基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用

摘要

本发明提出基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用，通过对氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因设计全长扩增引物，获得最佳特异性引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2，该引物对可通过常规PCR获得待检测细菌的氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA全长，然后再与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因序列比对，判断是否有碱基突变，该方法操作步骤简单易行，该引物对扩增得到的基因片段特异性好，结果准确。

说明书

技术领域

本发明涉及环境和生物检测技术领域，特别涉及基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用。

背景技术

近年来，规模化畜禽养殖业的快速发展导致抗生素的使用量日益增加，抗生素常用于畜禽养殖中动物疾病的预防和治疗以及促进畜禽生长等目的，然而由于一些抗生素在动物体内吸收或者代谢不完全，最终以母体化合物或者代谢产物的形式通过尿液和粪便排出，导致环境中抗生素含量不断增加，而某些抗生素如氟喹诺酮类抗生素在环境中可稳定持留数月。有研究报道痕量抗生素足以对细菌形成选择压力，最终导致细菌耐药性的形成，对公共卫生安全构成严重威胁。因此，准确快速地检测环境中常见的病原微生物是否具有抗生素抗性十分有必要。

氟喹诺酮类抗生素为化学合成广谱抗菌药，氟喹诺酮类抗生素主要是通过与细菌DNA复制相关的DNA旋转酶A亚基(gyrase A，gyrA)特异性结合，抑制DNA旋转酶的活性，干扰细菌DNA形成超螺旋，阻碍DNA的正常功能从而发挥杀菌作用。

目前细菌产生氟喹诺酮类抗生素抗性的主要分子机制有以下几种：一种是质粒介导的抗性基因，如qnr家族基因和qepA基因，此类基因可通过荧光定量PCR技术进行快速检测；另一种是减少胞内氟喹诺酮类抗生素的积累，此项分子机制涉及到的相关基因众多，不具有特异性；最后是靶标基因DNA旋转酶A亚基的单碱基突变，导致DNA旋转酶A亚基的氨基酸编码发生错义突变，相应的蛋白构型发生改变，使其与氟喹诺酮类抗生素的结合能力变弱，进而产生氟喹诺酮类抗生素抗性。

而基于单碱基突变机制的研究主要通过全基因组测序进行探究，存在实验检测周期较长且耗费较大等不足。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，旨在特异性获得细菌的gyrA基因全长序列，并对其碱基突变位点进行分析，有助于快速判断菌株是否带有氟喹诺酮类抗生素抗性。

为实现上述目的，本发明提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，包括：

上游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

下游引物，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；下游引物的核苷酸序列为SEQID NO.2。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；

下游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的试剂盒，包括上述任意一项所述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对。

可选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和扩增缓冲液。

本发明还提出一种基于靶标基因单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法，包括：

使用上述任意一项所述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，或使用上述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的试剂盒对待检测细菌的基因组进行PCR扩增得到目的条带；

将所述目的条带进行测序，并与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的靶标基因序列进行比对，判断是否有突变碱基；

若有突变碱基，则待检测细菌为氟喹诺酮类抗生素抗性菌；

若没有突变碱基，则待检测细菌为氟喹诺酮类抗生素敏感菌。

本发明技术方案通过对氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因设计全长扩增引物，获得最佳特异性引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1，下游引物核苷酸序列为SEQID NO.2，该引物对可通过常规PCR获得待检测细菌的氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA全长，然后再与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因序列比对，判断是否有碱基突变，该方法操作步骤简单易行，该引物对扩增得到的基因片段特异性好，结果准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明的扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对扩增敏感型菌株的靶标基因产物电泳结果图；

图2为敏感型菌株的靶标基因序列与模式菌株的靶标基因序列比对结果；

图3为本发明的扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对扩增敏感型菌株和突变菌株的靶标基因产物电泳结果图；

图4为敏感型菌株和突变菌株的靶标基因序列与模式菌株的靶标基因序列比对结果；

图5为恩诺沙星和环丙沙星对敏感型菌株和突变菌株的最小抑制浓度实验结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，包括：

上游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

下游引物，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

氟喹诺酮类抗生素通过与细菌DNA复制相关的DNA旋转酶A亚基(gyrase A，gyrA)特异性结合，抑制DNA旋转酶的活性，干扰细菌DNA形成超螺旋，阻碍DNA的正常功能从而发挥杀菌作用。

