一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法

摘要

本发明提供了一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法，属于药物分析技术领域。本发明采用高效液相色谱法进行检测，通过精确控制检测条件，选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，控制流动相的组成和比例，同时采用梯度洗脱方法，控制梯度洗脱程序，能够检测盐酸羟考酮液体制剂中降解产生的杂质二聚体的含量，检测的方法灵敏度高，专属性强，能确保盐酸羟考酮液体制剂中的基因毒性杂质二聚体有效检出，为该类药物的产品质量控制提供了强有力的控制策略，从而为产品质量安全有效提供了保证。而且，本发明的检测方法准确、稳定、耐用，科学可靠，可以较好测定羟考酮液体制剂中羟考酮羟醛二聚体含量。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法。

背景技术

盐酸羟考酮液体类制剂中主要活性成分为羟考酮盐酸盐，羟考酮的化学名称为7,8-二氢-14-羟可待因酮，分子式：C

羟考酮最早于1916年在德国由蒂巴因生产，它是一种非专利药物。2017年，它是美国第52大最常用的处方药，有超过1500万张处方药。与现在有一些阻止滥用的制剂，例如与纳洛酮联合使用，它是一种阿片类药物，用于治疗中度至重度疼痛，也是市场上一种常见的术中或治疗癌性疼痛的麻醉镇痛药物。它通常口服，缓解疼痛的发作通常在15分钟内开始，并且使用立即释放的配方持续长达6小时。在英国，可以通过注射的方式获得，还有一些口服溶液剂产品上市使用，使用组合产品也可与对乙酰氨基酚(对乙酰氨基酚)、布洛芬、纳洛酮和阿司匹林一起使用。

盐酸羟考酮液体制剂作为一种镇痛药物，在产品的质量开发过程中，由于高浓度的羟考酮存在，在光照和长期常温条件下放置可能会进一步缩合形成杂质羟醛二聚体(Oxycodone Aldol Dimer)，从目前此杂质的药理毒理试验文献资料获悉，此杂质可能是毒性杂质，可能产生遗传毒性，此杂质超过一定的限度将对人体产生较大的伤害，该羟醛二聚体的产生转化缩合过程如下式所示：

根据国际人用注册协调会(ICH)Q3A要求和国家药品监督管理总局对药物安全有效、质量可控的药物申报的总体要求及根据药物质量研究的相关指导原则，应对药品的相关杂质进行有效的控制，以保证产品质量可控，但上述降解杂质羟醛二聚体大分子量的极性化合物，不适合采用普通的等度洗脱方式的方法进行检测，因极不容易与主成分羟考酮分离，或分离后极容易造成峰严重拖尾，进而影响检测样品的灵敏度。因此，有必要开发建立一种耐用的杂质定量准确性高且峰对称性好、指示性高的检测羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法，所述检测方法准确、简便且耐用、杂质定量准确性高且峰对称性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法，包括以下步骤：

提供供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液；所述供试品溶液为羟考酮液体制剂；所述对照品溶液为供试品溶液的稀释溶液，所述对照品溶液中羟考酮的浓度为50～100μg/mL；所述灵敏度溶液为供试品溶液的稀释溶液，所述灵敏度溶液中羟考酮的浓度≤30μg/mL；

将所述供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液分别进行高效液相色谱检测，得到供试品色谱图、对照品色谱图和灵敏度色谱图，使得灵敏度色谱图中羟考酮色谱峰峰高的信噪比≥10，对照色谱图中羟考酮色谱峰拖尾因子为0.8～1.5；采用外标法或自身对照法对羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量进行定量，从而检测得到羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体的真实含量；

所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱；

柱温：55～60℃；

流动相：以辛烷磺酸钠缓冲溶液-乙腈混合物为流动相A，以乙腈-水混合物为流动相B；

采用所述流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：

流速：使羟考酮的峰保留时间为6.8～7.2min；

检测器：紫外检测器，检测波长为280nm；

进样量：10μL。

优选的，所述羟考酮液体制剂包括羟考酮口服溶液剂或者羟考酮注射剂。

优选的，所述供试品溶液的浓度为10～20mg/mL。

优选的，所述对照品溶液和灵敏度溶液的制备过程独立为：将稀释剂与供试品溶液混合，得到对照品溶液或灵敏度溶液。

优选的，所述稀释剂包括质量分数为0.85％的磷酸水溶液、质量分数为0.85％的硫酸水溶液、浓度为0.01～0.03mol/L的盐酸水溶液或浓度为0.01～0.03mol/L醋酸水溶液。

