脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法

摘要

本发明涉及一种脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：制备pH≤5的脆弱拟杆菌的菌悬液，加热提取，收集提取液得到荚膜多糖A的粗糖溶液。与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：发明人意外地发现，对pH≤5的脆弱拟杆菌的菌悬液进行加热提取，能有效促进荚膜多糖A从脆弱拟杆菌菌体中脱落从而提取获得荚膜多糖A。相比于传统的苯酚/水法，本申请能在避免使用苯酚的情况下获得荚膜多糖A，毒害性低。并且，采用本发明制备方法，脆弱拟杆菌荚膜多糖A的得率明显得以提升。

说明书

技术领域

本发明涉及脆弱拟杆菌荚膜多糖的制备和应用技术，特别是一种脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法。

背景技术

脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成员，属于拟杆菌门，完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等。拟杆菌属有25个菌种，仅来自人类的有10个菌种，仅来自动物的有10个菌种，来自人和动物的有5个菌种。脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依据能否合成、分泌脆弱拟杆菌肠毒素(BFT)可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF))和非产肠毒素型脆弱拟杆菌(Nontoxigenic Bacteroides fragilis，NTBF)。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。

脆弱拟杆菌可以表达8种不同的荚膜多糖，分别记作A～H，其中荚膜多糖A(polysaccharideA，PSA)的作用由其分子量大小决定，天然PSA的分子量约110kDa。

已有研究报道(Dennis L.Kasper,Andrew B.Onderdonk,Joseph Crabb,and JohnG.BartlettProtective Efficacy of Immunization with Capsular Antigen againstExperimental Infection with Bacteroides fragilis.THE JOURNAL OF INFECTIOUSDISEASES.VOL.140,NO.5.NOVEMBER 1979)了，脆弱拟杆菌荚膜多糖在预防与其同属细菌造成的感染中发挥积极的作用，该研究认为此种情况是因为拟杆菌属荚膜多糖具有数个相似的抗原决定簇。该研究发现，尽管以脆弱拟杆菌荚膜多糖进行免疫的动物无法抵抗其他细菌(如大肠杆菌)造成的感染，但由于对拟杆菌属免疫，感染程度有了明显的下降。同时，这项研究比较了脆弱拟杆菌荚膜多糖A和荚膜多糖B，两种荚膜多糖都显示出预防效果，但荚膜多糖A的起效剂量远小于荚膜多糖B。

目前，关于脆弱拟杆菌荚膜多糖A对疾病发挥预防/治疗功效的案例还有很多，因此如何很好地实现脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备具有重要意义。

脆弱拟杆菌荚膜多糖A(PSA)的制备方法已有大量研究报道，各文献中公开的方法均为苯酚/水法，此工艺也是制备细菌多糖类疫苗的工艺基础。传统基于苯酚/水法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖A的工艺例如：

公开号为US20140243285A1的美国发明专利申请中，以脆弱拟杆菌NCTC9343菌株为原料，加入苯酚/水溶液混匀，通过68℃下持续搅拌提取→离心收集水相→乙醚萃取除苯酚→蛋白酶/核酸酶除蛋白除核酸→乙醇沉淀多糖→加入2％的乙酸高温水解→分子筛或离子交换色谱纯化工艺，获得了含有微量结合脂质的脆弱拟杆菌荚膜多糖A，分子量约为110KD。

公开号为CN110025636A、CN109954005A的中国发明专利申请，涉及的脆弱拟杆菌提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心沉淀，收集第一沉淀物，取所述第一沉淀物加入65℃～72℃的水，溶解后再加入苯酚溶液，保持65℃～72℃搅拌25min～35min，离心，收集第一上清液；(2)将步骤(1)中收集的第一上清液用乙醚萃取去除苯酚，再去除残留的乙醚，收集水相溶液；(3)在步骤(2)中收集到的水相溶液中加入无水乙醇至乙醇的终浓度为75～85v/v％，醇沉，离心，收集第二沉淀物；(4)取所述第二沉淀物，加水配制成混悬液，再调节pH为6.5～7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。这些技术方案对苯酚/水法提取PSA的工艺进行了改进，减少了酶除蛋白及核酸步骤，简化了工艺。

