高度纯化的重组人胰岛素(RHI)API及其生产方法

摘要

公开了用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)的方法，所述高度纯化的RHI的纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质(不包括如USP所规定的有关物质脱酰胺AsnA21‑RHI)为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。还公开了纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质为0.8％(w/w)或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的高度纯化的RHI的API组合物。

说明书

技术领域

本公开介绍了用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)及其组合物的方法。所述高度纯化的RHI适合用作RHI药物产品的活性药物成分(API)。

背景技术

人胰岛素是调节葡萄糖代谢的激素。所述人胰岛素蛋白由两条多肽链组成—20个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链，总共51个氨基酸。所述A和B多肽链通过A链半胱氨酸和与之配对的相应B链半胱氨酸之间的二硫键连接。所述二硫键和相应的半胱氨酸(Cys)是Cys

使用重组DNA技术合成重组人胰岛素API的基本技术在本领域是公知的。但是，将这些基本技术实施成稳健的生产/合成过程的技术挑战仍然是困难的技术挑战，因为在重组人胰岛素API的生产过程中产生类型和数量不同的杂质。而且，不同的制药公司在重组人胰岛素生产/合成过程中可能产生不同的杂质，因为不同的公司可以采用不同的生产工艺策略、不同的起始材料(例如单链前体(SCP)的序列不同)、不同的用于基因表达的表达宿主细胞等。在本公开中，“人胰岛素”或“胰岛素”可以与“重组人胰岛素”或“RHI”可互换和同义使用。

目前市场上的RHI药物产品含有一定水平的杂质。总杂质的典型水平在约1-2％(w/w)的范围内(不包括如美国药典(USP)对RHI所规定的有关物质脱酰胺Asn

另外，某些杂质可能难以除去，例如RHI的B链第31位处乙酰化的赖氨酸(赖氨酸

即使在SCP加工成RHI的过程中应用了数次纯化操作之后，杂质C在最终纯化的RHIAPI组合物中作为杂质仍然可以高达0.7％(w/w)。所以，为了生产高度纯化的RHI API，需要在RHI的生产/合成过程中减少杂质C的量的技术方案。因此，本公开通过提供用于生产基于RHI API的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质(不包括有关物质脱酰胺Asn

发明内容

本公开的示例性实施方案至少解决了上述问题和/或缺点，并且通过提供至少下面描述的优点来推进本领域。本公开的示例性实施方案的附加目的、优点和突出特征对于本领域技术人员来说将从下面的详细描述中变得显而易见，该详细描述结合附图公开了本公开的示例性实施方案。

用于生产高度纯化的RHI API的方法

首先，本公开提供了用于生产基于RHI API的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质为0.8％或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的高度纯化的重组人胰岛素(RHI)活性药物成分(API)的方法。总杂质不包括脱酰胺Asn

在优选的实施方案中，本公开中介绍的方法生产固体形式的高度纯化的RHI API，基于固体形式的高度纯化的的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低。在其它实施方案中，所公开的方法生产液体形式的RHI API，基于液体形式的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低。另外，所公开的方法生产固体形式或液体形式的RHI API，基于RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质(不包括有关物质脱酰胺Asn

如本文所定义，“高度纯化的重组人胰岛素API”或“高度纯化的RHI API”是指基于RHI API的总重量，总杂质为0.8％(w/w)或更低的重组人胰岛素API(固体形式或液体形式)。“总杂质(Total impurity)”或“总杂质(Total impurities)”是指除有关物质脱酰胺Asn

在一些实施方案中，用于生产高度纯化的RHI API的方法包括：

使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的两个赖氨酸残基，其中SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-(A链)]的结构式，其中C肽是由Arg

酶切SCP以产生Arg

应用第一次柱纯化操作以从Arg

对半酶切Arg

使Lys

应用第二次柱纯化操作以从Lys

对Lys

酶切Lys

使高度纯化的RHI API结晶以产生固体形式的高度纯化的RHI API；

其中，所述方法生产固体形式的高度纯化的RHI API，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，其中所述总杂质不包括脱酰胺Asn

在其它实施方案中，所述方法生产固体形式的高度纯化的RHI API，其纯度为99.3％(w/w)或更高，总杂质为0.5％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低，所有这些都基于固体形式的高度纯化的RHI API的总重量。固体形式的高度纯化的RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)在高度纯化的RHI API结晶成固体形式之后可以很快评估，例如在高度纯化的RHI API结晶成固体形式之后的6、12、24、48或72小时内。

在其它实施方案中，所述方法可以生产液体形式的高度纯化的RHI API，基于液体形式的高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.3％(w/w)或更高，总杂质为0.5％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。液体形式的高度纯化的RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)在最后的纯化操作之后可以很快评估，例如在最后的纯化操作之后的6、12、24、48或72小时内。方法100中的操作111是这种最后的纯化操作的示例性实施方案。在本公开方法的一些实施方案中，酶切SCP以产生Arg

