公开/公告号CN113215141A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-08-06
原文格式PDF
申请/专利权人 华南农业大学;
申请/专利号CN202110204762.3
申请日2021-02-23
分类号C12N15/10(20060101);C12Q1/6806(20180101);C12Q1/6869(20180101);C40B50/06(20060101);
代理机构11427 北京科家知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人王营超
地址 510000 广东省广州市天河区五山路483号
入库时间 2023-06-19 12:08:44
技术领域
本发明涉及染色体构象捕获领技术领域,具体为细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法。
背景技术
Hi-C主要步骤是先制备适合Hi-C的3C模板,限制酶切割后末端连接生物素标记的核苷酸。钝端连接之后DNA纯化剪切。生物素PuLL-down保证只有连接的部分用于分析。测序短读序列Reads被定位到基因组上,当这一对短读序列发现在不同片段上的时候,对互作片段进行相应评分。这样,一个包含基因组所有片段的连接频率矩阵被构建。通过4C确定试验在Hi-C可以得到验证。Hi-C试验让科学家们发现,染色质存在特定的染色质区隔,染色质和异染色质在不同的区域;人类不同类型细胞系,细胞核染色质组织大致相同;细菌的基因组DNA及质粒亦存在三维构象和相互作用。总之,Hi-C方法是全基因组范围内,不限制特定互作蛋白为局限,利用高通量测序(二代或三代)的基于“全对全”模式的染色质互作构象分析方法。在人类和小鼠上都有相关发现发表。目前,现在的Hi-C染色体构象捕获技术还不成熟,容易出错,尤其是细菌基因组及质粒的构象捕获方法。
发明内容
为了克服现有技术方案的不足,本发明提供细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法,能有效的解决背景技术提出的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法,包括以下捕获步骤:
步骤S1:细菌培养。用接种环蘸取少量的菌液,划线于LB琼脂平板,并将该平板放于37℃培养箱培养18-24小时;挑单菌于50mL的LB肉汤中,在 37℃的环境下摇床培养3小时15分钟;收集全部菌液,在4℃环境下,以 5000rpm离心运动8分钟,弃掉培养液,收集细菌沉淀;加入6mL新鲜的LB 肉汤,重悬细菌,洗涤;然后在4℃环境下,以5000rpm离心运动8分钟,收集细菌沉淀;
步骤S2:交联反应。配制20mL3%的甲醛溶液,加入到含有细菌沉淀的50mL 的离心管中,重悬细菌沉淀,在37℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃;加入4.5mL 2.5M甘氨酸,充分振荡混合,然后在37℃环境下摇床下培养5分钟,然后在4℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃;在4℃环境下以5000rpm 离心8分钟,收集交联细菌;加入4mL 1*TE缓冲液,重悬细菌,然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟;再次加入3mL 1*TE缓冲液,重悬细菌,将固定细菌的菌液平均分装于多个2mL的EP管内;然后在4℃环境下以5000rpm 离心8分钟并丢弃上清液;使用液氮迅速将细菌沉淀冻结,放入-80℃冰箱保存;
步骤S3:验证样品完整性。取出其中一个平行样品,采用试剂盒提取DNA;
步骤S4:细菌裂解。将交联反应的细菌从-80℃的冰箱取出,放在冰上融化约30分钟;向细菌沉淀物中加入100μL溶菌酶,在30℃环境下孵育15分钟并加入1.5mL DEPC水补足体积;
