用于诊断和治疗犬科动物的退行性二尖瓣疾病的组合物和方法

摘要

本发明涉及用于诊断和治疗犬科动物的退行性二尖瓣疾病的方法和组合物。在一个实施方案中，诊断犬科动物的早期退行性二尖瓣疾病的方法可包括测量生物标志物的归一化相对丰度，该生物标志物选自由以下项组成的组：Erysipelatoclostridium、瘤胃菌科UCG014、丁酸球菌属、粪杆菌属以及它们的组合；以及如果所述Erysipelatoclostridium为0至0.5归一化相对丰度，所述瘤胃菌科UCG014为0至0.1归一化相对丰度，所述丁酸球菌属为0至0.1归一化相对丰度，或所述粪杆菌属为0至0.1归一化相对丰度，则确定所述犬科动物具有早期退行性二尖瓣疾病。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2018年12月27日的美国临时申请号62/785,373的优先权，该美国临时申请的公开内容以引用方式并入本文。

背景技术

犬科动物退行性二尖瓣疾病(DMVD)的特征在于缓慢进行性瓣膜变性，其引起二尖瓣回流，并且在一些狗中引起充血性心力衰竭(CHF)。虽然早期阶段的狗通常具有较长的临床前时期，但一旦进展到CHF阶段，疾病就更快地进展，平均存活时间小于12个月。因此，在早期临床前阶段进行干预以延长受影响狗的寿命是非常有意义的。近年来，由美国兽医内科学院(ACVIM)制定的同意委员会采用了用于对犬科动物DMVD进行分类的分期方案。处于发展成DMVD风险但在其他方面健康的狗被认为是阶段A；由于二尖瓣回流而具有心脏杂音但无CHF临床征象的狗被归类为阶段B；具有明显CHF临床征象的狗被归类为阶段C。由于不存在或存在心脏重塑，阶段B狗被进一步分成阶段B1或B2。

目前，已证明对早期临床前DMVD有效的唯一药物是pimobanden，其与任何药物一样具有副作用。目前，DMVD诊断的黄金标准为超声心动图，其不仅昂贵而且还需要高度专业化的兽医心脏病专家。因此，一直在寻求克服当前方法和治疗的缺点的有效诊断方法和治疗。

发明内容

本公开整体涉及用于诊断和治疗犬科动物的退行性二尖瓣疾病的组合物和方法。在一个实施方案中，诊断犬科动物的早期退行性二尖瓣疾病的方法可包括测量生物标志物的归一化相对丰度，该生物标志物选自由以下项组成的组：Erysipelatoclostridium、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)UCG014、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)以及它们的组合；以及如果所述Erysipelatoclostridium为0至0.5归一化相对丰度，所述瘤胃菌科UCG014为0至0.1归一化相对丰度，所述丁酸球菌属为0至0.1归一化相对丰度，或所述粪杆菌属为0至0.1归一化相对丰度，则确定所述犬科动物具有早期退行性二尖瓣疾病。

在另一个实施方案中，治疗犬科动物的退行性变二尖瓣疾病或减缓犬科动物的退行性二尖瓣疾病进展的方法可包括向犬科动物施用组合物，其中该组合物包含选自由以下项组成的组的益生菌：丁酸球菌属和粪杆菌属。

在另一个实施方案中，宠物食品可包含蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维和益生菌，所述益生菌选自由以下项组成的组：丁酸球菌属、粪杆菌属、以及它们的组合。

另外的特征和优点在本文中有所描述，并且在阅读下述具体实施方式之后将是显而易见的。

具体实施方式

如在本公开和所附权利要求中所用，单数形式“a，”“an”和“the”(“一个”、“一种”和“所述(该)”)包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种组合物”或“所述组合物”包括两种或更多种组合物。在“X和/或Y”的上下文中使用的术语“和/或”应解释为“X”或“Y”或“X和Y”。当在本文中使用时，术语“示例”和“诸如”(特别是当后跟项目列表时)仅是示例性和说明性的，不具有排他性或全面性。

如本文所用，“约”应理解为是指某一数值范围内的数字，例如所提及数字的-10％至+10％的范围、在所提及数字的-5％至+5％的范围内，或在一个方面在所提及数字的-1％至+1％的范围内，在一个特定方面在所提及数字的-0.1％至+0.1％的范围内。此外，本文中的所有数值范围都应理解为包含该范围内的所有整数或分数。另外，这些数值范围应理解为对涉及该范围内任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，1至10的公开应理解为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。