在所述方法的一些实施方案中，所述第一次柱纯化操作利用阴离子交换柱层析。在所述方法的一些实施方案中，所述第二次柱纯化操作利用阴离子交换柱层析。在所述方法的其它实施方案中，第三次柱纯化操作利用RP-HPLC以将Lys

在一些实施方案中，第三次柱纯化操作和第四次柱纯化操作各自采用RP-HPLC。在一些实施方案中，第三次柱纯化操作和第四次柱纯化操作各自采用具有C18柱的RP-HPLC。在其它实施方案中，第三次柱纯化操作和第四次柱纯化操作各自采用具有C8柱的RP-HPLC。

在所述方法的一些实施方案中，将Lys

在一些实施方案中，所述方法还包括使用复性缓冲液使SCP复性。在其它实施方案中，所述方法还包括可选地使用抑肽酶除去胰蛋白酶。

在一些实施方案中，通过第二次柱纯化操作分离的一种或多种杂质至少包括Arg

在其它实施方案中，用于生产高度纯化的RHI API的方法包括：

使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的至少两个赖氨酸残基，其中SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-(A链)]的结构式，其中C肽至少包含Arg

酶切Arg

使Lys

应用多次柱纯化操作以产生用作API的高度纯化的RHI，其中至少一次所述柱纯化操作将Lys

酶切Lys

使高度纯化的RHI API结晶以产生固体形式的高度纯化的RHI API；

其中，所述方法生产固体形式的高度纯化RHI API，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，其中所述总杂质不包括脱酰胺Asn

在其它实施方案中，用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)的方法包括：

使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的至少两个赖氨酸残基，其中SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-(A链)]的结构式，其中C肽至少包含Arg

酶切Arg

使Lys

应用多次柱纯化操作以产生用作API的高度纯化的RHI，其中至少一次所述柱纯化操作将Lys

酶切Lys

其中，所述方法生产液体形式的高纯度RHI API，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，其中所述总杂质不包括脱酰胺Asn

在一些实施方案中，所述多次柱纯化操作包括：

从Arg

从Lys

第三次柱纯化操作，其是将Lys

从RHI中至少分离Lys

另外，所公开的方法进一步将杂质E的量减少至0.2％(w/w)或更低，杂质E是Thr

在一些实施方案中，所公开的方法将杂质C的量减少至基于高度纯化的RHI API的总重量的0.1％(w/w)或更低，包括但不限于0.09％(w/w)或更低，0.08％(w/w)或更低，0.07％(w/w)或更低，0.06％(w/w)或更低，0.05％(w/w)或更低，0.04％(w/w)或更低，0.03％(w/w)或更低，0.02％(w/w)或更低，0.01％(w/w)或更低，或未检出。在其它实施方案中，杂质C是乙酰化的Lys

在其它实施方案中，所公开的方法将杂质E的量减少至基于高度纯化的RHI API的总重量的0.25％(w/w)或更低，包括但不限于0.24％(w/w)或更低，0.23％(w/w)或更低，0.22％(w/w)或更低，0.21％(w/w)或更低，0.20％(w/w)或更低，0.19％(w/w)或更低，0.18％(w/w)或更低，0.17％(w/w)或更低，0.16％(w/w)或更低，0.15％(w/w)或更低，0.14％(w/w)或更低，0.13％(w/w)或更低，0.12％(w/w)或更低，0.11％(w/w)或更低，0.10％(w/w)或更低，0.09％(w/w)或更低，0.05％(w/w)或更低，0.04％(w/w)或更低，0.03％(w/w)或更低，0.02％(w/w)或更低，0.01％(w/w)或更低，或未检出。

高度纯化的RHI API的组合物

第二，本发明还提供了用于活性药物成分(API)的组合物，所述组合物包含固体形式或液体形式的高度纯化的重组人胰岛素(RHI)，其具有99.0％(w/w)或更高的纯度，0.8％(w/w)或更低的总杂质和0.1％(w/w)或更低的杂质C，其中w/w表示API的重量比重量并分别基于固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的总重量。如本文所公开的，总杂质不包括有关物质脱酰胺Asn

在组合物的一些实施方案中，固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的纯度为99.3％(w/w)或更高，总杂质为0.5％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低，其中w/w表示API的重量比重量并且分别基于固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的总重量。

还在组合物的其它实施方案中，固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低，和杂质E为0.2％(w/w)或更低，其中w/w表示API的重量比重量并且分别基于固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的总重量。在组合物的其它实施方案中，固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的纯度为99.3％(w/w)或更高，总杂质为0.5％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低，和杂质E为0.2％(w/w)或更低，其中w/w表示API的重量比重量并且分别基于固体形式或液体形式的高度纯化的RHI API的总重量。

在一些实施方案中，API组合物为固体形式。所述高度纯化的固体RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)在高度纯化的液体RHI API结晶成固体形式之后可以很快评估，例如在所述高度纯化的液体RHI API结晶成固体形式之后的6、12、24、48或72小时内。在其它实施方案中，高度纯化的RHI API组合物是液体形式，例如水性形式。所述高度纯化的液体RHIAPI的纯度和杂质百分比(w/w)在最后的纯化操作之后可以很快评估，例如在最后的纯化操作之后的6、12、24、48或72小时内。最后的纯化操作的示例性实施方案是方法100中的操作111。这些高度纯化的RHI API组合物的示例性实施方案在实施例1-8中提供，并且这些API组合物可以使用方法100生产。公开的高度纯化的RHI API组合物可用于RHI药物产品，例如用于皮下注射或静脉内注射的RHI水溶液。

