一种药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的检测方法

摘要

本发明提供一种药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的检测方法，包括：将药物制剂样品加入有机溶剂溶解，超声提取后冷却，摇匀，过滤，取续滤液获得的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，确定供试品溶液中人工牛黄的主要药效成分：胆酸、猪去氧胆酸的含量。本发明提供的一种药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的检测方法，精密度、重现性、稳定性良好，准确可靠，可真实反映药物制剂中人工牛黄的质量差异，全面完善药物制剂的质量控制体系。

说明书

技术领域

本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的 检测方法，具体涉及针对药物制剂中人工牛黄的主要药效成分：胆酸、猪去氧胆酸的检测方 法。

背景技术

药物制剂是70年代从宋代的苏合香丸的基础上改良而成，以其疗效肯定、安全经济而成 为目前冠心病最常用的治疗药物之一，它缓解症状起效迅速，没有硝酸酯类的禁忌症及耐药 性，长期服用可以保护血管，阻止动脉粥样硬化，减少心绞痛发作次数，减少严重心血管事 件的发生，其芳香温通，益气强心，临床上用于气滞血瘀所致的胸痹，症见心前区疼痛、固 定不移；心肌缺血所致的心绞痛、心肌梗死见上述症候者。因为疗效卓越、安全性高被列为 国家中药保密品种，受国家秘密技术保护，且被列名国家基本药物目录，荣获中国中西医结 合学会科学技术奖等众多荣誉。

药物制剂呈黑褐色有光泽的微丸，破碎后断面为棕黄色，味苦、辛凉，有麻舌感。药物 制剂由人工麝香、人参提取物、苏合香、人工牛黄、肉桂、蟾酥、冰片等7味中药组成，既含有非挥发性成分，又含有挥发性成分。其中，人工牛黄作为人工添加配比的中药材，其主要药效成分为胆汁酸类化合物，由于胆汁酸结构中缺乏共轭体系，无近紫外吸收特征,在常规 紫外检测器中难以检测出来。在前期人工牛黄质量标准研究中发现，胆酸与猪去氧胆酸作为 人工牛黄中重要化学组成和主要药效成分，具有解热镇痛、抗炎、利胆保肝、降压、镇咳、 强心等药理作用。所以本方法选取胆酸、猪去氧胆酸为药物制剂中人工牛黄含量测定的指标 性成分。因此，有必要对其进行检测，对人工牛黄进行质量控制，完善药物制剂的质量控制 体系。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种药物制剂中人工牛黄的主要 药效成分的检测方法，用于解决现有技术中缺乏对药物制剂的人工牛黄成分中主要药效成分： 胆酸、猪去氧胆酸的含量测定方法的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种药物制剂中人工牛黄的主要 药效成分的检测方法，包括：将药物制剂样品加入有机溶剂溶解，超声提取后冷却，摇匀， 过滤，取续滤液获得的供试品溶液，采用高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用(HPLC-ELSD)进行检测，确定供试品溶液中人工牛黄的主要药效成分：胆酸、猪去氧胆酸 的含量。

较佳地，所述胆酸的CAS号为81-25-4，所述猪去氧胆酸的CAS号为83-49-8。

较佳地，所述药物制剂样品为研细后的药物制剂粉末。

较佳地，所述药物制剂样品加入的质量与有机溶剂加入的体积之比为1:5-15，g/mL。优 选地，所述药物制剂样品加入的质量与有机溶剂加入的体积之比为1:10，g/mL。

较佳地，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇：5％甲酸水(95：5)，甲醇：5％甲酸水(80：20)中的一种。优选地，所述有机溶剂为甲醇。上述甲醇：5％甲酸水为两者体积比。 上述5％甲酸水为体积百分比为5％的甲酸水溶液。

较佳地，所述超声提取时间为10～30min。优选地，所述超声提取时间为10min。

较佳地，所述超声提取的功率为250-350W，所述超声提取的频率为35-45kHz。优选地， 所述超声提取的功率为300W，所述超声提取的频率为40kHz。

较佳地，所述药物制剂样品加入有机溶剂后，需精密称重。

较佳地，所述冷却后需再称重，并用有机溶剂补足失重。

较佳地，所述过滤是指：取摇匀后溶液的上清液过滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液。

更优选地，所述滤膜为0.45μm滤膜。

较佳地，所述采用高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用(HPLC-ELSD)进行检测，包 括以下步骤：

