基于SERS的液体细胞无标签检测平台及其制备方法和应用方法

摘要

本发明公开了一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台及其制备方法和应用方法，所述基于SERS的液体细胞无标签检测平台包括：石墨烯‑纳米金字塔结构混合平台；石墨烯‑纳米金字塔结构混合平台包括纳米金字塔结构和石墨烯，石墨烯覆盖于纳米金字塔结构的表面；石墨烯的表面设置有槽栅结构，槽栅结构的井用于置入待测液体细胞，槽栅结构的井为微米级深度。本发明的基于SERS的液体细胞无标签检测平台不仅制备过程简单、使用方便，且所需样本量较少、无任何其他物质加入，能够保证细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

说明书

技术领域

本发明属于微纳米结构器件技术领域，特别涉及一种基于SERS(表面增强拉曼散射，Surface-Enhanced Raman Scattering)的液体细胞无标签检测平台及其制备方法和应用方法。

背景技术

细胞是生物体的基本生物单位，大多数疾病都是由于细胞内生物变化引起的细胞异常导致的。细胞的结构、正常行为和生物变化的研究有助于从根本上发现疾病的致病机理。因此，对于细胞检测就显得尤为重要。

以前传统的细胞检测只是在固定细胞上进行，主要检测方式是电子显微镜；传统方法虽然可以提供细胞的结构信息和生物变化信息，但是只能提供当前状态的信息；另外，传统检测技术还依赖于成像前的细胞染色，这可能会引入人为构象，会对细胞的状态产生不准确的描述。随着相位对比、差分干涉这类亮场显微镜技术的发展，可以在没有染色的状态下观察细胞，但是这类技术观察的细胞结果缺乏化学特异性，由于光晕的影响，人为构象有可能被引入。

SERS是一种特殊的表面光学现象，指分子非常靠近或吸附在金属纳米结构的表面时，其拉曼信号强度显著增强。分子拉曼散射信号的增强来源于粗糙表面在光照射下所产生的表面电子振荡，当入射光的频率与金属自身的等离子体的频率相匹配时，电子振荡达到最大，于是在金属表面产生一个与入射光频率相同的附加局域电磁场，它所覆盖的区域存在着入射光和表面等离子体被激发后叠加在一起的电磁场。该技术具有极高检测灵敏度、高检测通量、强大的抗干扰能力、简单的样品前处理等优点，可以获得分子指纹信息，是一种极具前景的分子水平的检测技术。现有技术中，已有将活性纳米材料导入癌细胞，利用表面增强拉曼光谱鉴别癌细胞。但是，活性纳米粒子的制备和导入是一种繁琐、高成本的过程，电穿孔导入纳米材料可能对活细胞带来破坏，导致细胞信息的丢失，对细胞的鉴别和检测带来不可控因素。由于生物细胞体系的复杂性，而且纳米材料与细胞生物体的相互作用始终处于动态变化中，使得SERS检测结果的重现性和可靠性都相对较差。

综上，亟需一种新的基于SERS的液体细胞无标签检测平台及其制备方法和应用方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台及其制备方法和应用方法，以解决上述存在的一个或多个技术问题。本发明的基于SERS的液体细胞无标签检测平台不仅制备过程简单、使用方便，且所需样本量较少、无任何其他物质加入，能够保证细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台，包括：石墨烯-纳米金字塔结构混合平台；

所述石墨烯-纳米金字塔结构混合平台包括纳米金字塔结构和石墨烯；其中，所述石墨烯覆盖于所述纳米金字塔结构的表面；所述石墨烯的表面设置有槽栅结构，所述槽栅结构的井用于置入待测液体细胞，所述槽栅结构的井为微米级深度。

本发明的进一步改进在于，所述石墨烯为单层石墨烯；所述微米级深度为8～30微米深度。

本发明的进一步改进在于，还包括：石英盖玻片，用于封盖所述槽栅结构的井。

本发明的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的制备方法，包括以下步骤：

制备获得石墨烯-纳米金字塔结构混合平台；

在所述石墨烯-纳米金字塔结构混合平台上旋涂光刻胶；

基于所述光刻胶，根据预设的光刻模板制备获得槽栅结构；所述槽栅结构的井为微米级深度；

使用显影液对制备的槽栅结构进行显影，获得基于SERS的液体细胞无标签检测平台。

本发明的进一步改进在于，所述制备获得石墨烯-纳米金字塔结构混合平台的步骤具体包括：采用胶体光刻和微纳制备技术制备获得周期性的纳米金字塔结构；使用石蜡、聚甲基丙烯酸甲在制备的纳米金字塔结构上转移单层石墨烯，使所述单层石墨烯覆盖于所述纳米金字塔结构的表面。