靶标基因DNA旋转酶A亚基的单碱基突变，导致DNA旋转酶A亚基的氨基酸编码发生错义突变，相应的蛋白构型发生改变，使其与氟喹诺酮类抗生素的结合能力变弱，进而产生氟喹诺酮类抗生素抗性。

gyrA基因的全长序列如SEQ ID NO.3所示，基于gyrA基因的全长序列设计扩增引物，得到上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1(gyrA-F：5’-ATGAGCGACCTTGCGAGA-3’)，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2(gyrA-R：5’-TTATTCTTCTTCTGGCTCGTCG-3’)。该引物对可以扩增得到gyrA基因全长序列，通过将待检测细菌的gyrA基因全长序列与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因全长序列进行比对，就可以发现待检测细菌的gyrA基因全长序列是否有突变，从而判断待检测细菌是否为氟喹诺酮类抗生素抗性菌。

本发明技术方案通过对氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因设计全长扩增引物，获得最佳特异性引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1，下游引物核苷酸序列为SEQID NO.2，该引物对可通过常规PCR获得待检测细菌的氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA全长，然后再与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因序列比对，判断是否有碱基突变，该方法操作步骤简单易行，该引物对扩增得到的基因片段特异性好，结果准确。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；下游引物的核苷酸序列为SEQID NO.2。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；下游引物的核苷酸序列包括与SEQ ID NO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。

上述扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO.1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2为该引物对的最佳引物序列，PCR扩增效果好，无杂带。可以理解的是，PCR扩增中，引物与模板通过碱基互补配对原理一一结合，其中引物的核苷酸序列突变一个碱基不能与对应的模板位置结合并不影响扩增效果。

本发明还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的试剂盒，包括上述任意一项所述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对。

可选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和扩增缓冲液。

本发明还提出一种基于靶标基因单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法，包括：

使用上述任意一项所述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，或使用上述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的试剂盒对待检测细菌的基因组进行PCR扩增得到目的条带；

将所述目的条带进行测序，并与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的靶标基因序列进行比对，判断是否有突变碱基；

若有突变碱基，则待检测细菌为氟喹诺酮类抗生素抗性菌；

若没有突变碱基，则待检测细菌为氟喹诺酮类抗生素敏感菌。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对的设计

以NCBI公布的氟喹诺酮类抗生素敏感菌Escherichia coli K12 substr MG1655(GenBankNC_000913.3)的gyrA全长序列为参考，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物对，得到上游引物核苷酸序列为：gyrA-F：5’-ATGAGCGACCTTGCGAGA-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物核苷酸序列为：gyrA-R：5’-TTATTCTTCTTCTGGCTCGTCG-3’(SEQ ID NO.2)。

实施例2实施例1得到的引物对的特异性验证

以氟喹诺酮类抗生素敏感型模式菌株Escherichia coli K12的基因组DNA为模板，用实施例1设计得到的扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的上游引物和下游引物对其gyrA基因全长进行常规PCR扩增，PCR扩增反应体系总体积为50μl，具体为：

PCR扩增反应程序为：95℃，5min；95℃，1min；55℃，30s；72℃，3min；30个循环；72℃，10min；16℃保温。

PCR结束后，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％w/v)，采用凝胶成像系统观察凝胶上目的条带的情况，将其与NCBI中氟喹诺酮类抗生素敏感型模式菌株gyrA片段大小进行比较。

如图1所示，泳道1和泳道2分别代表Escherichia coli K12组和以水为模板的阴性对照组，其中泳道1中有目的条带扩增，大小在2628bp，与Escherichia coli K12菌株gyrA片段全长大小相一致，且目的条带单一性较好，无非特异性扩增结果出现，泳道2的阴性对照组无目的条带和引物二聚体出现。

随后，将PCR产物送至华大基因公司进行测序，使用DNAMAN软件将Escherichiacoli K12的基因组DNA的PCR扩增产物的测序结果与NCBI中Escherichia coli K12 substrMG1655模式菌株的gyrA基因进行比对分析，结果如图2所示，结果表明PCR产物与Escherichia coli K12 substr MG1655模式菌株的gyrA基因序列相似性为100％。由此表明该引物对的特异性较好，能够特异性地扩增gyrA的全长序列。