但本质上，以上传统的方法依赖苯酚，该有机溶剂有毒有害，其使用不利于生产安全和环境保护。基于此，亟待提供一种毒害性低的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备工艺。

发明内容

鉴于以上背景技术，本发明的主要目的是提供一种脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法，采用该制备方法从脆弱拟杆菌中提取荚膜多糖A，可以避免苯酚使用，确保工艺安全环保。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

制备pH≤5的脆弱拟杆菌的菌悬液，加热提取，收集提取液得到荚膜多糖A的粗糖溶液。

在其中一个实施例中，所述菌悬液的pH为2.0～4.5。

在其中一个实施例中，所述菌悬液的pH为2.5～4.0。

在其中一个实施例中，加热提取采用的温度为50℃～120℃。

在其中一个实施例中，加热提取采用的温度为70℃～120℃。

在其中一个实施例中，加热提取的时长为0.5h～3.0h。

在其中一个实施例中，所述菌悬液的pH为2.5～4.0，加热提取采用的温度为90℃～110℃，加热提取的时长为1.0h～2.5h。

在其中一个实施例中，所述制备方法还包括对所述粗糖溶液进行超滤并收集截留液的步骤。

在其中一个实施例中，所述制备方法还包括对所述截留液进行离子交换层析并对收集到的洗脱液进行超滤的步骤。

在其中一个实施例中，加热提取的方式为水浴加热、气浴加热或/和蒸汽加热。

在其中一个实施例中，收集所述提取液的方式采用离心。

在其中一个实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌菌株。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

发明人意外地发现，对pH≤5的脆弱拟杆菌的菌悬液进行加热提取，能有效促进荚膜多糖A从脆弱拟杆菌菌体中脱落从而提取获得荚膜多糖A。相比于传统的苯酚/水法，本发明避免使用苯酚，毒害性低。并且，采用本发明制备方法，脆弱拟杆菌荚膜多糖A的得率明显得以提升。

附图说明

图1为实施例一的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；

图2为实施例一的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；

图3为本发明实施例二的荚膜多糖A(PSA)核磁共振波谱仪分析的1H谱；

图4为本发明实施例二的荚膜多糖A(PSA)核磁共振波谱仪分析的13C谱；

图5为本发明实施例二的荚膜多糖A(PSA)核磁共振波谱仪分析的COSY谱；

图6为本发明实施例二的荚膜多糖A(PSA)核磁共振波谱仪分析的HSQC谱；

图7为本发明实施例二的荚膜多糖A(PSA)核磁共振波谱仪分析的HMBC谱；

图8为本发明实施例二制备得到的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的化学结构式。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本发明提供一种脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

制备pH≤5脆弱拟杆菌的菌悬液，加热提取，收集提取液得到荚膜多糖A的粗糖溶液。

本发明提供的制备方法中，对pH≤5脆弱拟杆菌的菌悬液具体制备方法不做特别限定，包括但不限于如下方式：(1)培养脆弱拟杆菌并将收集到的菌体(可以称为菌泥，含水量可以控制在50％～95％)重悬于例如水的溶剂中(例如重悬于质量是所述菌体质量3倍～10倍的纯化水中)，然后添加pH调节剂将菌悬液的pH调节至≤5。pH调节剂可以是无机酸、有机酸和酸性缓冲液中的任意一种或几种的组合。该处所述的无机酸例如为盐酸、硫酸、磷酸等，该处所述的有机酸例如为乙酸、柠檬酸等。(2)培养脆弱拟杆菌并将收集到的菌体重悬于pH≤5的无机酸、有机酸或/和酸性缓冲液中。

本发明提供的制备方法中，可以调节脆弱拟杆菌的菌悬液pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5或者任意两个pH值之间的pH范围。优选地，调节所述菌悬液pH为2.0～4.5。进一步地优选地，所述菌悬液的pH为2.5～4.0。更优选地，所述菌悬液的pH为3.5～4.0。采用较优的pH能够进一步提升脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品的得率。

