一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗

摘要

本发明的目的在于提供一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗，选择乳酸菌作为载体构建重组侵入型植物乳杆菌，植物乳杆菌具有免疫调节能力，携带肿瘤抗原具有抑制肿瘤生长作用，而旋毛虫sHSPs作为异种抗原可打破免疫耐受，产生显著的抗肿瘤免疫。使植物乳杆菌携带相关抗原基因sHSPs，既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可以将sHSPs递送到宿主细胞表达出相关抗原sHSPs，诱导特异性免疫应答；携带旋毛虫sHSPs基因的重组植物乳杆菌既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可诱导特异性抗肿瘤免疫。同时乳杆菌作为一种益生菌安全性高，可口服，使用便捷，易于推广。

说明书

技术领域

本发明公开了一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载DNA疫苗，是旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗，可用于Lewis肺癌的预防和治疗，属生物医药领域。

背景技术

肺癌是死亡率最高的癌症，造成严重的经济负担。近年来，肺癌发病率日益上升且呈现年轻化趋势。目前肺癌尚无理想的防治疗法，开发新型疗法具有重要意义。疫苗分为治疗性疫苗和预防性疫苗，是防治疾病的重要手段。研发癌症疫苗是癌症研究的热点之一。

近年来，研究发现细菌活载体疫苗可用于肿瘤防治，并表现出明显的疗效。其中，乳酸菌、双歧杆菌等益生菌对清除病原菌、维持肠道微生态平衡具有重要意义。某些乳酸菌可以调节免疫应答，具有抑制肿瘤生长的活性，并且重组乳酸菌活载体疫苗可以诱导特异性免疫反应。除此之外，乳酸菌活疫苗载体可口服，使用便捷、安全性高。

旋毛虫是一种多细胞生物，人们发现感染旋毛虫能提高宿主的抗肿瘤能力。旋毛虫对乳腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤等都具有明显的疗效。本发明涉及旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原sHSPs抗血清可抑制Lewis肺癌细胞的增殖，并在动物实验上取得了71%的抑瘤率。以往重组乳酸菌肿瘤疫苗用的抗原是肿瘤自身抗原，易产生免疫耐受，难以诱导强有力的免疫应答，旋毛虫sHSPs是异源抗原可打破免疫耐受，诱导抗肿瘤免疫。同时，乳酸菌活载体疫苗安全有效，易储存和运输。

发明内容

本发明的目的在于提供一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗，利用旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌，可用于预防或治疗Lewis肺癌，还公开了该重组侵入型植物乳杆菌的制备方法。

本发明所述的一种旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs，其序列如SEQ no.1所示。

本发明所述的一种重组植物乳杆菌递送质粒pValac-sHSPs，其特征在于是在质粒pValac上插入了序列如SEQ no.1所示的sHSPs基因。

本发明所述的一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗是转化了上述的一种重组质粒pValac-sHSPs的植物乳杆菌NC8（CCUG 61730）活载体DNA疫苗。

本发明所述的一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的制备方法，包括以下步骤：

sHSPs基因的扩增：

根据旋毛虫sHSPs基因DNA序列（DQ986457.1）和穿梭载体pValac载体图谱设计引物：

上游引物：

5'-GGATCCGCCACCATG

下游引物：

5'CTCGAGTTA

PCR扩增旋毛虫sHSPs基因，胶回收后克隆至pMD18-T载体并进行菌液PCR、测序鉴定并命名为pMD18-T-sHSPs；

sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建：

用

本发明制备的一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌在制备抗Lewis肺癌药物中的应用。

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防效果

重组植物乳杆菌NC8-sHSPs以10

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗效果

C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞荷瘤，可触摸到肿瘤后，连续使用10

本发明制备的重组植物乳杆菌NC8-sHSPs预防和治疗均可通过激活体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫抑制Lewis肺癌生长。

本发明的积极效果在于：

本发明选择乳酸菌作为载体构建重组侵入型植物乳杆菌，植物乳杆菌具有免疫调节能力，携带肿瘤抗原具有抑制肿瘤生长作用，而旋毛虫sHSPs作为异种抗原可打破免疫耐受，产生显著的抗肿瘤免疫。使植物乳杆菌携带相关抗原基因sHSPs，既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可以将sHSPs递送到宿主细胞表达出相关抗原sHSPs，诱导特异性免疫应答；携带旋毛虫sHSPs基因的重组植物乳杆菌既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可诱导特异性抗肿瘤免疫。同时乳杆菌作为一种益生菌安全性高，可口服，使用便捷，易于推广。