还在组合物的其它实施方案中，基于所述高度纯化的RHI API的总重量，所述高度纯化的RHI API的杂质C的量为0.1％(w/w)或更低，包括但不限于0.09％(w/w)或更低，0.08％(w/w)或更低，0.07％(w/w)或更低，0.06％(w/w)或更低，0.05％(w/w)或更低，0.04％(w/w)或更低，0.03％(w/w)或更低，0.02％(w/w)或更低，0.01％(w/w)或更低，或未检出。

在组合物的其它实施方案中，基于高度纯化的RHI API的总重量，所述高度纯化的RHI API的杂质E的量为0.25％(w/w)或更低，包括但不限于0.24％(w/w)或更低，0.23％(w/w)或更低，0.22％(w/w)或更低，0.21％(w/w)或更低，0.20％(w/w)或更低，0.19％(w/w)或更低，0.18％(w/w)或更低，0.17％(w/w)或更低，0.16％(w/w)或更低，0.15％(w/w)或更低，0.14％(w/w)或更低，0.13％(w/w)或更低，0.12％(w/w)或更低，0.11％(w/w)或更低，0.10％(w/w)或更低，0.09％(w/w)或更低，0.05％(w/w)或更低，0.04％(w/w)或更低，0.03％(w/w)或更低，0.02％(w/w)或更低，0.01％(w/w)或更低，或未检出。

附图说明

当结合附图时，本公开的某些示例性实施方案的上述和其它示例性特征和优点将从下面对其某些示例性实施方案的描述中变得更加显而易见，其中：

图1是示出了描述为方法100的用于生产高度纯化的RHI API的所公开方法的示例性实施方案的工艺流程图。

图2，其包括图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和2H，描述了根据本公开的实施方案将SCP和原胰岛素加工成高度纯化的RHI API。

图3是描述用于生产纯度较低的RHI API的方法的比较实施例1的工艺流程图。

图4是描述用于生产纯度较低的RHI API的方法的比较实施例2的工艺流程图。

图5是描述用于生产纯度较低的RHI API的方法的比较实施例3的工艺流程图。

在所有附图中，相同的附图标记将被理解为是指相同的元件、特征和结构。

具体实施方式

参考附图，本公开中例示的内容是提供来以帮助全面理解本公开的示例性实施方案。虽然已经结合某些实施方案描述了本公开，应当理解，本公开不限于所公开的实施方案，相反，本公开旨在覆盖包括在所附权利要求书及其等同物的精神和范围内的各种改进和等同设置。因此，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本公开、所公开的实施方案或所请求保护的实施方案的范围和精神的情况下，可以对本文所述的示例性实施方案进行各种改变和改进。

词语“示例性的”用于本文是指“作为例子、实例或说明”。本文描述为“示例性”的任何实施方案不必理解为是优选的或优于其它实施方案。同样地，术语“实施方案”不要求所有实施方案都包括所讨论的特征、优点或操作模式。

除非本文另有定义，与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。与此相关使用的命名法和在本文描述的技术是本领域中已知和常用的那些。而且，为了清楚和简洁，省略了对众所周知的功能和结构的描述。

在本文和权利要求全篇中，术语“约”和“基本上”用作近似术语，而不是程度术语，并反映与测量、重要参数和互换性相关的固有变化，所有这些都如本领域普通技术人员所理解的那样。而且，应当理解，在本公开和所附权利要求全篇中，即使数值之前没有术语“值之前，其也由该术语隐含地修饰，除非另有说明。

本文使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该/所述(the)”，除非上下文另外清楚地指出，否则也意欲包括复数形式。还应当理解，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(have)”和/或“具有(having)”当本文使用时，具体指明所述特征、整数、动作、步骤、操作、元素和/或成分的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、动作、步骤、操作、元素、成分和/或其组的存在或增加。

为适合用作活性药物成分(API)，生产的RHI应当具有高纯度和低杂质特征(profile)，例如根据本文所公开的方法生产的RHI，所述方法可以生产固体形式或液体形式的RHI API，全部分别基于液体或固体形式的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质(不包括有关物质脱酰胺Asn

如本文所用，“总杂质(Total impuirty)”或“总杂质(Total impurities)”是指除有关物质脱酰胺Asn

“高度纯化的重组人胰岛素API”或“高度纯化的RHI API”是指固体形式或液体形式的重组人胰岛素API，分别基于固体或液体形式的RHI API的总重量，其总杂质为0.8％(w/w)或更低。为了本文的简洁，基于RHI API的总重量，总杂质为0.8％(w/w)或更低的RHIAPI被认为是“高度纯化的RHI API”。例如，基于RHI API的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质为0.8％(w/w)或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的RHI API(固体形式或液体形式)被认为是“高度纯化的RHI API”。