本发明的进一步改进在于，所述基于所述光刻胶，根据预设的光刻模板制备获得槽栅结构的步骤具体包括：

将旋涂光刻胶的石墨烯-纳米金字塔结构混合平台在95℃的条件下进行软烘焙，获得软烘焙后的样品；

使用具有槽栅结构的掩膜板和有掩膜曝光机对所述软烘焙后的样品进行曝光，获得曝光后的样品；

将所述曝光后的样品在95℃的条件下进行中烘，获得具有槽栅结构的石墨烯-纳米金字塔结构混合平台。

本发明的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的应用方法，用于对液体状态的细胞进行拉曼检测。

本发明的进一步改进在于，所述液体状态的细胞为悬浮细胞或经胰酶消化后的贴壁细胞。

本发明的进一步改进在于，所述用于对液体状态的细胞进行拉曼检测的步骤具体包括：

将待测的细胞置入所述槽栅结构的井中并封盖；

使用拉曼光谱仪对所述槽栅结构的井中的细胞进行拉曼检测，获得SERS光谱。

本发明的进一步改进在于，所述将待测的细胞置入所述槽栅结构的井中并封盖的步骤具体包括：将待测的细胞使用移液枪滴加在所述槽栅结构的井中并封盖，使细胞与井底部的石墨烯-纳米金字塔结构混合平台保持紧密接触，使细胞保持位置静止。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的基于SERS的液体细胞无标签检测平台，将微纳制备技术与光刻技术相结合，其包括具有周期性纳米级结构且覆盖单层石墨烯的石墨烯-纳米金字塔混合平台，混合平台上的槽栅结构的井用于置入待测的细胞，可以实现液体细胞的无标签SERS检测。本发明的检测平台制备流程简单、使用方便，而且所需样本量少、无任何其他物质加入，能够保证细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

本发明平台的制备方法中，首先使用微纳加工技术制备周期性纳米级结构，并在该纳米结构表面覆盖一层单层石墨烯，制备为石墨烯-纳米金字塔结构的混合平台；然后使用有掩膜曝光机在旋涂了光刻胶的石墨烯-纳米金字塔混合平台上制备槽栅结构。本发明的平台制备流程简单、使用方便，而且所需样本量少、无任何其他物质加入、保证了细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

本发明的平台可用于悬浮细胞或经胰酶消化后的贴壁细胞的SERS检测；其中，将待测试的细胞溶液滴加在该槽栅结构的井中，盖上石英盖玻片，该“井”的微米级深度，使细胞与“井”底部的SERS混合平台保持紧密接触，同时细胞保持位置静止，进行SERS检测，获取液体内细胞的SERS光谱信息。本发明的方法中，所需样本量少、无任何其他物质加入、保证了细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍；显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的结构示意图；

图2是本发明实施例的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的制备方法的流程示意图；

图3是本发明实施例1中，基于SERS的液体细胞无标签检测平台滴加液体细胞样本后的OM图片；

图4是本发明实施例1中，基于SERS的液体细胞无标签检测平台对液体细胞进行SERS检测获取的光谱图；

图5是本发明实施例1中，基于SERS的液体细胞无标签检测平台滴加液体细胞样本后3个小时内细胞保持位置固定的OM图片；

图中，1、石墨烯-纳米金字塔结构混合平台；2、光刻胶；3、石英盖玻片；4、细胞。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术效果及技术方案更加清楚，下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例。基于本发明公开的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它实施例，都应属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明实施例的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台，包括：石墨烯-纳米金字塔结构混合平台1；所述石墨烯-纳米金字塔结构混合平台1包括纳米金字塔结构和石墨烯，所述石墨烯覆盖于所述纳米金字塔结构的表面；所述石墨烯的表面设置有基于光刻胶2制备的槽栅结构，所述槽栅结构的井用于置入待测的液体状态的细胞4，所述槽栅结构的井为微米级深度(可选的，8～30微米深度，深度的调整尺寸在微米范围内调整)。其中，所述石墨烯为单层石墨烯。