本发明提供的制备方法，加热提取采用的温度为50℃～120℃，例如可以为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃或者任意两个温度值之间的温度范围。优选地，加热提取采用的温度为70℃～120℃。进一步优选地，加热提取采用的温度为90℃～110℃。采用较优的pH能够进一步提升脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品的得率。

本发明提供的制备方法，加热提取的时长为0.5h～3.0h，例如为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h或者任意两个时间值之间的时间范围值。优选地，加热提取的时长为1.0h～2.5h。

本发明提供的制备方法，所述菌悬液pH为2.5～4.0，加热提取采用的温度为90℃～110℃，加热提取的时长为1.0h～2.5h。本发明通过把菌体重悬于水中，调节pH至2.5～4.0，在90℃～110℃中提取1.0h～2.5h，再离心取上清，可有效促进荚膜多糖从菌体中脱落，有利于促进蛋白质、核酸变性而沉淀，从而降低荚膜多糖溶液的蛋白质和核酸残留。

荚膜多糖为大分子物质，分离制备比单糖和小分子寡糖更加复杂。荚膜多糖的分离纯化过程中，主要杂质为蛋白质、核酸、内毒素等物质；另外，脆弱拟杆菌能同时表达多种类型的荚膜多糖且有的类型的荚膜多糖并不呈现所需的生物活性，这也为高纯度的活性荚膜多糖制备带来巨大挑战。出于安全性考虑，在荚膜多糖的制备过程中，应尽可能降低杂质、非目标荚膜多糖残留。此外，制备的荚膜多糖还需要保持其固有的天然结构，以保证其高免疫原性或其他生物活性。荚膜多糖的生物活性与其结构有明显的构效关系，电荷性质、官能团、分子量等均为影响荚膜多糖生物活性的基础。为此，本发明还进一步对如上所述的粗糖溶液进行纯化。

本发明提供的如上所述制备方法还包括对所述粗糖溶液进行超滤并收集截留液的步骤。该处超滤所采用的超滤膜的截留分子量可以为100KD、50KD、30KD、10KD、5KD、3KD或者任意两个分子量值之间的范围。

进一步地，本发明提供的所述制备方法还包括对所述截留液进行离子交换层析并对收集到的洗脱液进行超滤的步骤。优选地：所述离子交换层析为阴离子交换层析，例如可以采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析(16mm×200mm)；洗脱方式采用梯度洗脱，纯化洗脱液pH为5.0～9.0；洗脱液流速为15mL/min～25mL/min(例如15、20、25mL/min)。

为便于保存，本发明制备方法还可以对经过如上所述超滤等纯化步骤所得产物进行干燥(例如冷冻干燥)，获得荚膜多糖A干粉。

本发明提供的制备方法，对加热提取的加热方式不做特别限定，可以采用水浴加热、气浴加热、蒸汽加热等，当然也可以将两种以上的加热方式结合使用。可以理解的是，在加热提取的过程中，也可以附加一些辅助手段以提升提取效果，这些辅助手段包括但不限于超声、加压。

本发明制备方法中，对收集所述提取液所采用的收集方式不做特别限定，包括但不限于采用离心的方式收集所述提取液，离心的条件可以为20℃～30℃、11000g～13000g离心8min～12min。例如20℃下13000g离心8min、25℃下12000g离心10min、30℃下11000g离心12min。

本发明提供的制备方法，可用于从任意脆弱拟杆菌中提取荚膜多糖A，对具体脆弱拟杆菌菌株不做特别限定，例如可适用于保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌菌株。

下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例一、脆弱拟杆菌菌泥的制备

将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。

菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上37℃培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1mm-3mm之间，参见图1。

显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。

选取单个菌落接种于胰蛋白胨肉汤中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌ZY-312菌泥。

实施例二、脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法比较

采用实施例一制备得到的菌泥进行实验。

(1)方法1：采用本发明提供的方法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖A

①取50g菌泥(通过实施例1制备获得)，加入300g纯化水使菌体重悬，用1mol/L盐酸溶液调节其pH至3.5，100℃提取1.5h，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清，得到粗糖溶液。