本公开的实施方案的方面包括用于减少被称作杂质C的难以除去杂质的方法。杂质C具体地是指RHI的B链的第31位乙酰化的赖氨酸(赖氨酸

乙酰化赖氨酸残基

杂质C是在将单链前体(SCP)加工成RHI的过程中由杂质C前体生成的。RHI的合成(例如加工)包括被称为单链前体(SCP)分子的未成熟形式的RHI，所述单链前体分子由A链多肽和B链多肽以及位于它们中间的C肽组成。SCP分子的各种重组形式利用了C肽的各种长度，例如具有结构式I、II或III的SCP序列。本领域已知的SCP序列包括从1个氨基酸残基到多达35个(或更多个)氨基酸残基的C肽序列。从SCP加工RHI API的一个操作是从A链和B链中切割并除去C肽。然而，为了除去C肽而应用酶切割操作，由于特定酶敏感位点上的错误定向切割，所述酶切割操作通常产生额外的杂质。因此，RHI加工的难以除去杂质可能因特定的C肽序列而不同。

杂质C前体可以是SCP中乙酰化的赖氨酸

杂质C在最终纯化的RHI API中可占0.5-0.7％(w/w)杂质。因此，如果将最终纯化的RHI组合物中的杂质C的量降低至0.1％(w/w)或更低，则可以获得生产纯度99.0％(w/w)或更高且总杂质0.8％(w/w)或更低的高度纯化的RHI API的能力。杂质C难以除去的一个原因是因为它的等电点约为5.40，这与RHI和其它杂质的等电点近似。另外，杂质C难以除去是因为它对CPB酶消化有抗性。难以除去杂质C的另一个原因是，如对比实施例中所述，纯化操作的常规优化不能显著地将杂质C的量降低至基于RHI API的总重量的0.1％(w/w)或更低。因此，需要一种除去或显著降低杂质C的技术方案。

由此，本公开通过提出用于在SCP加工成RHI的过程中显著减少杂质C的方法解决了该技术难题。特别地，基于RHI API的总重量，所公开的方法显著地将杂质C的量降低至0.1％(w/w)或更低，并且将总杂质的量降低至0.8％(w/w)或更低，。

本公开的实施方案介绍了用于生产固体形式的RHI API的方法，基于固体形式的RHI API的总重量，所述RHI API的纯度为99.0％(w/w)或更高，和总杂质为0.8％(w/w)或更低。特别地，本公开的实施方案包括用于在SCP加工成RHI的过程中将杂质C减少至0.1％(w/w)或更低的方法，该方法继而导致固体形式的高度纯化的RHI API的生产，基于固体形式的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，和总杂质为0.8％或更低。

另一个难以除去杂质是杂质E，即Thr

在一些实施方案中，基于RHI API的总重量，所公开的方法生产纯度为约99.0％(w/w)、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的RHI API。在一些实施方案，基于RHI API的总重量，所公开的方法生产总杂质为约0.8％(w/w)、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更低的RHI API。在一些实施方案中，基于RHI API的总重量，所公开的方法将RHI API中杂质C减少到约0.10％(w/w)、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％或更低。

如本领域中通常理解地，“％(w/w)”表示基于“重量比重量(weight per weight)”或“重量比重量(weight by weight)”的百分比。在整个本公开中，“％”与“％(w/w)”同义和可互换使用。为了本公开整篇的简洁起见，当“(w/w)”是关于RHI(即高度纯化地RHI API、RHI API、RHI、Lys

另外，在所公开的方法中，相对于特定组分在特定时间点的总重量，纯度或杂质百分比(w/w)可以在不同的时间点评估。例如，可以在柱纯化步骤之后评估纯度或杂质百分比(w/w)。例如，在方法100的操作109之后，Lys

人胰岛素是天然人胰岛素中存在的未经修饰的人胰岛素。如本领域已知地，人胰岛素是一种调节葡萄糖代谢的激素，它由两条多肽链组成——21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链，总共51个氨基酸。A和B多肽链通过A链半胱氨酸和与之配对的B链半胱氨酸之间的二硫键连接。所述二硫键和相应的半胱氨酸(Cys)是Cys

如本文所述，人胰岛素由两条多肽链组成，21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链，总共51个氨基酸，在Cys

“氨基酸残基”或“残基”是指其中羟基(即OH)已从羧基(即COOH)上除去和/或氢原子(即H

如本文所用，“切割”、“消化”、“酶切割”、“酶消化”、“切割(cleaving)”、“消化(digesting)”、“酶切割(enzyme-cleaving)”和类似术语指由酶(例如羧肽酶B(CPB)或胰蛋白酶)进行的肽链中氨基酸之间键的断裂。