本发明实施例的基于SERS的液体细胞无标签检测平台，还包括：石英盖玻片3，用于封盖所述槽栅结构的井。

根据本发明上述实施例的基于SERS的液体细胞无标签检测平台，该检测平台包括底部的石墨烯-纳米金字塔混合平台和可固定细胞的槽栅结构，槽栅构道的尺寸为微米级，可通过石英玻璃片来控制细胞的位置，将细胞与槽栅底部密切接触，槽栅底部为石墨烯-纳米金字塔混合平台。使用拉曼光谱仪的物镜对槽栅井中固定的细胞进行聚焦，聚焦后进行SERS光谱采集。本发明所制备的基于SERS的无标签检测平台可用于悬浮细胞SERS成像研究的增强效果较好，贴壁培养的细胞可以在胰酶消化后用同样的方法滴加在槽栅内进行测试。

本发明实施例的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备石墨烯-纳米金字塔混合SERS平台；

步骤2：使用匀胶机在步骤1制备的石墨烯-纳米金字塔混合SERS平台上旋涂光刻胶；

步骤3：使用光刻机在步骤2制备的光刻胶上，根据光刻模板制备槽栅结构；

步骤4：使用显影液对步骤3上的结构进行显影，获得石墨烯-SERS槽栅结构，完成石墨烯-SERS槽栅检测平台；本发明的这种石墨烯-SERS槽栅结构可以控制细胞在液体环境中保持位置不变；

步骤5：使用步骤4制备的石墨烯-SERS槽栅检测平台对液体状态的细胞进行拉曼检测。

本发明实施例的步骤1的具体实现过程包括：

步骤1-1：使用胶体光刻和微纳制备技术制备周期性纳米金字塔结构；其中，所述的纳米金字塔结构的尺寸和间隔都可以调整；

步骤1-2：在步骤1-1制备的纳米金字塔结构上转移单层石墨烯；其中，转移单层石墨烯的方法，可以使用石蜡、聚甲基丙烯酸甲(Polymethyl methacrylate，简称PMMA)转移的方法。

本发明实施例的步骤2中，所涉及的光刻胶的旋涂厚度，可以根据匀胶机旋涂参数来进行调整。

本发明实施例的步骤3的具体实现过程包括：

步骤3-1：将步骤2制备的样品放在95℃的热台上加热，进行软烘焙；

步骤3-2：使用有掩膜曝光机结构掩膜模板结构对步骤3-1软烘焙后的样品进行曝光；

步骤3-3：将3-2曝光后的样品在95℃热台上加热，进行中烘。

本发明实施例的步骤3中，所述的光刻模板中槽栅结构的长宽尺寸也可根据样品容积进行调整。

本发明实施例的步骤5的具体实现过程包括：

步骤5-1：将细胞悬浮液使用移液枪滴加在制备的石墨烯-SERS槽栅结构中的“井”中；

步骤5-2：使用石英盖玻片覆盖在步骤5-1的“井”上；

步骤5-3：使用拉曼光谱仪对步骤5-2中石英盖玻片和槽栅结构所控制的细胞进行拉曼检测。

根据本发明实施例上述的基于SERS的液体细胞无标签检测平台的制备方法，首先使用微纳加工技术制备周期性纳米级结构，并在该纳米结构表面覆盖一层单层石墨烯，制备为石墨烯-纳米金字塔结构的混合平台，然后使用有掩膜曝光机在旋涂了光刻胶的石墨烯-纳米金字塔混合平台上制备槽栅结构，将待测试的细胞溶液滴加在该槽栅结构的井中，盖上石英盖玻片，该“井”的微米级深度，使细胞与“井”底部的SERS混合平台保持紧密接触，同时细胞保持位置静止，进行SERS检测，获取液体内细胞的SERS光谱信息。该平台制备流程简单、使用方便，而且所需样本量少、无任何其他物质加入、保证了细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

本发明实施例中，将微纳加工、石墨烯转移技术和光刻技术相联用，该平台不仅可以用于悬浮细胞的SERS测试，还可以用于经胰酶消化后的贴壁细胞的SERS测试。

具体实施例1

请参阅图1至图4，本发明实施例的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的制备及应用方法，包括以下步骤：

步骤1：使用LB-Troube将直径为500nm的PS微球，通过自组装的方式密集的排列在4寸硅片的表面；

步骤2：使用化合物半导体刻蚀机(Oxford ICP180)对步骤1中4寸硅片表面的PS微球进行刻蚀，刻蚀为直径是300nm的球形，刻蚀参数为：200w，O

步骤3：使用真空镀膜机(HHV TF500)在步骤2获得的基板表面镀一层厚度为20nm的Cr，具体参数为：0.5pa,5min；

步骤4：将步骤3制备的样品放入CHCl

步骤5：使用化合物半导体刻蚀机(Oxford ICP180)对步骤4中已清洗掉PS微球的样品进行SiO

步骤6：使用浓度为60％的KOH溶液，在60℃油浴条件下，对步骤5制备的样品进行纳米结构刻蚀，刻蚀时间为8分钟，获得边长为300nm的倒金字塔结构，每个金字塔结构的间隔为150nm；