优选的，所述流动相A中辛烷磺酸钠缓冲溶液的制备过程为：将磷酸二氢铵、无水辛烷磺酸钠、三乙胺和水混合，再用磷酸调节pH值至1.95～2.05。

优选的，所述辛烷磺酸钠缓冲溶液的浓度为0.02～0.04mol/L。

优选的，所述流动相A中辛烷磺酸钠缓冲溶液和乙腈的体积比为(1050～1155):(95～200)；

优选的，所述流动相B中乙腈和水的体积比为400:100。

优选的，所述色谱柱的规格为Waters C8

本发明提供了一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法，本发明采用高效液相色谱法进行检测，通过精确控制检测条件，选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，控制流动相的组成和比例，同时采用梯度洗脱方法，控制梯度洗脱程序，能够检测盐酸羟考酮液体制剂(包括口服溶液剂或注射剂)中降解产生的杂质二聚体的含量，检测的方法灵敏度高，专属性强，能确保盐酸羟考酮液体制剂中的基因毒性杂质二聚体有效检出，且杂质定量的准确性和峰对称性有较大改善，为该类药物的产品质量控制提供了强有力的控制策略，从而为产品质量安全有效提供了保证。

与现有的检测技术(盐酸羟考酮注射液进口注册标准)比较，本发明提供的检测方法提高了目标检测物质羟醛二聚体的检测的灵敏度；检测目标物质的色谱峰的峰参数有较大的改善，杂质与活性成分羟考酮的峰对称性更好，对于杂质的定量更加准确可靠；本发明采用梯度洗脱方法分析的时间更短，极大的提高了检测效率，方法的优异性能得到较好的表现。

本发明的检测方法耐用性较好，略微改变色谱流动相和色谱柱温，色谱柱流速等参数，不会造成检测的目标峰与其他杂质分离不开，或者峰参数不符合目标要求等情况，而现有的检测方法(盐酸羟考酮注射液进口注册标准)，色谱体系较为脆弱，稍微改变色谱条件，会出现检测灵敏度下降等情况产生，其检测方法的条件较为苛刻。

本发明的检测方法的重现性和重复性良好，有利于生产效率的提升。

附图说明

图1为对比例1中供试品原液色谱图；

图2为对比例1中对照溶液色谱图；

图3为A组盐酸羟考酮线性回归图；

图4为B组盐酸羟考酮线性回归图；

图5为A组羟考酮羟醛二聚体线性回归图；

图6为B组羟考酮羟醛二聚体线性回归图；

图7为二聚体方法学-溶液稳定性-供试溶液0小时样品色谱图；

图8为二聚体方法学-溶液稳定性-供试溶液6小时样品色谱图；

图9为二聚体方法学-溶液稳定性-供试溶液9小时样品色谱图；

图10为二聚体方法学-溶液稳定性-供试溶液12小时样品色谱图；

图11为二聚体方法学-溶液稳定性-供试溶液17小时样品色谱图；

图12为二聚体方法学-溶液稳定性-供试溶液24小时样品色谱图；

图13为二聚体方法学-耐用性试验-正常条件自身对照色谱图；

图14为二聚体方法学-耐用性试验二聚体对照溶液色谱图；

图15为二聚体方法学-耐用性试验-供试品溶液色谱图；

图16为二聚体方法学-耐用性试验-波长278nm供试色谱图；

图17为二聚体方法学-耐用性试验-波长282nm供试色谱图；

图18为二聚体方法学-耐用性试验-柱温58℃供试色谱图；

图19为二聚体方法学-耐用性试验-柱温62℃供试色谱图；

图20为二聚体方法学-耐用性试验-低流速(1.2mL/min)供试色谱图；

图21为二聚体方法学-耐用性试验-高流速(1.4mL/min)供试色谱图；

图22为二聚体方法学-耐用性试验-pH1.95供试色谱图；

图23为二聚体方法学-耐用性试验-不同色谱柱供试色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量的检测方法，包括以下步骤：