RHI采用通常称为前胰岛素原的单链前体(SCP)分子合成。“SCP”与术语“前胰岛素原”可互换和同义使用。SCP通常包括前导肽序列、具有21个氨基酸的A链、具有30个氨基酸的B链以及由1-35个(或更多个)氨基酸组成的连接A链和B链的C肽。所述前导肽序列也可以被称作信号肽。SCP可以使用任何合适的一系列操作来合成，包括基因表达、发酵、包涵体分离、增溶和磺化。用于SCP合成的常用主宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、酵母、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)或其它适用于重组蛋白表达的改造菌株。因此，本公开实施方案中的SCP可以通过本领域已知的任何合适的方法来生产。在本公开的一些实施方案中，SCP是使用Ferring中公开的技术合成的。参见欧洲专利No.EP0871474B1，名为“人胰岛素的生产”，申请日为1994年12月29日，授权日为2007年3月1日，在此引入其全部内容作为参考。在本公开的一些实施方案中，使用大肠杆菌作为主宿主细胞合成SCP。在本公开的其它实施方案中，使用酵母作为主宿主细胞合成SCP。

在本公开的一些实施方案中，SCP具有由2个氨基酸组成的C肽，精氨酸作为X

在其它实施方案中，C肽包含Lys

在一些实施方案中，SCP分子由结构式I表示：

结构式I

(X

根据结构式I，

X

X

X

根据结构式I，

X

根据结构式I，

X

X

X

根据结构式I，

X

在本公开的一些实施方案中，根据结构式I的SCP包括含有AX

5′AX

在本公开的一些实施方案中，SCP由结构式II表示：

结构式II

(X

根据结构式II，

X

X

X

根据结构式II，

X

根据结构式II，

X

X

X

X

根据结构式II，

X

在一些实施方案中，根据结构式II的SCP，前导肽序列X

5′AX

在一些实施方案中，SCP可以由结构式III表示：

结构式III

(X

其中在结构III中，C肽由KR-X

在结构式I、II或III的一些实施方案中，SCP还包括杂质C的前体，例如C肽中乙酰化的赖氨酸

本公开的实施方案包括按照任何合适的表达方法或合成技术合成SCP。在合成之后，SCP(即前胰岛素原)可以被处理(例如通过酶切)以除去前导肽以产生胰岛素原。在一些实施方案中，前胰岛素原用胰蛋白酶消化，以除去前导肽序列。除去前导肽之后，如图2A所示，胰岛素原具有A链、B链和C肽。因此，应用另外的纯化和酶切操作，以通过除去C肽和杂质将胰岛素原转化为RHI。

生产纯度为99.0％或更高、总杂质为0.8％或更低和杂质C为0.1％或更低的高度纯化的RHI API的方法。

本公开的实施方案是针对用于将SCP加工成基于RHI API的总重量纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质为0.8％(w/w)或更低且杂质C的量为0.1％(w/w)或更低的高度纯化的RHI API的方法。在一个优选的实施方案中，所述高度纯化的RHI API是固体形式。在其它实施方案中，所述高度纯化的RHI API是液体形式，例如水性形式。

在一些实施方案中，如图1中所示的方法100包括用于纯化基于RHI API的总重量纯度为99.0％(或更高)(w/w)的RHI的操作101、102、103、104、105、106、107、108、109、110和111。方法100以具有结构式I、II或III的SCP开始。在方法100的这个示例性实施方案中，SCP序列具有结构式I，其具有仅两个氨基酸的短C肽序列，Arg

在操作101，使用本领域已知的复性缓冲液来使SCP复性。操作101使SCP复性以形成如图2A中所示的存在于天然人胰岛素和RHI中的正确的二硫键(例如，分别是Cys

在操作102，赖氨酸保护基团(例如，柠康酸酐、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz，Z)或烯丙氧羰基(Alloc))被应用于前胰岛素原，以保护胰岛素原中存在的两个赖氨酸残基。在该示例性实施方案中，胰岛素原蛋白的赖氨酸残基存在于C肽的Lys

操作103是第一次酶切操作。在方法100的这个示例性实施方案中，胰蛋白酶被应用于胰岛素原。如图2B-2C中所示，胰蛋白酶切割：(i)前导肽序列的Arg

在操作104，第一次柱纯化操作利用阴离子交换柱层析以从Arg

在阴离子交换柱层析中，离子交换树脂含有带正电荷的基团(即阳离子)，其又会与带负电荷的分子结合。阴离子交换柱层析可以在较高的pH水平下进行，特别是在目标肽的等电点以上的pH下进行，这样目标蛋白具有负电荷并将与带正电荷的树脂结合。因此，在操作104结束时，继续进入下一操作的批料主要包含Arg-Lys-RHI和杂质。

操作105包括第二次酶切操作。在操作105，向Arg-Lys-RHI应用羧肽酶B(CPB)。CPB对酶切碱性氨基酸例如精氨酸和赖氨酸的肽键特别有效。在操作105，在一些实施方案中，向Arg-Lys-RHI应用浓度为蛋白质的约1/10000(w/w)的CPB。在操作105，在一些实施方案中，CPB可以在约7.0到约10.0、约7.0到约8.0、约7.5到约8.5、约8.0到约9.0、约8.5到约9.5或约9.0至约10.0的范围的pH下应用。在操作105，在一些实施方案中，CPB可以在约22℃到约28℃、约23℃到约27℃或约24℃到约26℃的范围的温度下应用。在操作105，在一些实施方案中，CPB可应用至少约1、2、3、4、5、6或更多小时。