步骤S5:消化染色质。配制限制性反应混合物,并将该混合物加入细菌裂解液中,吹打混匀,在37℃水浴液中培养过夜,中途摇晃处理,然后立即放于冰上;
步骤S6:生物素填补。配制体系一加入到上一步的细菌消化液中,吹打混匀,在25℃环境下培养2小时,中途摇晃;向混合物中加入适量的EDTA(终浓度为10mM),在75℃环境下孵育20分钟使酶灭活;在4℃环境下以15000rpm 离心运动30分钟,去除上清液,加入300μL DEFC水,重悬沉淀;
步骤S7:连接反应。配制体系二,将上一步每管细菌液加入到新配制的体系混合物中,并上下颠倒混匀;在37℃环境下孵育4小时,中途摇晃;然后在65℃环境下孵育10分钟,灭活酶;最后加入10μL RNase在室温环境下孵育5分钟;
步骤S8:反向交联。向连接产物中加入100μL蛋白酶K,在65℃环境下孵育3小时;
步骤S9:文库提取。加入1.2体积的DNA提取液,上下颠倒均匀,室温静置10分钟;在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟,用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内;再次加入1.2体积的DNA提取液,上下颠倒均匀,室温静置10分钟;在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟,用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内;加入0.1体积的3M乙酸钠、2μL 5.0mg/mL糖原,上下颠倒均匀;加入2体积冷的100%乙醇,上下颠倒均匀,然后在-20℃环境下孵育过夜;将孵育过夜的液体分次装于1.5mL离心管内,在4℃环境以14000rpm离心运动25分钟,吸走上清液,离心管底部存在白色沉淀;加入500μL冷的70%的乙醇溶液,洗涤;在4℃环境以14000rpm离心运动20分钟,去掉上清液,重复两次;在室温风干20分钟;加入100μL 1*TE 缓冲液,溶解沉淀;再用HS试剂盒检测DNA浓度;
步骤S10:去除生物素。配制体系三,平均分装于PCR管内,每份55μL,在PCR仪在12℃环境下培养5分钟;加入6μL EDTA(终浓度为10mM),然后在PCR仪在75℃环境中培养20分钟,灭活酶;
步骤S11:酚氯仿提取DNA;
步骤S12:二代建库。
进一步地,在步骤S4中,使用溶菌酶对细菌进行裂解,去除了剧烈的裂解液SDS溶液的使用,或者使用较为温和的TX-100裂解液,保证了DNA的完整性。
进一步地,在步骤S4中,交联细菌融化切勿采用人工融化;对于较难裂的细菌,则加入1.5mL裂解液反应5分钟。
进一步地,在步骤S8中,使用高温反向交联,交联时间为3小时,减少高温处理时间,防止细菌DNA降解。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明通过甲醛处理将DNA与蛋白质交联在一起从而固定DNA的构象,并进行酶切、生物素引入、酶连和提取,然后对处理好的核酸进行文库构建和高通量测序,最终通过对测序数据进行分析即可揭示细菌染色质片段之间及其与质粒间的交互信息,可以应用于基因组组装、基因表达调控研究等,实用性强,可适合应用于不同的领域上。
附图说明
图1为本发明捕获方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如图1所示,本发明提供了细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法,包括以下捕获步骤:
步骤S1:细菌培养。用接种环蘸取少量的菌液,划线于LB琼脂平板,并将该平板放于37℃培养箱培养18-24小时;挑单菌于50mL的LB肉汤中,在 37℃的环境下摇床培养3小时15分钟;收集全部菌液,在4℃环境下,以 5000rpm离心运动8分钟,弃掉培养液,收集细菌沉淀;加入6mL新鲜的LB 肉汤,重悬细菌,洗涤;然后在4℃环境下,以5000rpm离心运动8分钟,收集细菌沉淀;