提供供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液；所述供试品溶液为羟考酮液体制剂；所述对照品溶液为供试品溶液的稀释溶液，所述对照品溶液中羟考酮的浓度为50～100μg/mL；所述灵敏度溶液为供试品溶液的稀释溶液，所述灵敏度溶液中羟考酮的浓度≤30μg/mL；

将所述供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液分别进行高效液相色谱检测，得到供试品色谱图、对照品色谱图和灵敏度色谱图，使得灵敏度色谱图中羟考酮色谱峰峰高的信噪比≥10，对照色谱图中羟考酮色谱峰拖尾因子为0.8～1.5；采用外标法或自身对照法对羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量进行定量，从而检测得到羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体的真实含量；

所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱；

柱温：55～60℃；

流动相：以辛烷磺酸钠缓冲溶液-乙腈混合物为流动相A，以乙腈-水混合物为流动相B；

采用所述流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：

流速：使羟考酮的峰保留时间为6.8～7.2min；

检测器：紫外检测器，检测波长为280nm；

进样量：10μL。

在本发明中，若无特殊说明，所需原料或仪器均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明提供供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液。在本发明中，所述供试品溶液为羟考酮液体制剂；所述羟考酮液体制剂优选包括羟考酮口服溶液剂或者羟考酮注射剂。在本发明中，所述供试品溶液的浓度优选为10～20mg/mL，更优选为15mg/mL。本发明对所述羟考酮液体制剂的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品均可；在本发明的实施例中，所述羟考酮液体制剂为

在本发明中，所述对照品溶液为供试品溶液的稀释溶液，所述对照品溶液中羟考酮的浓度为50～100μg/mL；所述对照品溶液的制备过程优选为：将稀释剂与供试品溶液混合，得到对照品溶液。在本发明中，所述稀释剂优选包括质量分数为0.85％的磷酸水溶液、质量分数为0.85％的硫酸水溶液、浓度为0.01～0.03mol/L的盐酸水溶液或浓度为0.01～0.03mol/L醋酸水溶液。本发明对将所述稀释剂与供试品溶液混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程混合均匀且能够得到上述浓度的对照品溶液即可。

在本发明中，所述灵敏度溶液为供试品溶液的稀释溶液，所述灵敏度溶液中羟考酮的浓度≤30μg/mL，更优选为1.5μg/mL；所述灵敏度溶液的制备过程优选为：将稀释剂与供试品溶液混合，得到灵敏度溶液。在本发明中，所述稀释剂优选包括质量分数为0.85％的磷酸水溶液、质量分数为0.85％的硫酸水溶液、浓度为0.01～0.03mol/L的盐酸水溶液或浓度为0.01～0.03mol/L醋酸水溶液。本发明对将所述稀释剂与供试品溶液混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程混合均匀且能够得到上述浓度的灵敏度溶液即可。

得到供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液后，本发明将所述供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液分别进行高效液相色谱检测，得到供试品色谱图、对照品色谱图和灵敏度色谱图，使得灵敏度色谱图中羟考酮色谱峰峰高的信噪比≥10，对照色谱图中羟考酮色谱峰拖尾因子为0.8～1.5；采用外标法或自身对照法对羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体含量进行定量，从而检测得到羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体的真实含量。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱；

柱温：55～60℃；

流动相：以辛烷磺酸钠缓冲溶液-乙腈混合物为流动相A，以乙腈-水混合物为流动相B；

采用所述流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：

流速：使羟考酮的峰保留时间为6.8～7.2min；

检测器：紫外检测器，检测波长为280nm；

进样量：10μL。

在本发明中，所述色谱柱的规格优选为Waters C8

在本发明中，所述柱温优选为56～58℃。

在本发明中，所述流动相A中辛烷磺酸钠缓冲溶液的制备过程优选为：将磷酸二氢铵、无水辛烷磺酸钠、三乙胺和水混合，再用磷酸调节pH值至1.95～2.05。在本发明中，所述磷酸二氢铵、无水辛烷磺酸钠和三乙胺的用量比优选为18.4g：3.99g：4mL；所述水的用量优选使得混合所得溶液稀释至3520mL。本发明对使用磷酸调节pH值的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。在本发明中，所述辛烷磺酸钠缓冲溶液的浓度优选为0.02～0.04mol/L，更优选为0.03mol/L。