如图2E所示，因为在(X

参照操作105，向Arg-Lys肽中加入CPB的结果是产生杂质C。随着在操作105中产生杂质C，技术挑战成为从Lys-RHI中除去杂质C。

继续参照操作105，因为C肽只有两个氨基酸残基，该操作有效地将C肽对半切割，如图2E所示。这与C肽在单次酶切割操作中被整个切割的方法不同。在单次酶切割操作中切割下整个C肽(例如，两个或所有氨基酸)的动机是为了避免由多次酶操作带来的额外杂质，这与生产高度纯化的RHI的目标相悖。而且，额外的杂质会需要额外的纯化操作，这降低了产率并且使整个制备工艺更复杂。因此，先前的方法都用一个消化操作切割下整个C肽。

虽然本公开和根据本公开的实施方案的方法不受任何特定理论的约束，该方法(例如，100)采用附加的酶消化操作105和操作109联合酶切C肽，出乎意料地产生了杂质C的量为0.1％(w/w)或更低的RHI API，这使得能够生产高度纯化的固体形式的RHI API，基于固体形式的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低。根据本公开的实施方案，通过增加酶切割操作的次数，可以将RHI API中杂质C的量降低到0.1％(w/w)或更低。

参照操作106，所述Lys-RHI中Lys

在一些实施方案中，参照操作107，抑肽酶可任选地应用于去保护的Lys-RHI，以除去来自操作103的残留的胰蛋白酶。

操作108是第二次柱纯化操作，其基于电荷利用阴离子交换柱层析从Lys-RHI中分离Arg

在操作108结束时，继续进入下一操作的批料主要包含Lys-RHI和在操作108中未除去的杂质，例如杂质C。

操作109是第三次柱纯化操作。在操作109之前，该批料具有NMT(不超过)20％(w/w)杂质。操作109采用使用C18相柱的反相高效液相色谱(RP-HPLC)。值得注意的是，在操作109也可以使用其它相柱规格，例如C8相柱。在一些实施方案中，RP-HPLC还可包括半制备柱、制备柱或其组合。在一些实施方案中，所述半制备柱是长度为约250mm和内径为约10.0mm的柱，如表1所示。在一些实施方案中，所述制备柱是长度为约250mm和内径为约21.2mm的柱。在另一些实施方案中，所述制备柱是长度为约350mm和内径为约100mm的柱。C18相柱可以采用3μm到50μm(或包含在其中的任何范围)的粒度，例如3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm，30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。

在操作109，基于杂质C和其它杂质各自的疏水性，使用所述C18相柱和RP-HPLC工艺从Lys-RHI中分离杂质C和其它杂质。在操作109，在一些实施方案中，所述柱层析采用水或水性缓冲液(例如(NH

在操作109结束时，继续进入下一操作的批料主要包含Lys-RHI及约0.10％(w/w)或更低的杂质C(乙酰化的Lys-RHI)。该柱纯化操作109与酶消化操作105相结合，出乎意料地产生了含有基于Lys-RHI的总重量0.1％(w/w)或更低的杂质C的Lys-RHI，进而最终生产了高度纯化的RHI API，该RHI API具有基于所述高度纯化的RHI API的总重量0.1％(w/w)或更低的杂质C。

所述RP-HPLC的工艺可以包括任何合适的二氧化硅基树脂。用于RP-HPLC的二氧化硅基树脂的非限制性例子包括C18树脂，其包括18个碳原子作为固定相。在一些实施方案中，柱中也可以采用其它规格的碳分子，如C4(4个碳原子)、C5(5个碳)、C6(6个碳原子)、C8(8个碳原子)、C12(12个碳原子)、C16(16个碳原子)、C18(18个碳原子)和C20(20个碳原子)。除了碳键合的二氧化硅之外，纯二氧化硅、氰基键合的二氧化硅、苯基键合的二氧化硅和其它合适的二氧化硅也可用于RP-HPLC中。

在其它实施方案中，所述RP-HPLC具有约50mm、100mm、200mm、300mm、400mm、500mm、600mm或更大的内径，这取决于商业生产RHI API的规模需要。还在其它实施方案中，所述RP-HPLC的柱长度为约200mm、250mm、300mm、350mm、400mm、450mm、500mm、550mm、600mm或更长，这取决于商业生产RHI API的规模需要。

操作110是第三次酶切割操作。在操作110，因为Lys不再受到保护，CPB能够酶切Lys

操作111是第四次柱纯化操作。操作111采用使用C18柱的反相高效液相色谱(RP-HPLC)来除去Lys

在操作111之后，方法100进一步包括结晶操作(图1中未示出)，通过采用任何合适的结晶技术(例如施加锌和真空干燥)以生产固体形式的RHI。经操作111，所述高度纯化的RHI是固体形式的。