步骤S2:交联反应。配制20mL3%的甲醛溶液,加入到含有细菌沉淀的50mL 的离心管中,重悬细菌沉淀,在37℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃;加入4.5mL2.5M甘氨酸,充分振荡混合,然后在37℃环境下摇床下培养5分钟,然后在4℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃;在4℃环境下以5000rpm 离心8分钟,收集交联细菌;加入4mL1*TE缓冲液,重悬细菌,然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟;再次加入3mL1*TE缓冲液,重悬细菌,将固定细菌的菌液平均分装于多个2mL的EP管内;然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟并丢弃上清液;使用液氮迅速将细菌沉淀冻结,放入-80℃冰箱保存;
步骤S3:验证样品完整性。取出其中一个平行样品,采用试剂盒提取DNA;
步骤S4:细菌裂解。将交联反应的细菌从-80℃的冰箱取出,放在冰上融化约30分钟;向细菌沉淀物中加入100μL溶菌酶,在30℃环境下孵育15分钟并加入1.5mL DEPC水补足体积;
步骤S5:消化染色质。配制限制性反应混合物,并将该混合物加入细菌裂解液中,吹打混匀,在37℃水浴液中培养过夜,中途摇晃处理,然后立即放于冰上;
步骤S6:生物素填补。配制体系一加入到上一步的细菌消化液中,吹打混匀,在25℃环境下培养2小时,中途摇晃;向混合物中加入适量的EDTA(终浓度为10mM),在75℃环境下孵育20分钟使酶灭活;在4℃环境下以15000rpm 离心运动30分钟,去除上清液,加入300μL DEFC水,重悬沉淀;
步骤S7:连接反应。配制体系二,将上一步每管细菌液加入到新配制的体系混合物中,并上下颠倒混匀;在37℃环境下孵育4小时,中途摇晃;然后在65℃环境下孵育10分钟,灭活酶;最后加入10μL RNase在室温环境下孵育5分钟;
步骤S8:反向交联。向连接产物中加入100μL蛋白酶K,在65℃环境下孵育3小时;
步骤S9:文库提取。加入1.2体积的DNA提取液,上下颠倒均匀,室温静置10分钟;在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟,用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内;再次加入1.2体积的DNA提取液,上下颠倒均匀,室温静置10分钟;在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟,用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内;加入0.1体积的3M乙酸钠、2μL 5.0mg/mL糖原,上下颠倒均匀;加入2体积冷的100%乙醇,上下颠倒均匀,然后在-20℃环境下孵育过夜;将孵育过夜的液体分次装于1.5mL离心管内,在4℃环境以14000rpm离心运动25分钟,吸走上清液,离心管底部存在白色沉淀;加入500μL冷的70%的乙醇溶液,洗涤;在4℃环境以14000rpm离心运动20分钟,去掉上清液,重复两次;在室温风干20分钟;加入100μL 1*TE 缓冲液,溶解沉淀;再用HS试剂盒检测DNA浓度;
步骤S10:去除生物素。配制体系三,平均分装于PCR管内,每份55μL,在PCR仪在12℃环境下培养5分钟;加入6μL EDTA,然后在PCR仪在75℃环境中培养20分钟,灭活酶;
步骤S11:酚氯仿提取DNA;
步骤S12:二代建库。
其中,在步骤S4中,使用溶菌酶对细菌进行裂解,去除了剧烈的裂解液 SDS溶液的使用,或者使用较为温和的TX-100裂解液,保证了DNA的完整性;在步骤S4中,交联细菌融化切勿采用人工融化;在步骤S8中,使用高温反向交联,交联时间为3小时,减少高温处理时间,防止细菌DNA降解
实施例:
第一步:细菌培养。