在本发明中，所述流动相A中辛烷磺酸钠缓冲溶液和乙腈的体积比优选为(1050～1155):(95～200)，更优选为(1100～1150):(100～180)，进一步优选为1100:150；

在本发明中，所述流动相B中，乙腈和水的体积比优选为400：100。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的过程中，利用所述流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序优选为：

在本发明中，所述流动相的流速使羟考酮的峰保留时间为6.8～7.2min即可，更优选为7.0min；本发明对控制流速的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程控制流速即可。

在本发明中，所述高效液相色谱检测所用检测器为紫外检测器，检测波长为280nm；本发明对所述检测器的具体型号没有特殊的限定，本领域熟知的检测器即可。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的进样量为10μL。

在本发明中，所述高效液相色谱检测所用色谱仪优选为沃特世E2695或安捷伦1290色谱仪。

在本发明中，采用外标法进行羟醛二聚体定量的过程优选采用杂质对照品进行杂质的定量，杂质定量计算方法如公式(1)：

W％＝(C

公式(1)中，W％表示的是杂质羟醛二聚体的含量；

C

A

A

C

在本发明中，采用自身对照法进行羟醛二聚体定量优选采用加入校正因子的方法进行定量，杂质定量计算方法如公式(2)：

计算杂质：W％＝(C

公式(2)中，W％表示杂质羟醛二聚体的含量；

C

A

A

C

F-表示杂质相对盐酸羟考酮的相对校正因子，RRF(即响应因子的倒数)。

在本发明中，灵敏度色谱图中羟考酮色谱峰峰高的信噪比≥10，对照色谱图中羟考酮色谱峰拖尾因子为0.8～1.5。本发明对通过调整参数满足灵敏度色谱图中羟考酮色谱峰峰高的信噪比≥10，对照色谱图中羟考酮色谱峰拖尾因子为0.8～1.5的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程改变供试品的浓度或改变高效液相色谱检测的条件即可。

本发明对检测得到羟考酮液体制剂中降解杂质羟醛二聚体的真实含量的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

供试品溶液：市售盐酸羟考酮注射液(标示量：100.5％，规格：10mg:1mL)；

对照品溶液：将所述供试品溶液使用质量分数为0.85％的磷酸水溶液稀释成每1mL含盐酸羟考酮50μg的溶液，作为对照品溶液；

灵敏度溶液：将所述供试品溶液用质量分数为0.85％的磷酸水溶液稀释成每1mL含盐酸羟考酮1.5μg的溶液，作为灵敏度溶液；

高效液相色谱仪：安捷伦1290色谱仪；

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱，色谱柱规格为WatersC8

流动相：以辛烷磺酸钠缓冲溶液-乙腈(体积比为1100：150)为流动相A，乙腈-水(体积比为400：100)为流动相B；

所述辛烷磺酸钠缓冲溶液的制备过程为：将磷酸二氢铵18.4g、无水辛烷磺酸钠3.99g和三乙胺4mL加水稀释溶解至3520mL，再用磷酸调节pH值至2.0；辛烷磺酸钠溶液缓冲溶液的浓度为0.03mol/L；

高效液相色谱检测采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示：

表1实施例1中高效液相色谱检测的梯度洗脱程序

检测器：紫外检测器，检测波长：280nm；

柱温：60℃

样品进样量：10μL；

采用以上方法调节流速使主成分羟考酮的峰保留时间约为7分钟，精密量取供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液中杂质限度：降解成分羟醛二聚体所占有的比例不得超过羟考酮含量的0.5％(质量百分比)；

杂质限度的定量方法(采用自身对照法+校正因子的方法)：采用杂质对照品进行杂质的定量，杂质定量计算方法如公式(1)：

W％＝(C

公式(1)中，W％表示的是杂质羟醛二聚体的含量；

C

A

A

C

在本发明中，采用自身对照法进行羟醛二聚体定量优选采用加入校正因子的方法进行定量，杂质定量计算方法如公式(2)：

计算杂质：W％＝(C

公式(2)中，W％表示杂质羟醛二聚体的含量；

C

A

A

C

F-表示杂质相对盐酸羟考酮的相对校正因子，RRF(即响应因子的倒数)