实施例3一种gyrA基因单碱基突变的快速检测方法

(1)获得待检测突变菌株Escherichia coli EM(菌株EM)和待检测突变菌株Escherichia coli CM(菌株CM)的基因组DNA。

(2)利用实施例1得到的特异性引物对，并按照实施例2中的PCR扩增反应体系与PCR扩增反应程序对待检测菌株EM和CM的gyrA基因全长进行扩增和测序，利用DNAMAN软件将EM和CM的gyrA基因全长与模式菌株Escherichia coli K12 substr MG1655的gyrA基因进行比对分析，获得待检测菌株gyrA基因上碱基突变位点信息，根据其碱基突变位点信息筛选氟喹诺酮类抗生素抗性菌株。

扩增结果如图3所示，泳道1～3分别代表Escherichia coli K12、突变菌株EM和突变菌株CM的gyrA基因PCR扩增产物，从图3中可以看出，泳道1～3使用实施例1的特异性引物对扩增gyrA基因获得的结果较好，无非特异性条带和引物二聚体出现，条带的大小也符合gyrA基因的全长大小。而在泳道4为阴性对照组，其中无目的条带出现，表明成功获得三株菌株的gyrA基因。

根据测序结果使用DNAMAN软件来进行序列比对，获得菌株EM和菌株CM的gyrA基因上碱基突变位点信息。序列比对结果如图4所示，图4中第一排序列为NCBI中模式菌株Escherichia coli K12 substr MG1655的gyrA基因序列，第二排为敏感型菌株Escherichia coli K12的gyrA基因测序结果，第三排为突变菌株CM的gyrA基因测序结果，第四排为突变菌株EM的gyrA基因测序结果，根据图4的比对结果可知，敏感型菌株未发生碱基突变，突变菌株EM的第260位碱基处发生了单碱基突变(A﹥G)，导致其第87位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，突变菌株CM的gyrA基因的第248位碱基处发生了单碱基突变(C﹥T)，导致其第83位氨基酸由丝氨酸突变为亮氨酸。因此通过上述方法可以检测氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因的单碱基突变，从而判断细菌是否具有氟喹诺酮类抗生素抗性。

实施例4待检测细菌的氟喹诺酮类抗生素抗性表型验证

采用2倍稀释法对敏感型菌株Escherichia coli K12、突变菌株EM和突变菌株CM的氟喹诺酮类抗生素的抗性进行测定，以恩诺沙星和环丙沙星两类氟喹诺酮类抗生素为例，结果如图5所示，恩诺沙星(标记为：ENR)和环丙沙星(标记为：CIP)对敏感型菌株Escherichia coli K12的最小抑制浓度分别为0.06mg/L和0.016mg/l，而其对突变菌株EM的最小抑制浓度分别为0.24mg/l和0.128mg/l，对突变菌株CM的最小抑制浓度分别为0.48mg/l和0.256mg/l。

相比较于敏感型菌株Escherichia coli K12，恩诺沙星和环丙沙星对突变菌株EM和突变菌株CM的最小抑制浓度均显著性升高，证明突变菌株EM和突变菌株CM为氟喹诺酮类抗生素抗性菌株，这与实施例3中gyrA基因碱基突变结果相一致，由此表明通过gyrA基因上单碱基突变位点信息可对氟喹诺酮类抗生素抗性菌株进行快速检测。

以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用

<130> CP121010523C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcgacc ttgcgaga 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttattcttct tctggctcgt cg 22

<210> 3

<211> 2628

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atgagcgacc ttgcgagaga aattacaccg gtcaacattg aggaagagct gaagagctcc 60