1.用接种环蘸取少量的菌液,划线于LB琼脂平板(或者鉴定琼脂平板),将平板放于37℃培养箱培养18-24小时。
2.挑单菌于50mL的LB肉汤中,37℃摇床培养3小时15分钟。
3.收集全部菌液,4℃,5000rpm,离心8分钟,弃掉培养液,收集细菌沉淀。
4.加入6mL新鲜的LB肉汤,重悬细菌,洗涤。然后4℃,5000rpm,离心8分钟,收集细菌沉淀。
第二步:交联反应。
1.配制20mL 3%的甲醛溶液(冰上避光):3%的甲醛溶液
18.4mL 1*PBS溶液+1.6/mL 37%w/v甲醛溶液
2.将配置好的3%甲醛溶液加入到含有细菌沉淀的50mL的离心管中,重悬细菌沉淀,37℃培养15分钟,每隔2分钟摇晃一下。
3.向交联反应中加入4.5mL 2.5M甘氨酸(终浓度为460mM),充分振荡混合。然后37℃摇床下培养5分钟,然后4℃培养15分钟,每隔2分钟摇晃一下。
4.在4℃,5000rpm,离心8分钟,收集交联细菌。
5.加入4mL 1*TE缓冲液,重悬细菌,然后4℃,5000rpm,离心8分钟。
6.再次加入3mL 1*TE缓冲液,重悬细菌,将固定细菌的菌液平均分装于 2mL的EP管内,每管1mL(三个平行)。
7.然后4℃,5000rpm,离心8分钟,丢弃上清液。
8.使用液氮迅速将细菌沉淀冻结,放入-80℃冰箱保存。
第三步:验证样品完整性。
取出其中一个平行样品,试剂盒提取DNA,确保细菌DNA完整性。(细菌 DNA要具有完整性,才能投入Hi-C文库构建)
第四步:细菌裂解。
1.将交联细菌从-80℃冰箱取出,放在冰上融化约30分钟,切勿人工融化。
2.向细菌沉淀中加入100μL溶菌酶,30℃孵育15分钟。
3.加入1.5mL DEPC水补足体积。
(对于较难破裂的细菌,则加入1.5mL裂解液反应5分钟)
第五步:消化染色质。
1.(冰上操作)配制限制性反应混合物:
2.将限制性反应混合物加入到细菌裂解液中,吹打混匀,37℃水浴培养过夜,中途摇晃一下。
3.然后立即放于冰上。
第六步:生物素填补。
1.按顺序配制以下体系:
2.将体系加入到上一步的细菌消化液中,吹打混匀。25℃培养2小时,中途摇晃。
3.向混合物中加入适量EDTA(终浓度为10mM),75℃孵育20分钟,使酶灭活。
4.在4℃,15000rpm离心30分钟。去掉上清液,加入300μL DEFC水,重悬沉淀。
第七步:连接反应。
1.(冰上操作)在新的2.0mL离心管配制以下体系:
将上一步的每管细菌液加入到配制的混合物中,上下颠倒混匀。
2.在37℃孵育4小时,中途摇晃一下。
3.65℃孵育10分钟,灭活酶。
4.加入10μL RNase,室温孵育5分钟。
第八步:反向交联。
向连接产物中加入100μL蛋白酶K(20mg/mL),65℃孵育3小时。
第九步:文库提取。
1.加入1.2体积的DNA提取液,轻轻上下颠倒混匀,室温静置10分钟。
2.在4℃,14000rpm,离心10分钟,用移液枪将上层液体转移到新的15mL 离心管内。(液体分层,下层为酚相,中间白色层为变性蛋白质,上层为含有DNA水相)
3.再次加入1.2体积的DNA提取液,轻轻上下颠倒混匀,室温静置10分钟。
4.在4℃,14000rpm,离心10分钟,用移液枪将上层液体转移到新的15mL 离心管内。
5.加入0.1体积的3M乙酸钠、2μL 5.0mg/mL糖原,上下颠倒混匀。
6.加入2体积的冷的100%乙醇,上下颠倒混匀。
7.然后-20℃孵育过夜。
8.将孵育过夜的液体分次装于1.5mL离心管内,在4℃,14000rpm,离心25分钟。吸走上清液,在离心管底部可以看到白色沉淀。
9.加入500μL冷的70%的乙醇溶液,洗涤(不要把沉淀悬浮起来)。
10.在4℃,14000rpm,离心20分钟,去掉上清液,重复两次。
11.室温风干20分钟。
12.加入100μL 1*TE缓冲液,溶解沉淀。
13.用HS试剂盒检测DNA浓度。
第十步:去除生物素。
1.(冰上操作)按以下比例配制体系,混匀:
2.将每管平均分装于PCR管内,每份55μL。在PCR仪12℃培养5分钟。