1)配制对照品溶液：将胆酸、猪去氧胆酸对照品，加入有机溶剂溶解并定容，配成对照 品溶液；

2)样品检测：采用高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用(HPLC-ELSD)分别检测供 试品溶液和步骤1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量， 确定供试品溶液中胆酸、猪去氧胆酸的含量。

优选地，步骤1)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇：5％甲酸水(95：5)，甲醇：5％甲酸水(80：20)中的一种。更优选地，所述有机溶剂为甲醇。

优选地，步骤1)中，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：胆酸为96.90-747.68μg/ml、 猪去氧胆酸为98.92-763.30μg/ml。

优选地，步骤1)中，所述对照品溶液采用逐级稀释制得。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中，采用检测器为蒸 发光散射检测器(ELSD)，蒸发温度为60-90℃，雾化器温度为40-70℃，氮气流速为 1.6-2.6SLM。更优选地，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中，采用检测器为蒸发 光散射检测器(ELSD)，蒸发温度为90℃，雾化器温度为60℃，氮气流速为1.6SLM。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的色谱柱为C

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的柱温为30～40℃。 更优选地，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的柱温为35℃。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的流速为 1.2～1.4ml/min。更优选地，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的流速为1.3ml/min。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的进样量为10～20μl。 更优选地，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中的进样量为15μl。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中，流动相为乙腈-0.1-0.3％甲酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1-0.3％甲酸水溶液；分析时间为35min；梯度洗脱。

更优选地，所述高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用中，流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶 液，其中，A相为乙腈，B相为0.2％甲酸水溶液；分析时间为35min；梯度洗脱。

上述0.1-0.3％甲酸水溶液为体积百分数为0.1-0.3％的甲酸水溶液。上述0.2％甲酸水溶液 为体积百分数为0.2％的甲酸水溶液。

更优选地，如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：

0～5min，A相：B相体积比为15：85-41：59；

5～25min，A相：B相体积比为41：59-44：56；

25～28min，A相：B相体积比为44：56-100：0；

28～35min，A相：B相体积比为100：0-100：0。

表1

优选地，步骤2)中，所述外标法包括以下步骤：

A)按步骤1)制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行HPLC-ELSD检测，获 得胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积对数值与对应胆酸、猪去氧胆酸的质量(μg) 对数值之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到胆酸、猪去氧胆酸 的标准工作曲线的回归方程；

B)将供试品溶液进行HPLC-ELSD检测，将获得的胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积对数值，代入步骤A)中相应的胆酸、猪去氧胆酸的标准工作曲线的回归方程， 计算得到供试品溶液中胆酸、猪去氧胆酸的含量。

更优选地，所述标准工作曲线中，以胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积对数值为纵坐标(Y 轴)，其相应异胆酸、猪去氧胆酸的质量(μg)对数值为横坐标(X轴)。

本发明第二方面提供一种药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的检测方法在药物制剂中 人工牛黄的质量检测中的用途。

所述药物制剂为含有人工牛黄的药物制剂，具体包括且不限于麝香保心丸等。

本发明第三方面提供一种药物制剂中人工牛黄的质量检测方法，所述药物制剂中含人工 牛黄以胆酸和猪去氧胆酸计≥0.257％。

较佳地，所述药物制剂以每丸重22.5mg计时，所述药物制剂每丸含人工牛黄以胆酸和猪 去氧胆酸的总量计≥58μg。

如上所述，本发明提供的一种药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的检测方法，采用优 化条件的前处理和仪器检测方法，对药物制剂的人工牛黄成分中主要药效成分：胆酸、猪去 氧胆酸进行准确的定量定性检测。该种方法针对药物制剂中无紫外吸收的胆汁酸类成分建立 含量测定方法，精密度、重现性、稳定性良好，准确可靠，可真实反映药物制剂中人工牛黄 的质量差异，确保批次间生产工艺与质量的稳定性，作为现行质量控制标准的补充和提高， 全面完善药物制剂的质量控制体系。

附图说明

图1显示为本发明中人工牛黄的主要药效成分：胆酸、猪去氧胆酸的对照品与供试品的 高效液相色谱图1a、1b，其中，图1a为对照品的高效液相色谱图，图1b为供试品的高效液 相色谱图；附图标记a为胆酸，b为猪去氧胆酸。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