因此，如下述实施例1-8所示，方法100生产出高度纯化的RHI API，基于所述高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。另外，如实施例1-4和7-8所示，方法100可以生产出一种RHI API，全部基于所述高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低，合杂质E为0.2％(w/w)或更低。这种高度纯化的RHI由于其高纯度和低杂质特点而适合用作API。另外，RHI API是固体形式的。

实施例

实施例1-4：所公开的方法生产出纯度为99.0％或更高、总杂质为0.8％或更低和杂质C为0.1％或更低的高度纯化的RHI API。

如下表1所示，实施例1-4采用方法100来生产固体形式的高度纯化的RHI API，基于所述固体形式的高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。在表1中，总杂质包括杂质C、杂质X4、杂质D、杂质E和杂质Z。所述总杂质不包括有关物质脱酰胺Asn

而且，出乎意料地，在实施例1-4中，方法100将杂质E的量减少到0.2％(w/w)或更低，低至0.12％(w/w)，平均值是0.15％(w/w)或更低。值得注意的是，没有在方法100的操作110中使用可选的水稀释步骤，实施例1-4出乎意料地减少了杂质E的量。

表1-实施例1-4的杂质特征-固体形式的高度纯化的RHI API

在表1中，n.d指未检出和/或＜0.05％。

表2-表1中鉴别的杂质

*由于杂质低于0.10％(w/w)，杂质X4没有被鉴定。当杂质低于0.1％(w/w)时，FDA通常不要求杂质鉴别。

为了说明本公开取得的显著技术进步，下面提供对比实施例1-3以显示常规纯化技术不能生产高度纯化的RHI API，基于所述高度纯化的RHI API的总重量，该RHI API的纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。

对比实施例1-用于制备纯度较低的RHI的另一种方法。

对比实施例1是生产RHI API的另一种方法，并在图3中以方法300提供。如图3所示，操作301是使用复性缓冲液使前胰岛素原复性。对比实施例1基于使用在Ferring中公开的至少一些方法生产的RHI。

在操作302，将赖氨酸保护基团柠康酸酐、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz，z)或烯丙氧羰基(Alloc)应用于胰岛素原，以保护存在于胰岛素原中的赖氨酸残基，它们是C肽的Lys

操作303是第一个酶切操作。在操作303，胰蛋白酶被应用于胰岛素原。在操作303，胰蛋白酶切割：(i)前导肽序列的Arg

操作304是第一次柱纯化操作。在操作304，所述第一次柱纯化操作是阴离子交换柱层析，以从Arg

在操作305，通过除去赖氨酸保护基团，在Lys

可选地，在操作306，应用抑肽酶以消除来自操作303的残留的胰蛋白酶。

操作307是第二次柱纯化操作，其是阴离子交换柱层析以从RHI中分离C肽。在操作307结束时，继续进入下一操作的批料主要包含RHI和杂质，例如杂质C。

操作308是第二次酶切割操作。在操作308，因为Lys不再被保护，CPB切割Lys

操作309是第三次柱纯化操作。在操作309，采用C18柱的反相高效液相色谱(RP-HPLC)被用来除去C肽和其它杂质以产生RHI。然后将RHI结晶成固体形式。

方法300只能获得这种固体形式的RHI API，基于RHI API的总重量，其纯度为约97.8％(w/w)，总杂质为约1.7％，杂质C为约0.5％-0.8％(w/w)，和杂质E为约0.3％-0.5％(w/w)。在对比实施例1中，在RHI API结晶成固体形式之后，很快评估固体RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)。

显然，方法300不同于方法100，因为方法100包括酶消化操作105和柱纯化操作109，该两个操作产生了意想不到和令人吃惊的结果，即杂质C减少到0.1％(w/w)或更低，这又使得能够生产基于高度纯化的RHI API的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高和总杂质为0.8％(w/w)或更低的高度纯化的RHI。另外，方法100将杂质E的量减少到0.2％(w/w)或更低。

表3-实施例1-4(平均值)与对比实施例1比较

在表3中，实施例1-4的RHI API的纯度特征被平均，并与对比实施例1的纯度特征进行比较。显然，如表3所示，实施例1-4具有约0.33％(w/w)的总杂质，其显著低于对比实施例1的约1.73％(w/w)的总杂质。在表3中，纯度和杂质的百分比基于w/w，更具体地基于使用相应的RHI API的总重量的w/w。

对比实施例2-用于制备纯度较低的RHI API的另一种方法。

对比实施例2在图4中以方法400提供。值得注意的是，对比实施例1-2的不同主要是因为增加了柱纯化操作407。因此，在方法400中，操作401-406等同于操作301-306，操作408-410等同于操作307-309，因此为简洁起见，不需要再次描述。与操作309类似，柱纯化操作407是采用C18柱的RP-HPLC。将RHI结晶成固体形式。在对比实施例2中，在RHI API结晶成固体形式之后，很快评估固体RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)。

显然，即使在方法400中进行了数次柱纯化操作，方法400也不能生产固体形式的高度纯化的RHI API，基于所述高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高和杂质C为0.1％(w/w)或更低。相反，基于RHI API的总重量，方法400生产纯度为约98.1％(w/w)、总杂质为约73％(w/w)和杂质C为约0.5-0.7％(w/w)的固体形式的RHI API。