灵敏度溶液色谱图中主成分色谱峰峰高的信噪比≥10，对照溶液色谱图中主成分(羟考酮)色谱峰拖尾因子在0.8～1.5之间；供试品溶液色谱图中若有与主成分对保留时间在2.17～2.21倍的色谱峰，其峰面积大于对照溶液色谱图的主峰面积(0.5％)。

对比例1

采用盐酸羟考酮注射液进口注册标准(JX20160245)中羟考酮羟醛二聚体的检测方法对样品进行检测，比较自制制剂(自制盐酸羟考酮注射液)和参比制剂(市售进口盐酸羟考酮注射液)中羟醛二聚体的含量，其中，供试品溶液：即盐酸羟考酮注射液(lot：BM201，持证商：NAPPPHARMACEUTICALS LIMITED，规格1mL:10mg)；具体检测条件见表1：

表1进口药品注册标准(JX20160245)羟醛二聚体检测方法

采用表1所述检测方法对盐酸羟考酮原料药(盐酸羟考酮，批号：15-0072，供应商：Macfarlan Smith Limited，UK)、自制制剂及参比制剂进行检测，样品检测图谱见1～2，检测结果如下：

表2原料药、参比制剂及自制制剂中二聚体检测结果汇总表

由表2和图1～2可知，按照进口注册标准对盐酸羟考酮原料药、自制产品、参比制剂进行羟醛二聚体检测，结果羟醛二聚体及羟考酮色谱峰对称性差，两色谱峰均出现了严重的拖尾现象，导致测定结果出现偏差；该方法检测时间较长，接近60分钟。

方法验证

1、线性与范围

1.1盐酸羟考酮的线性

取盐酸羟考酮对照品(盐酸羟考酮，批号：15-0072，供应商：Macfarlan SmithLimited，UK)10mg，精密称定，置于20mL量瓶，加稀释剂(质量分数0.85％的磷酸水溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备溶液。

精密量取线性贮备溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL分别置于5个10mL量瓶中，加上述稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别作为1～5号线性溶液。

精密移取上述1～5号线性溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

上述过程分别由两个试验人员A和B，使用不同的高效液相色谱仪(沃特世E2695或安捷伦1290色谱仪)独立进行试验，分别记为A组和B组。线性溶液稀释过程和试验结果见表3～5：

表3盐酸羟考酮线性溶液制备过程

表4盐酸羟考酮线性试验结果(试验人员A，沃特世E2695)

表5盐酸羟考酮线性试验结果(试验人员B，安捷伦1290色谱仪)

1.2羟醛二聚体的线性

取羟考酮羟醛二聚体对照品(批号：YGY-P1，来源：上海医药工业研究院有限责任公司)10mg，精密称定，置20mL量瓶，加稀释剂(质量分数0.85％的磷酸水溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为羟醛二聚体线性贮备溶液。

精密量取上述羟醛二聚体线性贮备溶液0.03mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL分别置于6个10mL量瓶中，加上述稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别作为1～6号线性溶液。

各精密移取上述1～6号线性溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。上述过程分别在不同时间，由两个试验人员A合B，使用不同的高效液相色谱仪独立进行试验，分别记为A组和B组，线性溶液稀释过程见表6：

表6羟醛二聚体线性溶液制备过程

以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别对A组和B组进行线性曲线绘制，试验结果分别见表7和表8：

表7羟醛二聚体线性试验结果(试验人员A，沃特世E2695)

表8羟醛二聚体线性试验结果(试验人员B，安捷伦1290色谱仪)

其中，上述盐酸羟考酮和羟醛二聚体的线性回归图分别见图3～6，其具体数值见表9：

表9羟醛二聚体校正因子的计算

由图3～6和表4～5以及表7～9可知：羟醛二聚体浓度在1.3～65μg/mL范围内，其线性回归方程相关系数为1.0；盐酸羟考酮浓度在4.7～71μg/mL范围内，其线性回归方程相关系数为1.0，两成分在上述浓度范围内样品浓度与峰面积线性关系良好。羟醛二聚体与盐酸羟考酮平均校正因子为1.07，在0.8～1.2范围内，可以采用自身对照法进行羟考酮羟醛二聚体杂质含量计算。

2、定量限及检测限试验

2.1定量限

精密移取上述1.2中羟醛二聚体对照品贮备溶液0.03mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为羟醛二聚体定量限溶液。按照上述1.2的方法平行制备6份样品溶液(分别记为1S～6S)，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，所得数据如表10所示。