3.加入6μL EDTA,然后在PCR仪75℃处培养20分钟,灭活酶。
第十一步:酚氯仿提取DNA。
最后用30μL 1*TE缓冲液溶解沉淀。
第十二步:二代建库。
(一)酶切反应
1.配制酶切PCR体系
向16μL的DNA产物中先加入2μL Buffer,再加入2μL酶,吹打混匀。
2.PCR程序:
37℃ 5分钟
3.PCR结束后,将样品插在冰上,马上加入5μL EDTA,吹打混匀。
4.吸取5μL进行琼脂凝胶电泳实验。
5.使用2.2X磁珠纯化。
6.使用HS检测DNA浓度。
(二)末端修复
1.将末端缓冲液和末端修复酶(不涡旋,低速离心)从冰箱取出,置于冰上。
2.PCR体系配制(50μL)
3.PCR程序:
(三)接头反应
1.将接头、连接酶、连接缓冲液2-1(Buffer2-1)从冰箱取出,置于冰上。从常温中取出增强液,连接缓冲液2-2(Buffer2-2)。
2.PCR体系配制(80μL):
3.PCR程序:
(四)链霉亲和素磁珠准备
1.配制100mL Buffer I:
2.将磁珠充分混悬,可置于混合器上涡旋振荡20秒,取50μL磁珠到新的离心管中,置于磁力架,磁性分离,弃上清液。
3.加入200μL Buffer I,充分洗涤磁珠。
磁珠洗涤过程:加入buffer到PCR管中,盖上管盖,涡旋振荡磁珠 30秒,磁性分离,弃上清。重复以上步骤1次。
4.加入120μL的Buffer I,重悬磁珠。
5.将80μL的接头反应产物加入到上述磁珠中,吹打混匀。37℃孵育 45分钟。
6.置于磁力架上,静置10分钟(磁性分离)。取出上清液到新的离心管内,以备使用。
7.加入200μL Buffer I,充分洗涤磁珠。重复1次。
8.加入23μL的DEPC水,重悬磁珠。
(五)文库扩增
1.PCR体系:
2.PCR程序:
3.将PCR管放在磁力架上,静置5分钟。然后转移48μL上清液到新的PCR管,放于冰上,直到再次使用。
4.剩余磁珠洗涤
(1)向上一步含有磁珠的PCR管中加入50μL的Buffer I,吹打混匀。将PCR管放在磁力架上,静置5分钟,然后取出上清液。(重复两次)
(2)向上一步含有磁珠的PCR管中加入50μL的TE缓冲液,重悬磁珠,保存于4℃。(可以继续使用)
(六)文库纯化
1.吸取48μL建库磁珠到上述的48μL上清液,吹打混匀。室温静置5 分钟。
2.置于磁力架5分钟。加入200μL 80%乙醇,静置30秒,弃掉液体。重复一次。
3.室温放置5分钟,干燥磁珠,使酒精挥发。
4.加入25μL ddH2O,重悬磁珠,吹打混匀,室温静置5分钟。
5.放于磁力架,静置5分钟。
6.吸取23μL上清液到新的PCR管中,吸取2μL上清液进行HS检测 DNA浓度。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
机译: 木糖和阿拉伯糖发酵的运动发酵单胞菌的稳定菌株,用于插入的转座子,细菌基因组内的外源基因稳定,含有所述转座子的质粒载体,用所述质粒转化的细菌,载体pzb1862-idhl-ara atcc,提升编号pta-1798,可转座元件编号:tn5-tal / tkt-xilaxilb atcc,升序编号为pta-1795,细菌菌株g8 atcc,升序编号为pta-1796,细菌菌株c25 atcc,升序编号为pta-1799,ax atcc细菌菌株,编号为pta-1797 ,包含可发酵培养基的反应混合物
机译: 重组质粒DNA pVar15-HIV-LTR,携带来自5-LTR序列保守位点的1型克隆片段基因组HIV,重组质粒DNA pBluKSM-HIV-LTR mod携带同一位点基因组HIV-1的克隆修饰片段定量鉴定任何类型的基因组HIV-1的方法及其使用方法
机译: 重组质粒DNA pVar 15-HIV-LTR,克隆的支持5'-LTR序列保守区的HIV-1类型的基因组片段,重组质粒DNA pBluKSM-HIV-LTR mod,CARRIER克隆了HIV同一部分的修饰片段基因组类型1测试试剂盒,用于快速鉴定样品中HIV-1的定量基因组任何种类和方法,及其使用