步骤7：使用磁控溅射对步骤6制备的SERS模具(具有纳米金字塔结构)表面镀一层厚度为200nm的金膜，磁控溅射的参数为：0.5pa，10分钟；

步骤8：结合步骤7获得的样品尺寸，使用金刚石硅片切割笔，将4寸SiO

步骤9：使用匀胶机(KW-4A)，将环氧树脂旋涂在步骤8制备的硅片表面，具体参数为：(800r/s，15s)，(2000r/s，60s)；

步骤10：将步骤7制备的镀有金膜的样品粘贴在步骤9制备的样品上，在自然环境下放置24小时，进行干燥处理；

步骤11：使用机械揭除的方法，将步骤10制备的样品揭开，使模具和金膜分开，制备完成纳米金字塔结构；

步骤12：使用匀胶机(KW-4A)将融化的石蜡旋涂在覆盖有单层石墨烯、尺寸为20×20mm铜衬底上，匀胶机参数为：(800r/s，10s)，(1000r/s，120s)；

步骤13：将步骤12制备的样品(石蜡-石墨烯-铜)，放置在FeCl

步骤14：待接触FeCl

步骤15：将步骤14制备的石蜡-石墨烯的双层薄膜转移至步骤11制备的纳米金字塔结构表面，在自然环境下放置24小时，进行干燥；

步骤16：将步骤15晾干后的石蜡-石墨烯-纳米金字塔混合平台，在40℃热台上放置1小时，使石蜡-石墨烯层与纳米金字塔结构紧密贴合；

步骤17：将步骤16制备的样品浸泡在正己烷溶液中，60℃水浴30分钟，去除石墨烯上的石蜡，再使用常温的正己烷溶液、乙醇溶液和去离子水对样品上残留的石蜡进行清洗，获得石墨烯-纳米金字塔混合平台；

步骤18：使用匀胶机(KW-4A)在步骤17制备的石墨烯-纳米金字塔混合平台上旋涂一层厚度为13μm的SU-8光刻胶，具体参数为：500r/min，15s；3000r/min，60s；

步骤19：将步骤18制备的样品放置在95℃热台上，加热5分钟，进行软烘焙；

步骤20：使用紫外深度光刻机(URE-2000S)在步骤18制备的样品使用光刻模板(尺寸为5000×5000μm，间隔为500μm的槽栅结构)，进行曝光处理，曝光时间15s；

步骤21：将步骤20制备的样品放置在95℃热台上，加热4分钟，进行中烘；

步骤22：步骤20处理后的样品，放置在显影液中浸泡3分钟，使用异丙醇冲洗1分钟，获得尺寸为5000×5000×13μm，间隔为500μm的槽栅结构；

步骤23：将人慢性髓原白血病细胞(K562)培养后的液体，使用移液管将0.5μL的液体滴加在槽栅结构的其中一个“井”内，使用石英盖玻片覆盖在“井”上，在该槽栅结构中的细胞的OM图片如图3所示；

步骤24：使用显微拉曼成像光谱仪(ThermoFisherDXRxi)对步骤21“井”内的细胞进行SERS测试，获取SERS光谱如图4所示。

从图3中可以看出，细胞在该槽栅结构中容易被观察到，且状态较好；

从图4中可以看出，在该槽栅结构中细胞的SERS光谱比较稳定，且重复性好；

从图5中可以看出，该槽栅结构可以使细胞在3个小时内一直保持位置固定。

具体实施例2

本发明实施例的一种基于SERS的液体细胞无标签检测平台的制备及应用方法，包括以下步骤：

步骤1：使用LB-Troube将直径为500nm的PS微球，通过自组装的方式密集的排列在4寸硅片的表面；

步骤2：使用化合物半导体刻蚀机(Oxford ICP180)对步骤1中4寸硅片表面的PS微球进行刻蚀，刻蚀为直径是300nm的球形，刻蚀参数为：200w，O

步骤3：使用真空镀膜机(HHV TF500)在步骤2获得的基板表面镀一层厚度为20nm的Cr，具体参数为：0.5pa,5min；

步骤4：将步骤3制备的样品放入CHCl3溶液中，超声清洗30分钟，将样品表面的PS微球完全清洗掉；

步骤5：使用化合物半导体刻蚀机(Oxford ICP180)对步骤4中已清洗掉PS微球的样品进行SiO2刻蚀，将无Cr覆盖区域(原PS微球所在位置)，裸露的厚度为50nm的SiO2刻蚀掉，刻蚀参数为：800w,Ar 70sccm,CHF