表10定量限试验结果汇总表

2.2检测限

精密移取上述羟醛二聚体定量限溶液3mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)稀释至刻度，摇匀，作为羟醛二聚体检测限溶液。按照上述1.2方法平行制备3份样品(分别记为1S～3S)，每份样品精密量取10μL注入液相色谱仪，每份样品进样1次，记录色谱图，所得结果见表11。

表11检测限试验结果汇总表

由表10和表11可知，羟考酮羟醛二聚体的定量限溶液的浓度为1.5μg/ml，平均信噪比均不低于10，相当于能定量检测此杂质的限度为0.015％，6份定量限浓度溶液的RSD为1.19％，重复性良好；检测限溶液的浓度为0.456μg/mL，3份检测限溶液信噪比均不低于3，相当于能最低检测此杂质限度为0.0045％。而对比例1中采用进口注册标准中羟醛二聚体杂质的限度为不得过0.5％，试验结果说明本发明的方法灵敏度高，供试品溶液浓度适宜，可以定量检测出产品中羟醛二聚体的含量。

3、溶液稳定性

3.1羟醛二聚体对照品溶液稳定性

精密移取上述1.2中羟醛二聚体对照贮备液1.0mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)稀释至刻度，摇匀，作为羟醛二聚体对照品稳定性考察溶液。取上述对照品稳定性考察溶液溶液，放置于透明无色液相小瓶中，于不避光的室温条件下放置，分别于0小时、3小时、6小时、11小时、17小时、24小时后进样，记录各时间点样品溶液图谱，计算各时间点色谱图中峰面积与0小时峰面积比值，试验结果如表12：

表12羟醛二聚体对照品溶液稳定性试验结果汇总表

3.2供试品溶液稳定性考察

取盐酸羟考酮注射液原液，作为供试品稳定性考察溶液，置于不避光的室温条件下放置，分别于0小时、6小时、9小时、12小时、17小时、24小时后进样，记录各时间点样品溶液图谱。计算各时间点色谱图中羟醛二聚体峰面积和盐酸羟考酮峰面积，并分别与0小时峰面积进行比较。各时间点样品的图谱分别见图7～图12，试验结果如表13所示：

表13供试品溶液中羟考酮及羟醛二聚体稳定性试验结果汇总表

由表12和表13可知，供试品溶液及羟醛二聚体对照溶液在室温不避光的条件下放置24h，羟考酮峰面积与羟醛二聚体峰面积均未产生明显变化，不同考察时间点峰面积与0h峰面积的比值均在0.98～1.02之间，试验结果说明两样品溶液在24小时内是稳定的。

4、回收率

(1)羟醛二聚体贮备溶液

取羟醛二聚体对照品10mg，精密称定，置于20mL量瓶，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为羟醛二聚体贮备溶液。

(2)羟醛二聚体对照品溶液

精密量取上述羟醛二聚体贮备溶液1.0mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂(质量分数0.85％的磷酸水溶液)稀释至刻度，摇匀，得到羟醛二聚体对照溶液。

(3)供试品溶液(本底溶液)：即盐酸羟考酮注射液原液。

(4)加样回收率供试溶液制备

①定量限浓度加样供试溶液制备

取上述羟醛二聚体贮备溶液0.03mL，置于10mL量瓶，加入注射液原液稀释至刻度，摇匀，作为定量限浓度加样供试溶液。按照上述制备过程，平行制备三份样品，分别记为LL-1#～3#。制备加样过程如表14所示：

表14定量限浓度(0.015％)加样供试溶液的制备

②低浓度加样供试溶液制备

取上述羟醛二聚体贮备溶液0.5mL，置于10mL量瓶，加入注射液原液稀释至刻度，摇匀，作为低浓度加样供试溶液。按照上述制备过程，平行制备三份样品，分别记为L-1#～3#。制备加样过程如表15所示：

表15低浓度(0.25％)加样供试溶液的制备

③中浓度加样供试溶液制备

取上述羟醛二聚体贮备溶液各1.0mL，置于10mL量瓶中，加入注射液原液稀释至刻度，摇匀，作为中浓度加样供试溶液。按照上述制备过程，平行制备三份样品，分别记为M-1#～3#。制备加样过程如表16所示：