除非另外特别规定，否则本文表述的所有百分比都以组合物的干物质基础按重量计算。本领域的技术人员将认识到，术语“干物质基础”是指移除组合物中的任何游离水分后，再测量或确定组合物中成分的浓度或百分比。提及pH时，其值对应于利用标准设备在25℃处测量的pH。“量”可以是每份组合物或每个独立单位组合物中所提及组分的总量，以及/或者可以是按干重计的所提及组分的重量百分比。此外，“量”包括零；例如，化合物量的表述不一定意味着该化合物存在，除非后跟不含零的范围。

术语“食物”、“食物产品”和“食物组合物”意指旨在供动物摄取并且向动物提供至少一种营养物质的产品或组合物。此外，就这一点而言，这些术语是指产品或组合物呈即可食用的形式并且不仅仅是制备可食用产品或组合物的中间物，尽管在一些实施方案中可添加其它食物组合物。术语“宠物食物”意指旨在供宠物食用的任何食物组合物。术语“宠物”意指可得益于或享用本公开所提供组合物的任何动物。例如，宠物可以是鸟类动物、牛科动物、犬科动物、马类动物、猫科动物、山羊类动物、狼类动物、鼠科动物、绵羊类动物或猪类动物，但宠物也可以是任何合适的动物。

当提及食物组合物时，术语“完善且均衡”是指基于动物营养领域中公认的权威机构的推荐，含有适量和适当比例的所有已知必需营养物质，并且因此能够用作单独的膳食摄入来源以维持生命或促进生产，而不需添加补充营养来源的食物组合物。营养均衡的宠物食物和动物食物组合物在本领域内是广为人知且已得到了广泛的应用，例如，根据美国饲料管制协会(AAFCO)建立的标准配制的完善且均衡的食物组合物。

术语“伴侣动物”意指狗或猫。在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法涉及老年狗。在狗生命的最后25％中，其被视为老年狗。狗的寿命取决于其大小和/或其品种，但对本公开而言，老年狗为至少5岁(例如，至少6岁、至少7岁或至少8岁)的狗。

如本文所用，“归一化相对丰度”是指通过获取每个计数并除以每个样品中的总序列计数并用平方根转化而计算的每种微生物的量。

如本文所用，“早期退行性二尖瓣疾病”是指退行性二尖瓣疾病的阶段B。

如本文所用，“阶段A”是指具有发生退行性二尖瓣疾病的风险，但在其他方面具有健康心脏的狗。

如本文所用，“阶段B”是指由于二尖瓣回流而具有心脏杂音但没有充血性心力衰竭临床征象的狗。“阶段B”包括阶段B1(不存在心脏重塑)和阶段B2(存在心脏重塑)。

如本文所用，“阶段C”是指具有充血性心力衰竭的狗。

如本文所用，“退行性二尖瓣疾病”、“DMVD”、“黏液瘤二尖瓣疾病”和“MMVD”可互换使用，并且是指引起二尖瓣回流和/或充血性心力衰竭(CHF)的进行性瓣膜变性，并且包括阶段A、阶段B和阶段C。

“共混的”组合物仅具有至少两种组分，这些组分相对于彼此具有至少一种不同的特性，优选本公开的上下文中的至少水分含量和水活度。就这一点而言，将组合物描述为“共混的”并不意味着共混的组合物已经受有时称为“共混”的处理(即，混合各组分，使它们彼此无法区分)，并且在一个方面，将一种组分与其它组分混合以形成共混的组合物时(例如，将干燥组分与湿润的或半湿组分混合时)，避免此类处理。此外，就这一点而言，在共混的组合物中，相对于彼此具有至少一种不同特性的至少两种组分优选各自保持自己独特的特性和外观。

“湿润食物”是指含水量为约50％至约90％，并且在一个方面为约70％至约90％的宠物食品。“干燥食物”是指含水量小于约20％，并且在一个方面为小于约15％，并且在一个具体方面为小于约10％的宠物食品。“半湿食物”是指含水量为约20％至约50％，并且在一个方面为约25％至约35％的宠物食品。

