/mL。

4.抗体的胶体金标记

胶体金pH调节至最佳pH值，按步骤(2)中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌1h，加入金溶液1/10体积的含10％BSA的PB溶液，搅拌1h，移入离心管1000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3％叠氮化钠。

5.沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条的组装及结构示意图。

图4是本发明沙门氏菌广谱性免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。

如图4所示，沙门氏菌广谱性免疫胶体金快速检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫一侧。另外沙门氏菌广谱性免疫胶体金快速检测试纸条10还具有背衬，用于承载上述的样品垫等结构。

将步骤4中制备好的金标抗体分别喷涂于检测试纸条的金标垫上，记为抗体-Au-pad，将浓度为2.3mg/mL的抗体2D6包被于硝酸纤维素膜12上作为Test line，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠抗体作为金标单抗试纸条的Control line，即质控线，也称C线。然后，组装试纸条。

6.沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条灵敏度实验

将培养好的鼠伤寒沙门氏菌菌液用营养肉汤培养基依次稀释至10

挑取猪霍乱沙门氏菌单菌落于培养基中，置于37℃摇床培养12h，平板菌落计数算得纯菌液浓度为1.1×10

7.沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条广谱性实验

此时沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条以单克隆抗体2D6偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，同时，单克隆抗体2D6喷涂于NC膜构成T线。用制备好的试纸条检测41株培养至10

图6是本实施例中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条检测41株沙门氏菌的结果。

由图6可知，100μL浓度为10

8.沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条交叉反应实验

用制备好的试纸条检测15株培养至10

图7是本实施例中沙门氏菌广谱性免疫胶体金试纸条检测15株其它食源性致病菌(非沙门氏菌)的交叉反应结果。

由图7可知，100μL浓度为10

9.沙门氏菌广谱性胶体金试纸条模拟带菌实验。

沙门氏菌经营养肉汤过夜培养，菌落平板计数确定菌液浓度。取25g鸡肉样品加入到含有225mL营养肉汤的锥形瓶中，121℃灭菌30min，在无菌操作台中加入稀释的沙门氏菌菌液(猪霍乱沙门氏菌CMCC 50018、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、甲型副伤寒沙门氏菌IQCC30537和乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50004)，保证沙门氏菌的浓度为1CFU/mL。置于37℃的摇床中培养，设置摇床的转速为200r/min。每1小时取一次样品，用试纸条进行检测，连续检测12个小时。

图8为本实施例中模拟沙门氏菌感染鸡肉样品后免疫胶体金试纸条检测结果。其中A-D分别为猪霍乱沙门氏菌CMCC 50018、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、甲型副伤寒沙门氏菌IQCC 30537和乙型副伤寒沙门氏菌CMCC 50004的实验结果。

由图8可知，该试纸条在猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌分别孵育7h、7h、7h和8h时可检测出阳性结果，检测限低至1CFU/mL。

本发明筛选出一株单克隆抗体，即抗体2D6作为金标抗体和检测抗体，制成免疫胶体金试纸条。实验表明此试纸条对沙门氏菌的广谱性好，灵敏度较高且无交叉反应。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。