表16中浓度(0.5％)加样供试溶液的制备

④高浓度加样供试溶液制备

取上述羟醛二聚体贮备溶液1.2mL，置于10mL量瓶中，加入注射液原液稀释至刻度，摇匀，作为高浓度加样供试溶液。按照上述制备过程，平行制备三份样品，分别记为H-1#～3#。制备加样过程如表17所示：

表17高浓度(0.6％)加样供试溶液的制备

精密量取上述加样供试溶液，按照拟定的色谱条件，进样，记录色谱图，按外标法计算杂质的回收率，结果见表18：

表18羟醛二聚体加样回收率试验结果汇总表

由表18可知：通过对杂质羟醛二聚体4个浓度，每个浓度3个样品的加样回收率试验，12份样品中杂质羟醛二聚体平均回收率为94.5％，回收率在90％～110％之间，12个样品的回收率变异系数为3.0％，试验结果表明本发明的方法可以准确测定样品中羟醛二聚体的含量。

5、精密度

5.1进样精密度

精密移取“4、回收率试验”中羟醛二聚体对照品溶液10μL，按照拟定的色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算6针样品溶液峰面积的RSD％，试验结果如表19所示：

表19进样精密度试验结果汇总表

由表19可知，同一份羟醛二聚体对照品溶液连续进样6次，峰面积的RSD为0.13％，小于2.0％，试验结果表明仪器精密度良好。

5.2重复性试验

平行配制6份供试品溶液，按照拟定的羟醛二聚体检测方法，分别采用自身对照法和外标法计算6份供试样品中羟醛二聚体的含量(％)，考察羟醛二聚体检测方法的重复性，以及两种计算方法的差别，试验结果见表20。

表20重复性试验结果汇总表

采用两种计算方法分别对6份供试品溶液中羟醛二聚体的含量进行计算，结果两种计算结果一致，6份样品溶液的RSD值为0.82％，小于2.0％，表明方法的重复性良好。

5.2中间精密度

使用另外一台仪器，于不同时间，采用不同的试验人员，按照5.2重复性试验中各样品的制备方法，平行制备另外6份供试品溶液，按照拟定的色谱条件，记录色谱图，分别采用外标法及自身对照法计算中间精密度试验及5.2重复性试验中共12份供试样品中二聚体的含量(％)，结果见表21。

表21中间精密度试验结果汇总表

由表21可知：12份样品分别采用外标法和自身对照法计算羟醛二聚体，平均值分别为0.23％、0.22％，两种杂质计算方法结果一致。两种计算方法杂质含量RSD分别为0.84％和1.37％，均小于2.0％，试验结果说明本方法的精密度良好，使用外标法和自身对照法均可以准确计算杂质的含量。

6、耐用性试验

在初步拟定的液相色谱条件下，变动柱温、有机相比例、改变pH值，以考察色谱条件的耐用性，色谱条件变动如表22所示：

表22耐用性试验色谱条件参数变化

①供试品溶液：即盐酸羟考酮注射液原液。

②自身对照溶液：量取注射液原液0.5mL，置于100mL量瓶中，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)稀释至刻度，摇匀，即得。

③羟醛二聚体对照溶液：精密称取羟考酮羟醛二聚体对照品10mg，精密称定，置于20mL量瓶中，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)稀释至刻度，摇匀。精密移取上述溶液2mL，置于20mL量瓶中，加稀释剂溶液(质量分数0.85％的磷酸水溶液)稀释至刻度，摇匀，即得。

使用上述制备好的样品溶液，按照拟定的色谱条件，记录色谱图，分别采用外标法及自身对照法计算供试样品中二聚体的含量(％)，并统计羟醛二聚体的相对保留时间，试验结果见表23，各样品的图谱分别见图13～23。

表23耐用性试验羟考酮羟醛二聚体含量测定结果汇总表

由表23可知，色谱条件参数发生微小变动，供试品中羟醛二聚体检出的含量与正常条件比较未见有明显差异，外标法与自身对照法计算结果基本一致，分别为0.20％与0.22％，说明本发明的方法检测羟考酮液体制剂中羟醛二聚体是准确可靠的。而且，色谱条件发生微小变动，羟醛二聚体的相对保留时间在2.07～2.21之间变动，本发明采用特定色谱柱品牌型号，同时规定盐酸羟考酮的出峰时间范围，能够采用相对保留时间定位羟醛二聚体的出峰位置。