“粗磨食物”在本文中与“块”同义使用，并且这两个术语均指干燥或半湿宠物食物的块料，其可具有粒料形状或任何其它形状，并且可通过将食物组合物切成独立块料而制成。粗磨食物的非限制性示例包括：颗粒；球丸；宠物食物块料、脱水肉、仿肉产品、蔬菜以及它们的组合；以及宠物小吃，诸如肉干或蔬菜干、生皮以及饼干。“仿肉制品”是外观、质地和物理结构类似于天然肉片的肉糜产品。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指具有以下作用的本发明化合物的量：(i)治疗或预防特定疾病、病症或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或者(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作。在一些方面，特定疾病、病症或障碍可以是退行性二尖瓣疾病。

术语“膳食补充剂”是指旨在供动物在正常饮食之外摄取的产品。膳食补充剂可以是任何形式，例如固态、液态、凝胶、片剂、胶囊、粉末等。在一个方面，可以方便的剂型提供膳食补充剂。在一些实施方案中，可以零售散包装(诸如散装粉末、液体、凝胶或油)的形式提供膳食补充剂。在其他实施方案中，可批量提供补充剂以包括在其他食物类中，诸如小吃、犒赏物、补充剂棒、饮料等。

术语“长期施用”意指反复施用或食用超过一个月的时期。可将长于两个月、三个月、四个月的时期用于某些实施方案。此外，可使用包括长于5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或10个月的延长时期。也可使用超过11个月或1年的时期。在本发明中包括超过1年、2年、3年或更多年的长期使用。对于某些年老的动物，这些动物将在其余生中定期持续食用。这也可称为“延长”时期的食用。

术语“定期”是指至少每月一次定量给料组合物或食用组合物，并且在一个方面，是指至少每周一次定量给料。在某些实施方案中可执行更频繁的定量给料或食用，诸如每周两次或三次。然而，在其他实施方案中，可以使用包括每日至少一次食用的方案。

除非另外说明，否则本文表示的剂量以毫克/千克体重/天(mg/kg/天)为单位。

本文所公开的组合物可不含本文未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的组分组成”的实施方案和“由所指明的组分组成”的实施方案的公开内容。类似地，本文所公开的方法可不含本文未具体公开的任何步骤。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的步骤组成”的实施方案和“由所指明的步骤组成”的实施方案的公开内容。本文所公开的任何实施方案可与本文所公开的任何其它实施方案组合，除非另有明确和直接的说明。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语以及任何缩写都具有与本发明的技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在本发明的实施中可使用任何与本文所述那些组合物、方法、制品或者其他手段或材料类似或等效的组合物、方法、制品或者其他手段或材料，但本文描述了优选的组合物、方法、制品或者其他手段或材料。

本文中引述或提及的所有专利、专利申请、出版物和其他参考文献都在法律允许的范围内以引用方式并入本文。对这些参考文献的论述仅旨在总结其中作出的论断。并不承认任何此类专利、专利申请、出版物或参考文献或者其任何部分是本发明的相关现有技术，并且专门保留了挑战此类专利、专利申请、出版物和其他参考文献的准确性和相关性的权利。

在一个实施方案中，诊断犬科动物的早期退行性二尖瓣疾病的方法可包括测量生物标志物的归一化相对丰度，该生物标志物选自由以下项组成的组：Erysipelatoclostridium、瘤胃菌科UCG014、丁酸球菌属、粪杆菌属以及它们的组合；以及如果所述Erysipelatoclostridium为0至0.5归一化相对丰度，所述瘤胃菌科UCG014为0至0.1归一化相对丰度，所述丁酸球菌属为0至0.1归一化相对丰度，或所述粪杆菌属为0至0.1归一化相对丰度，则确定所述犬科动物具有早期退行性二尖瓣疾病。

一般来讲，早期退行性二尖瓣疾病的诊断可基于以下中的任一者的测量：Erysipelatoclostridium、瘤胃菌科UCG014、丁酸球菌属和粪杆菌属。然而，在一个方面，诊断可基于Erysipelatoclostridium来确定。在另一方面，诊断可基于瘤胃菌科UCG014来确定。在又一方面，诊断可基于丁酸球菌来确定。在又一方面，诊断可基于粪杆菌属来确定。此外，在一个实施方案中，诊断可基于两种生物标志物来确定。在另一个实施方案中，诊断可基于三种生物标志物来确定。在另一个实施方案中，诊断可基于所有四种类型的生物标志物来确定。