②粗糖溶液经10KD超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；

③回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl(pH8.5)转盐；DEAE Sepharose FastFlow离子交换柱层析(16mm×200mm)，流速20mL/min，用含0.2mol/L氯化钠的20mmol/LTris-HCl(pH8.5)线性梯度洗脱25个柱体积(25个柱体积内，流动相中氯化钠浓度由0mol/L升至0.2mol/L)，分段收集，100mL/瓶(组分)，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，10KD超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干；

平行2次试验，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖A分别命名为“S1”和“S2”。

(2)方法2：采用苯酚/水法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖A

①取50g菌泥(通过实施例1制备获得)，加入0.15mol/L氯化钠溶液200mL，洗涤后12000g常温离心20min，收集菌泥；

②加入750mL纯化水，使菌体重悬，再加入等体积75％苯酚水溶液(m/m)，68℃搅拌提取30min，16000g室温离心30min，去沉淀；

③上清用等体积乙醚萃取3次，收集水相；水相经旋转蒸发仪浓缩，透析后冻干。

④上述样品用0.1mol/L乙酸钠溶液(含有10mmol/L CaCl

⑤沉淀中加入5％乙酸溶液复溶，100℃水解1h，透析除盐后，DEAE SepharoseFast Flow离子交换柱层析，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤除盐、冻干；平行2次试验，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖A分别命名为“S3”和“S4”。

(3)实验结果

两种制备方法所得脆弱拟杆菌荚膜多糖A的比较结果见表1。其中：

蛋白含量测试：中国药典(2020版)第四部<0731>蛋白质含量测定法-第四法2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法(BCA法)；

核酸含量测试：中国药典(2020版)第四部<0401>紫外-可见分光光度法；

结合脂含量测试：①称取荚膜多糖A10mg，加入2％的乙酸20ml，90℃回流加入2h，游离脂质；②加入正己烷50ml，充分震荡，吸取有机相，氮气吹干，萃取游离脂质；③加入4％氢氧化钠-甲醇溶液10ml，80℃下皂化1h；④加入正己烷10ml，充分震荡，吸取有机相，氮气吹干，萃取脂肪酸；⑤加入1％硫酸甲醇10ml，80℃反应30min，使脂肪酸甲酯化；⑥加入正己烷20ml，萃取脂肪酸甲酯，GC-MS分析。

荚膜多糖A粗品得率：得率＝冻干后粗品重量/菌泥质量×100％。

表1、两种制备方法所得脆弱拟杆菌荚膜多糖A的质量属性比较

本实施例中，方法1制备的荚膜多糖A(PSA)，其核磁共振波谱仪分析的1H谱见图3、13C谱见图4、COSY谱见图5、HSQC谱见图6、HMBC谱见图7、化学结构式见图8。

实施例三、菌泥混悬液pH对荚膜多糖A得率的影响

脆弱拟杆菌ZY-312经发酵，离心后，收集沉淀，为菌泥(通过实施例1制备获得)，-20℃保存。

取8份菌泥，每份10g，均加入50g纯化水使菌体重悬，分别调节其pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、6.5；

105℃加热提取60min，结束后立即取出，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清；

10KD超滤离心管浓缩除盐，冻干，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品。

不同pH条件下所得脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗糖的得率见表2。

不同提取液pH对脆弱拟杆菌荚膜多糖A纯品质量属性的影响见表3。

根据表2可知：在pH2.5～4.0范围内，脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗糖得率高于0.8％，pH2.0时得率为0.48％，pH5.0及以上，得率下降明显，因此脆弱拟杆菌荚膜多糖的制备过程中混悬液应控制pH在2.5～4.0。