7、羟考酮羟醛二聚体检测结果对比

分别采用实施例1的方法及对比例1进口药品注册标准(标准号：JX20160245)中的方法对两个规格共计6批样品和一个批次的参比制剂(市售盐酸羟考酮注射液，批号：BM201、CA792持证商：NAPP PHARMACEUTICALS LIMITED)和自制制剂进行羟醛二聚体的检测，每个批次样品的检测结果见表24：

表24两种检测方法羟醛二聚体检测结果汇总表

由表24可知，自制制剂和参比制剂分别采用进口注册标准方法和实施例1方法进行检测，羟醛二聚体含量均一致。实施例1的方法采用自身对照法和外标法计算，检测结果一致；进口注册标准中采用外标法和自身对照法计算，结果差异较大，原因可能是进口注册标准方法中自身对照溶液羟考酮主成分峰型拖尾，积分不准确，导致结果差别较大。本发明的羟考酮羟醛二聚体方法克服了盐酸羟考酮和羟醛二聚体峰型差的缺点，使积分结果准确，从而保证了检测结果的准确可靠。

8专属性试验

8.1常规条件下专属性试验

(1)稀释剂溶液：即0.85％磷酸溶液。

(2)供试品溶液:即注射液原液。

(3)二聚体峰定位溶液制备:精密称取羟醛二聚体对照品(批号：YGY-P1纯度：87.04％，上海医药工业研究院有限公司)5mg，置于10mL量瓶中，加稀释剂溶液稀释至刻度，摇匀，作为二聚体峰定位贮备溶液，精密量取上述峰定位贮备溶液1.0mL，置于10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为二聚体峰定位溶液。

(4)原料药供试溶液：称取羟醛二聚体对照品40mg，精密称定，置于5mL量瓶中，加4mL稀释剂溶液使之溶解后，摇匀，作为原料供试溶液。

(5)二聚体加样供试溶液制备：取上述原料药供试溶液2mL，置于5mL量瓶中，向此量瓶中加入上述二聚体峰定位贮备溶液0.5mL，再加入稀释剂溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述溶液各10μl按照拟定的色谱条件进样，记录色谱图，专属性试验结果见表25：

表25羟醛二聚体专属性试验结果汇总表

由表25可知，稀释剂不干扰样品中二聚体测定，二聚体与相邻杂质峰分离良好，羟醛二聚体检测方法专属性符合要求。

8.2强降解条件下专属性试验

对供试样品进行强制破坏降解，目的是确证方法是否专属，进一步了解样品的在各苛刻降解条件下杂质的分布情况，同时了解产品的固有稳定性；通过峰纯度检测，确保没有杂质与羟醛二聚体峰共洗脱，以此来验证方法的专属性，各强降解条件样品破坏过程见表26：

表26各强降解条件样品破坏过程

将上述制备的各样品溶液，按照拟定的色谱条件进样，记录色谱图，各破坏样品溶液进行羟醛二聚体色谱峰纯度考察，同时与未破坏的样品进行比较，试验结果总结如表27：

表27羟醛二聚体测定方法强降解试验结果总结

由表27可知，稀释溶剂及各破坏条件下产生的色谱峰均不干扰羟醛二聚体的检测，说明方法的专属性符合要求。通过酸、碱、光照、氧化、高温降解样品，各样品中羟醛二聚体色谱峰纯度均大于规定的峰纯度因子，说明羟醛二聚体色谱峰中未见共洗脱的物质。样品中含有的羟醛二聚体，在各破坏条件下，均有一定程度的降解，说明羟醛二聚体在上述破坏条件下稳定性较差。

此外，结合使用杂质羟醛二聚体的杂质定位(采用相对保留时间)，液体制剂活性成分羟考酮主峰的保留时间约为7.1分钟，羟醛二聚体的保留时间约为15.7分钟，上述的实施例色谱条件下，降解杂质羟醛二聚体与羟考酮杂质之间的分离度良好，且杂质羟醛二聚体色谱峰峰对称性良好，拖尾因子为0.94，接近1.0，同时分析时间约为30分钟，分析时间缩短，满足了日常杂质质量控制的要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。