tatctggatt atgcgatgtc ggtcattgtt ggccgtgcgc tgccagatgt ccgagatggc 120

ctgaagccgg tacaccgtcg cgtactttac gccatgaacg tactaggcaa tgactggaac 180

aaagcctata aaaaatctgc ccgtgtcgtt ggtgacgtaa tcggtaaata ccatccccat 240

ggtgactcgg cggtctatga cacgatcgtc cgcatggcgc agccattctc gctgcgttat 300

atgctggtag acggtcaggg taacttcggt tctatcgacg gcgactctgc ggcggcaatg 360

cgttatacgg aaatccgtct ggcgaaaatt gcccatgaac tgatggccga tctcgaaaaa 420

gagacggtcg atttcgttga taactatgac ggcacggaaa aaattccgga cgtcatgcca 480

accaaaattc ctaacctgct ggtgaacggt tcttccggta tcgccgtagg tatggcaacc 540

aacatcccgc cgcacaacct gacggaagtc atcaacggtt gtctggcgta tattgatgat 600

gaagacatca gcattgaagg gctgatggaa cacatcccgg ggccggactt cccgacggcg 660

gcaatcatta acggtcgtcg cggtattgaa gaagcttacc gtaccggtcg cggcaaggtg 720

tatatccgcg ctcgcgcaga agtggaagtt gacgccaaaa ccggtcgtga aaccattatc 780

gtccacgaaa ttccgtatca ggtaaacaaa gcgcgcctga tcgagaagat tgcggaactg 840

gtaaaagaaa aacgcgtgga aggcatcagc gcgctgcgtg acgagtctga caaagacggt 900

atgcgcatcg tgattgaagt gaaacgcgat gcggtcggtg aagttgtgct caacaacctc 960

tactcccaga cccagttgca ggtttctttc ggtatcaaca tggtggcatt gcaccatggt 1020

cagccgaaga tcatgaacct gaaagacatc atcgcggcgt ttgttcgtca ccgccgtgaa 1080

gtggtgaccc gtcgtactat tttcgaactg cgtaaagctc gcgatcgtgc tcatatcctt 1140

gaagcattag ccgtggcgct ggcgaacatc gacccgatca tcgaactgat ccgtcatgcg 1200

ccgacgcctg cagaagcgaa aactgcgctg gttgctaatc cgtggcagct gggcaacgtt 1260

gccgcgatgc tcgaacgtgc tggcgacgat gctgcgcgtc cggaatggct ggagccagag 1320

ttcggcgtgc gtgatggtct gtactacctg accgaacagc aagctcaggc gattctggat 1380

ctgcgtttgc agaaactgac cggtcttgag cacgaaaaac tgctcgacga atacaaagag 1440

ctgctggatc agatcgcgga actgttgcgt attcttggta gcgccgatcg tctgatggaa 1500

gtgatccgtg aagagctgga gctggttcgt gaacagttcg gtgacaaacg tcgtactgaa 1560

atcaccgcca acagcgcaga catcaacctg gaagatctga tcacccagga agatgtggtc 1620

gtgacgctct ctcaccaggg ctacgttaag tatcagccgc tttctgaata cgaagcgcag 1680

cgtcgtggcg ggaaaggtaa atctgccgca cgtattaaag aagaagactt tatcgaccga 1740

ctgctggtgg cgaacactca cgaccatatt ctgtgcttct ccagccgtgg tcgcgtctat 1800

tcgatgaaag tttatcagtt gccggaagcc actcgtggcg cgcgcggtcg tccgatcgtc 1860

aacctgctgc cgctggagca ggacgaacgt atcactgcga tcctgccagt gaccgagttt 1920

gaagaaggcg tgaaagtctt catggcgacc gctaacggta ccgtgaagaa aactgtcctc 1980

accgagttca accgtctgcg taccgccggt aaagtggcga tcaaactggt tgacggcgat 2040

gagctgatcg gcgttgacct gaccagcggc gaagacgaag taatgctgtt ctccgctgaa 2100

ggtaaagtgg tgcgctttaa agagtcttct gtccgtgcga tgggctgcaa caccaccggt 2160

gttcgcggta ttcgcttagg tgaaggcgat aaagtcgtct ctctgatcgt gcctcgtggc 2220

gatggcgcaa tcctcaccgc aacgcaaaac ggttacggta aacgtaccgc agtggcggaa 2280

tacccaacca agtcgcgtgc gacgaaaggg gttatctcca tcaaggttac cgaacgtaac 2340

ggtttagttg ttggcgcggt acaggtagat gactgcgacc agatcatgat gatcaccgat 2400

gccggtacgc tggtacgtac tcgcgtttcg gaaatcagca tcgtgggccg taacacccag 2460

ggcgtgatcc tcatccgtac tgcggaagat gaaaacgtag tgggtctgca acgtgttgct 2520

gaaccggttg acgaggaaga tctggatacc atcgacggca gtgccgcgga aggggacgat 2580

gaaatcgctc cggaagtgga cgttgacgac gagccagaag aagaataa 2628