根据表3可知：在pH2.5～4.0范围内，脆弱拟杆菌荚膜多糖A蛋白质含量为0.45～0.85％；核酸含量小于0.1％，结合脂质含量为0.05～0.25％，pH2.0时蛋白质含量0.45％，核酸含量0.07％，结合脂质含量0.01％。pH5.0及以上，蛋白质、核酸及结合脂质含量明显上升，尤其结合脂质升至1.89％。因此脆弱拟杆菌荚膜多糖的制备过程中混悬液应控制pH在2.5～4.0。

表2、提取液pH对脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品得率的影响

表3、提取液pH对脆弱拟杆菌荚膜多糖A纯品质量属性的影响

实施例四、提取温度对荚膜多糖A得率的影响

取8份菌泥(通过实施例1制备获得)，每份10g，分别加入50g纯化水使菌体重悬，均调节其pH至约3.5；

在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃下持续搅拌加热提取60min，结束后立即取出，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清；

10KD超滤离心管超滤除小分子杂质，冻干，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品。

不同提取温度条件下所得脆弱拟杆菌荚膜多糖A的得率见表4。

根据表4可知：在90℃～120℃温度范围内，脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗糖得率均高于0.80％，80℃及以下温度条件下，粗糖得率下降明显，因此脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备过程中应控制提取温度在90℃～120℃范围内，优选90℃～110℃。

表4、提取温度对脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品得率的影响

实施例五、提取时间对荚膜多糖A得率影响

取6份菌泥(通过实施例1制备获得)，每份10g，分别加入50g纯化水使菌体重悬，调节其pH至约4.0；

放入立式高压灭菌锅内，110℃温度下分别提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，结束后立即取出，冷却至室温，离心取上清；

10KD超滤离心管超滤除小分子杂质，冻干，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗品。

不同提取时间条件下所得脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗糖的得率见表5。

根据表5可知：提取时间为0.5h时，脆弱拟杆菌荚膜多糖粗糖得率为0.74％，在1.0h～2.5h提取时间范围内，得率均高于0.80％，当提取时间为3.0h时，得率下降，可能是荚膜多糖发生了降解。因此脆弱拟杆菌荚膜多糖的制备过程中的提取时间优选1.0h～2.5h。

表5、提取时间对脆弱拟杆菌荚膜多糖A粗糖得率的影响

实施例六、不同分子量分布的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备

(1)实验方法

采用本发明提供的方法制备不同分子量分布的脆弱拟杆菌荚膜多糖A，具体步骤如下：

①取100g发酵的ZY-312脆弱拟杆菌菌泥(通过实施例1制备获得)，加入纯化水500mL，搅拌均匀，1M盐酸溶液调节pH至3.0-3.1；

②100℃持续搅拌加热2h，冷却至室温，12000g常温离心10min，得上清500mL；

③加入5L纯化水，10KD超滤膜浓缩至约100mL；再次加入5L纯化水，超滤至100mL；重复3次，最后体积约100mL，电导率为25μs/cm；

④加入100mL 40mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)，混匀，过0.45μm滤膜；

⑤以20mL/min流速上样至离子交换层析柱(50mm×150mm，UniGel 80Q填料，苏州纳微)，20mmol/L的Tris-HCl淋洗2个柱体积；然后在25个柱体积内，含0.2M氯化钠的Tris-HCl(pH8.5)溶液梯度洗脱，即氯化钠浓度由0升至0.2M。

⑥分段收集洗脱物，共收集了3个组分，红外光谱鉴定，确定均为脆弱拟杆菌荚膜多糖A。

⑦各组分10KD滤膜超滤除盐，至100mL体积时电导率稳定，冻干，获得不同重均分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖A，分别为168mg、213mg、197mg；样品分别命为P1、P2、P3。

(2)实验结果

表6、不同重均分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖A

综上，采用本发明制备方法制备的荚膜多糖A：其分子量分布于70KD～100KD的部分占总量的70％～80％；分子量为80KD～90KD；其重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0～1.3；脂肪酸含量低于0.02％或者不含脂肪酸。本申请的上述工艺过程简化了脆弱拟杆菌荚膜多糖的制备工艺，不涉及苯酚、乙醚、乙醇等有机试剂的使用，绿色环保，可产业化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。