附图说明：

图1为本发明重组质粒pValac-sHSPs在293T细胞内表达鉴定（1：未处理细胞；2：转染pValac；3：转染pValac-sHSPs）；

图2为发明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs在小肠内定植检测；

图3为发明预防组肿瘤组织图片；

图4为发明预防组血清sHSPs特异性抗体水平；

图5为发明预防组组织器官HE染色图；

图6为发明治疗组肿瘤组织图片；

图7为发明治疗组血清sHSPs特异性抗体水平；

图8为发明治疗组小鼠生存率；

图9为发明治疗组组织器官HE染色图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

sHSPs基因的扩增：

根据旋毛虫sHSPs基因DNA序列设计引物：

上游引物：5'-GGATCCGCCACCATG

下游引物：5'CTCGAGTTA

酶切位点分别为：GGATCC (

PCR扩增旋毛虫sHSPs基因，胶回收后克隆至pMD18-T载体并进行菌液PCR、测序鉴定并命名为pMD18-T-sHSPs。

实施例2

sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建：

用

实施例3

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs定植能力检测

C57BL/6小鼠经口免疫NC8-sHSPs，设置空白对照和NC8-pValac对照，首免3 d，间隔14 d后再次免疫3 d，每次免疫10

试验例1

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防效果评价

1.1重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防试验方案

36只C57BL/6小鼠随机分为空白组，PBS组，NC8-pValac组和NC8-sHSPs组，每组9只，自由采食。用无菌PBS将过夜培养的重组乳杆菌NC8-pValac和 NC8-sHSPs稀释至10

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs效果评价

将本发明的NC8-sHSPs免疫小鼠后荷瘤，14天后处死小鼠，分离肿瘤组织（见图3）。统计肿瘤体积和重量发现，NC8-sHSPs组肿瘤平均体积和重量分别为251.872 mm

表1. 肿瘤体积重量和抑瘤率

(*

采集血清，以重组sHSPs为抗原，利用间接ELISA检测发现NC8-sHSPs可诱导sHSPs特异性IgG，效价达到1：12800（见图4）。检测血清细胞因子发现NC8-sHSPs可增加TNF-α和IFN-γ的水平，肠道灌洗液和血清总sIgA检测结果显示NC8-sHSPs可增加sIgA的水平（见表2）。脾淋巴细胞亚型及数量检测表明NC8-sHSPs可增加脾CD8+淋巴细胞的数量（见表3）。以上结果表明NC8-sHSPs可通过诱导特异性体液免疫，增强黏膜免疫和细胞免疫抑制Lewis肺癌生长。

表2. 细胞因子、sIgA检测

(*

表3. 脾淋巴细胞亚群及数量检测

(*

对心、肝、脾、肺、肾、小肠进行组织病理学检测发现NC8-sHSPs处理未引起明显的病理损伤（见图5）。

试验例2

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗效果

2.1 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗方案

60只C57BL/6小鼠分为4组（空白对照组、PBS治疗组、NC8-pValac治疗组、NC8-sHSPs治疗组），每组15只，7只进行抗肿瘤指标检测，8只进行生存率检测。每只小鼠皮下接种2×10

重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs效果评价

小鼠接种Lewis肺癌细胞荷瘤后，经口灌服重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs连续治疗15d，治疗结束，处死小鼠，分离肿瘤组织（见图6）。对肿瘤体积和重量进行检测发现，NC8-sHSPs组肿瘤平均体积和重量分别为245.033 mm

表4. 肿瘤体积重量和抑瘤率

(*

分离血清和肠道灌洗液，ELISA检测发现NC8-sHSPs治疗可诱导血清sHSPs特异性IgG（见图7），并且血清中TNF-α、IFN-γ和IL-12的水平增加，并且治疗后肠道灌洗液和血清中总sIgA的水平也是增加的（见表5）。

表5. 细胞因子、sIgA检测

(*

对荷瘤小鼠生存率进行检测发现NC8-sHSPs治疗可延长荷瘤小鼠生存率，与PBS相比，平均延长23.12 d（见图8）。对心、肝、脾、肺、肾、小肠进行组织病理学检测发现NC8-sHSPs处理未引起明显的病理损伤（见图9）。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 498

<212> DNA

<213> 旋毛虫小热休克蛋白基因(Trichinella spiralis small heat shockprotein )

<400> 1

atggccttga ctgcgtggta taatccgtgg gttgatgatc cattttggcc gtcgtctcga 60

ccggctcgct tcttcgagga tctgagccgc atgatacgca gctttgatga catgtatcga 120

ggtttgccga accagatgaa cgtgccaatg aatgagctgt cgatgtgcgg aaatgcatcc 180

gaggtggtga acaacgacaa caagtttgaa gtttcactcg acgtgaagca tttcaaacct 240

gaagagctga ctgtgaaaac taccgacaat cgtctcgtca tcaccggcaa gcatgaggag 300

aagcaagatg agcatggctt tgtcaaacgc gagttttctc gttcttacta tctaccacaa 360

ggcgttaagc cggatcagtt tgtctccaac ttgggtccgg atggaaagtt ggttattaca 420

gcaccgaagc aggcgattga aggcagcaac gaacgaaaaa ttccaatcac cgccgctccg 480

gctgctcaga agagatga 498

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 旋毛虫(Trichinellaspiralis)

<400> 2

ggatccgcca ccatggacta caaagacgat gacgacaaaa tggccttgac tgcgtggtat 60

aat 63

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 旋毛虫(Trichinellaspiralis)

<400> 3

ctcgagttaa tggtgatggt ggtgatgtct cttctgagca gccggagcg 49