对比实施例3-用于制备纯度较低的RHI API的另一种方法。

对比实施例3在图5中以方法500提供。值得注意的是，对比实施例1和3区别主要在于阴离子交换柱操作(操作509和307)、RP-HPLC操作(操作507和309)的切换。因此，在方法500中，操作501-506等同于操作301-306，操作507等同于操作309，操作508等同于操作308，操作509等同于操作307，因此为简洁起见，不需要再次描述。方法500不能生产固体形式的高度纯化的RHI API，基于所述高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高和杂质C为0.1％(w/w)或更低。相反，基于RHI API的总重量，方法500生产了纯度为约96.5％(w/w)和杂质C为约0.5-0.7％(w/w)的固体形式的RHI API。在对比实施例3中，在RHIAPI结晶成固体形式之后，很快评估固体RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)。

显然，对比实施例1-3表明，柱纯化操作的常规优化没有解决显著降低RHI API中杂质C的技术问题。相反，如方法100中所公开地，酶消化操作105和柱纯化操作109的独特组合对生产固体形式的高度纯化地RHI API起重要作用，基于所述固体形式的高度纯化的RHIAPI的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。

对比实施例4-

表4-实施例1-4(平均值)与

显然，如表4所示，实施例1-4具有约0.33％的总杂质，这明显低于四批

实施例5-8：固体形式的高纯度RHI API的放大实施例。

为了证明方法100在放大环境例如大规模制造中的能力，将方法100应用于100mm×350mm的柱，如表5中的实施例5-8所示。关于表5中杂质的描述参见表2。在表5中，在纯化的RHI API结晶成固体形式之后，很快评估RHI API的纯度和杂质百分比(w/w)。

表5-放大实施例5-8的杂质特征-固体形式的高度纯化的RHI API。

在表5中，n.d指未捡出和/或＜0.05％。

如表5中放大实施例5-8所示，方法100生产出固体形式的高度纯化的RHI API，基于所述固体形式的高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低。而且，实施例7-8将杂质E的量降低到0.20％(w/w)。值得注意的是，没有在方法100的操作110中使用可选的水稀释步骤，实施例7-8出乎意料地减少了杂质E的量。然而，如实施例9所示，在方法100的操作110中使用可选的水稀释步骤，可以进一步减少杂质E的量。

实施例9-进一步减少杂质E的量。

可选地，在操作110，RP-HPLC可以用水稀释以进一步减少杂质E。为清楚说明，表6中所示的实施例9是在操作110将水稀释应用于RP-HPLC的研究，三(3)个样品分别稀释2倍(2x)、3倍(3x)或4倍(4x)。如表6所示，随着操作110中水稀释倍数的增加，杂质E百分比降低。因此，如果实施例1-8在方法100的操作110中利用该可选的水稀释步骤，则可以进一步减少杂质E的量。

表6-进一步减少杂质E。

用于高度纯化的RHI API的组合物，其纯度为99.0％或更高，总杂质为0.8％或更低，和杂质C为0.1％或更低。

还公开了用于活性药物成分(API)的组合物，其包含高度纯化的重组人胰岛素(RHI)，基于所述高度纯化的RHI API的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，和杂质C为0.1％(w/w)或更低，其中w/w表示所述高度纯化的RHI API的重量比重量。如本文所公开地，所述总杂质不包括有关物质脱酰胺Asn

另外，在所述组合物的其它实施方案中，基于高度纯化的RHI API的总重量，所述高度纯化的RHI API的纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低，和杂质E为0.2％(w/w)或更低。实施例1-4和7-8提供了这种组合物的示例性实施方案。

在所述组合物的一些实施方案中，基于高度纯化的RHI API的总重量，所述高度纯化的RHI API的纯度为99.3％(w/w)或更高。在一些实施方案中，所述高度纯化的RHI API组合物为固体形式。在其它实施方案中，所述高度纯化的RHI API组合物是液体形式，例如水性形式。实施例1-8中提供了这些API组合物的示例性实施方案，并且这些API组合物可以使用方法100生产。

所公开的高度纯化的API RHI组合物将为开发具有高纯度和更少杂质的重组人胰岛素药物产品，例如用于皮下注射或静脉内注射的重组人胰岛素药物制剂提供基础。

序列数目：5

长度：21

类别：PRT

生物体：人工序列

特征：

其它信息：人工序列的描述：天然人胰岛素A链。

序列：1：

长度：30

类别：PRT

生物体：人工序列

特征：

其它信息：人工序列的描述：天然人胰岛素B链。

序列：2：

长度：2

类别：PRT

生物体：人工序列

特征：

其它信息：人工序列的描述：C肽

序列：3：

Lys Arg

1

长度：3

类别：PRT

生物体：人工序列

特征：

其它信息：人工序列的描述：C肽

序列：4：

Lys Arg Arg

1

长度：5

类别：PRT

生物体：人工序列

特征：

其它信息：人工序列的描述：C肽

序列：5：

Lys Arg Gln Gly Arg

15