步骤6：使用浓度为60％的KOH溶液，在60℃油浴条件下，对步骤5制备的样品进行纳米结构刻蚀，刻蚀时间为8分钟，获得边长为300nm的倒金字塔结构，每个金字塔结构的间隔为150nm；

步骤7：使用磁控溅射对步骤6制备的SERS模具(具有纳米金字塔结构)表面镀一层厚度为200nm的金膜，磁控溅射的参数为：0.5pa，10分钟；

步骤8：结合步骤7获得的样品尺寸，使用金刚石硅片切割笔，将4寸SiO2/Si硅片切为相应尺寸；

步骤9：使用匀胶机(KW-4A)，将环氧树脂旋涂在步骤8制备的硅片表面，具体参数为：(800r/s，15s)，(2000r/s，60s)；

步骤10：将步骤7制备的镀有金膜的样品粘贴在步骤9制备的样品上，在自然环境下放置24小时，进行干燥处理；

步骤11：使用机械揭除的方法，将步骤10制备的样品揭开，使模具和金膜分开，制备完成纳米金字塔结构；

步骤12：使用匀胶机(KW-4A)，将融化的石蜡旋涂在覆盖有单层石墨烯、尺寸为20×20mm铜衬底上，匀胶机参数为：(800r/s，10s)，(1000r/s，120s)；

步骤13：将步骤12制备的样品(石蜡-石墨烯-铜)，放置在FeCl

步骤14：待步骤13中接触FeCl3溶液一侧的Cu元素被完全腐蚀后，将石蜡-石墨烯的混合薄膜使用亲水硅片转移至干净的去离子水中；

步骤15：将步骤14制备的石蜡-石墨烯的双层薄膜转移至步骤11制备的纳米金字塔结构表面，在自然环境下放置24小时，进行干燥；

步骤16：将步骤15晾干后的石蜡-石墨烯-纳米金字塔混合平台，在40℃热台上放置1小时，使石蜡-石墨烯层与纳米金字塔结构紧密贴合；

步骤17：将步骤16制备的样品浸泡在正己烷溶液中，60℃水浴30分钟，去除石墨烯上的石蜡，再使用常温的正己烷溶液、乙醇溶液和去离子水对样品上残留的石蜡进行清洗，获得石墨烯-纳米金字塔混合平台；

步骤18：使用匀胶机(KW-4A)在步骤17制备的石墨烯-纳米金字塔混合平台上旋涂一层厚度为5μm的SU-8光刻胶，具体参数为：500r/min，15s；4000r/min，60s；

步骤19：将步骤18制备的样品放置在95℃热台上，加热3分钟，进行软烘焙；

步骤20：使用紫外深度光刻机(URE-2000S)在步骤18制备的样品使用光刻模板(尺寸为5000×5000μm，间隔为500μm的槽栅结构)，进行曝光处理，曝光时间15s；

步骤21：将步骤20制备的样品放置在95℃热台上，加热2分钟，进行中烘；

步骤22：步骤20处理后的样品，放置在显影液中浸泡3分钟，使用异丙醇冲洗1分钟，获得尺寸为5000×5000×13μm，间隔为500μm的槽栅结构；

步骤23：将人慢性髓原白血病细胞(K562)培养后的液体，使用移液管将0.5μL的液体滴加在槽栅结构的其中一个“井”内，使用石英盖玻片覆盖在“井”上；

步骤24：使用显微拉曼成像光谱仪(ThermoFisherDXRxi)对步骤21“井”内的细胞进行SERS测试，获取SERS光谱。

综上所述，本发明提出了一种基于SERS光谱的液体细胞无标签检测平台及其制备方法和应用方法。本发明的平台首先使用微纳加工技术制备周期性纳米级结构，并在该纳米结构表面覆盖一层单层石墨烯，制备为石墨烯-纳米结构的混合平台，然后使用有掩膜曝光机在该混合平台上制备槽栅结构，将待测试的细胞溶液滴加在该槽栅结构的井中，盖上石英盖玻片，该“井”的微米级深度，使细胞与“井”底部的SERS混合平台保持紧密接触，同时细胞保持位置静止，进行SERS检测，获取液体内细胞的SERS光谱信息。本发明制备流程简单、使用方便，可根据细胞尺寸调整槽栅结构的深度，而且所需样本量少、无任何其他物质加入、保证了细胞的原始状态，重复性和可靠性均较高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。