药物制剂(上海和黄药业有限公司)；胆酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号： 100078-201415，纯度为98.9％)；猪去氧胆酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100087-201411，纯度为99.70％)；乙腈(色谱级，TEDIA)；甲酸(色谱级，CNW)；乙醇 (分析纯，上海展云化工有限公司)；去离子水(Mili-Q超纯水仪制备)。

2、仪器

1260高效液相色谱仪，配置在线真空脱气机、自动进样器、四元泵、DAD检测器、恒温柱温箱；Agilent ChemStation C 01.05色谱工作站(美国Agilent公司)；1260InfinityELSD 蒸发光散射检测器(美国Agilent公司)；SB-5200超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有 限公司)；Mili-Q超纯水仪(Milipore公司)。

对于药物制剂中人工牛黄的主要药效成分的含量，包括以下的测定过程。

1、供试品溶液的制备

将药物制剂样品研细成粉末，加入有机溶剂溶解，精密称重。其中，药物制剂样品加入 的质量与有机溶剂加入的体积之比为1:5-15，g/mL。再在功率为250-350W、频率为35-45kHz 下进行超声提取10～30min。冷却，再称重，并用有机溶剂补足失重。摇匀，取上清液过0.45μm 滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液，为供试品溶液。上述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇： 5％甲酸水(95：5)，甲醇：5％甲酸水(80：20)中的一种。

2、对照品溶液的制备

将胆酸、猪去氧胆酸对照品，加入有机溶剂溶解并定容，配成对照品溶液。对照品溶液 中各成分的含量范围为：胆酸为96.90-747.68μg/ml、猪去氧胆酸为98.92-763.30μg/ml。

上述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇：5％甲酸水(95：5)，甲醇：5％甲酸水(80：20)中的一种。

3、测定

采用高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用(HPLC-ELSD)分别检测供试品溶液和一系 列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。即将一系列不同 浓度的对照品溶液分别进行HPLC-ELSD检测，获得胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积对数值 与对应胆酸、猪去氧胆酸的质量(μg)对数值之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计 算得到胆酸、猪去氧胆酸的标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液进行HPLC-ELSD检 测，将获得的胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积对数值，代入相应的胆酸、猪去氧胆酸的标准 工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中胆酸、猪去氧胆酸的含量。

其中，高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用包括以下检测条件：

检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)，蒸发温度为60-90℃，雾化器温度为40-70℃，氮 气流速为1.6-2.6SLM；色谱柱为C

梯度洗脱的具体程序为：

0～5min，A相：B相体积比为15：85-41：59；

5～25min，A相：B相体积比为41：59-44：56；

25～28min，A相：B相体积比为44：56-100：0；

28～35min，A相：B相体积比为100：0-100：0。

实施例1

1、供试品溶液的制备

将药物制剂样品120丸研细成粉末，取1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 10ml溶解，密塞，精密称重。再在功率为300W、频率为40kHz下进行超声提取10min。冷却，再称重，并用甲醇补足失重。摇匀，取上清液过0.45μm滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液，为供试品溶液1#。

2、对照品溶液的制备

将胆酸、猪去氧胆酸对照品，加入甲醇溶解并定容，配成对照品溶液1#。对照品溶液1# 中各成分的含量范围为：胆酸为96.90-747.68μg/ml、猪去氧胆酸为98.92-763.30μg/ml。

3、测定

采用高效液相色谱—蒸发光散射检测器联用(HPLC-ELSD)分别检测供试品溶液1#和一 系列不同浓度的对照品溶液1#，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。即将一系列 不同浓度的对照品溶液1#分别进行HPLC-ELSD检测，获得胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积 对数值与对应胆酸、猪去氧胆酸的质量(μg)对数值之间线性关系，绘制相应的标准工作曲 线，计算得到胆酸、猪去氧胆酸的标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液1#进行 HPLC-ELSD检测，将获得的胆酸、猪去氧胆酸的色谱峰面积对数值，代入相应的胆酸、猪去 氧胆酸的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液1#中胆酸、猪去氧胆酸的含量。

其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：

检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)，蒸发温度为90℃，雾化器温度为60℃，氮气流速 为1.6SLM；色谱柱为Kromasil C

梯度洗脱的具体程序为：

0～5min，A相：B相体积比为15：85-41：59；

5～25min，A相：B相体积比为41：59-44：56；

25～28min，A相：B相体积比为44：56-100：0；

28～35min，A相：B相体积比为100：0-100：0。

实施例2

取批号H160350的药物制剂样品，采用实施例1中的步骤1中配制供试品溶液。同时， 按实施例1中的步骤2中配制对照品溶液，其中，对照品溶液中胆酸含量为0.3mg/ml、猪去 氧胆酸含量为0.25mg/ml。分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液15μl，注入液相 色谱仪，按实施例1中步骤2进行测定，比较保留时间进行定性，具体见图1，确定供试品溶液中胆酸、猪去氧胆酸的出峰情况，具体数据见表2。

表2

实施例3

对本发明的药物制剂中人工牛黄的2种主要药效成分的检测方法进行方法学验证，其性 能指标结果如下。

1、精密度

取药物制剂(批号：H160350)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，精密吸取同 一供试品溶液15μl注入气相色谱仪，按实施例1中步骤3的色谱条件，连续进样分析6次，测定峰面积，并计算胆酸、猪去氧胆酸的含量，精密度具体结果见表3。结果表明，2种成分的色谱峰面积RSD均小于1％，说明该方法精密度良好。

表3

2、重复性

取同一批药物制剂(批号：H160350)6份，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，精密吸取供试品溶液15μl注入气相色谱仪，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，测定峰面积，重复性具体结果见表4。结果表明，2种成分的色谱峰面积RSD均小于2.1％， 说明该方法重复性良好。

表4

3、稳定性

取药物制剂(批号：H160350)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，精密吸取同 一供试品溶液15μl注入气相色谱仪，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别于0、4、8、12、24、36h进样分析，测定峰面积，并计算胆酸、猪去氧胆酸的含量，稳定性具体结果见表5。 结果表明，2种成分的色谱峰面积RSD均小于2％，供试品溶液在0～36小时内基本稳定， 说明该方法稳定性良好。

表5

4、检测方法的线性关系

分别精密称取胆酸、猪去氧胆酸对照品适量，按实施例1中步骤2加甲醇配成一系列不 同浓度的对照品溶液。按实施例1中步骤3的色谱条件，精密吸取10μl对照品溶液注入气相 色谱仪，以对照品溶液质量(μg)对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标作图，测定并计 算获得2种成分的标准回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表6。根据表6可知，2 种成分在考察浓度范围内线性关系良好(r

表6

5、回收率

精密称取6份已知浓度的取药物制剂(批号：H160350)0.5g，分别准确加入一定量的2 种成分对照品的甲醇溶液10ml，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中 步骤3的色谱条件，分别进样分析，结果见表7。由表7可知，胆酸、猪去氧胆酸的平均加样回收率结果分别为103.43％、100.13％，RSD值分别为1.42％、1.32％，其测定结果的回收率良好，说明本方法的准确度较好。

表7

6、检测限(LOD)和定量限(LOQ)

检测限(LOD)是信噪比(S/N)为3时的被测物质浓度；定量限(LOQ)是信噪比(S/N)为10时的被测物质浓度。结果见表8，胆酸、猪去氧胆酸的LOD分别为3.3μg/ml、2.8μg/ml；LOQ为5.3μg/ml、6.0μg/ml。

表8

实施例3

收集2015至2018年生产的75批次药物制剂样品(150104～180105)，按照按实施例1 中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，进行检测。75批次药物制剂的含量测定结果如表9所示，胆酸和猪去氧胆酸的总含量为0.39％～0.61％。按照从人工 牛黄药材到成品药物制剂的胆酸和猪去氧胆酸的转移率计算，若人工牛黄药材含量到达药典 标准时，药物制剂中最低胆酸和猪去氧胆酸的总量为0.367％，在此基础上我们按70％进行最 低限度设定，即药物制剂中胆酸和猪去氧胆酸最低限度为0.257％。根据药物制剂每丸重22.5mg进行折算，即本品每丸含人工牛黄以胆酸和猪去氧胆酸的总量计，不得少于58μg。

表9

综上所述，本发明提供的一种药物制剂中冰片和人工麝香的主要活性成分的检测方法， 精密度、重现性、稳定性良好，准确可靠，可真实反映药物制剂中人工麝香、冰片的质量差 异，作为现行质量控制标准的补充和提高。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点 而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。