一般来讲，此类生物标志物可包括属内的任何物种。然而，在一个方面，丁酸球菌属可以是丁酸球菌属物种(Butyricicoccus spp.)。在另一方面，粪杆菌属可为Faecalibacterinm prausnitzii。

在另一个实施方案中，治疗犬科动物的退行性变二尖瓣疾病或减缓犬科动物的退行性二尖瓣疾病进展的方法可包括向犬科动物施用组合物，其中该组合物包含选自由以下项组成的组的益生菌：丁酸球菌属和粪杆菌属。如本文所述，在一个方面，丁酸球菌属可以是丁酸球菌属物种。在另一方面，粪杆菌属可为普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)。

一般来讲，益生菌通常以治疗有效量存在。在一个方面，益生菌可以10

组合物的施用可包括任何递送方式。在一个实施方案中，组合物可与宠物食物组合物结合施用。在另一个实施方案中，组合物为宠物食品。在另一个实施方案中，组合物可为与宠物食品结合施用的小袋或补充剂。在另一个实施方案中，组合物可为与其它食物组合物分开施用的小袋或补充剂。

在另一个实施方案中，宠物食品可包含蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维和益生菌，所述益生菌选自由以下项组成的组：丁酸球菌属、粪杆菌属、以及它们的组合。如本文所述，在一个方面，丁酸球菌属可以是丁酸球菌属物种。在另一方面，粪杆菌属可为普氏栖粪杆菌。如本文所述，益生菌通常以治疗有效量存在。在一个方面，益生菌可以10

如本文所述，宠物食物可包含益生菌作为单一组合物，或者可以多种组合物提供，所述组合物可结合施用或单独施用。在一个实施方案中，宠物食物组合物可包含包装的宠物食品和可加入到宠物食品中的包装的益生菌。在另一个实施方案中，宠物食品可包含在其中配制成单一组合物的益生菌。

本公开的宠物食物组合物通常为用于犬科动物的全面且平衡的宠物食物。在各种实施方案中，宠物食物组合物可包含约15％至约50％的粗蛋白。粗蛋白材料可包含植物蛋白，诸如大豆粉、大豆蛋白浓缩物、玉米谷蛋白粗粉、小麦谷蛋白、棉籽和花生粕，或者动物蛋白，诸如酪蛋白、白蛋白和肉蛋白。可用于本发明的肉蛋白质的示例包括猪肉、羊羔肉、马肉、禽肉、鱼肉以及它们的混合物。

组合物还可包含约5％至约40％的脂肪。组合物还可包含碳水化合物源。组合物可包含约15％至约60％的碳水化合物。此类碳水化合物的示例包括谷粒或谷物，诸如水稻、玉米、芦粟、高粱、苜蓿、大麦、大豆、芥花、燕麦、小麦以及它们的混合物。组合物还可任选地包含其他材料，诸如干乳清和其他乳制品副产物。

在一些实施方案中，组合物的灰分含量在小于1％至约15％的范围内，并且在一个方面，在约5％至约10％的范围内。

水分含量可根据组合物的性质而变化。在一个实施方案中，组合物可以是完善且营养均衡的宠物食品。在该实施方案中，宠物食品可以是“湿食品”、“干燥食品”或中等水分含量的食物。“湿食品”描述的是通常以罐或箔袋形式销售的宠物食品，并且其水分含量通常在约50％至约90％的范围内，在一个方面，70％至90％。“干燥食品”描述了与湿食品组成相似的宠物食品，但其含有的水分含量有限，通常在约5％至约15％或20％的范围内，因此呈现为例如小饼干类粗磨食品。在一个实施方案中，组合物可具有约5％至约20％的水分含量。干燥食品包括各种含水量的各种食品，使得它们相对耐贮存并且抗微生物或真菌导致的变质或污染。还包括在内的是作为挤出食物产品，诸如宠物食品，或用于人类或伴侣动物的零食的干燥食品组合物。“半湿食物”意指水分含量为约20％至约50％，并且在一个方面为约25％至约35％的宠物食物。

组合物还可包含一种或多种纤维源。术语“纤维”包括食物中无论是易消化还是不易消化的、可溶的还是不可溶的、可发酵的还是不可发酵的所有“大体积纤维性物质”来源。纤维可以来自植物源，诸如海生植物，但也可使用微生物源纤维。可利用多种可溶的或不溶的纤维，这将是本领域普通技术人员已知的。纤维源可以是甜菜浆(来源于甜菜)、阿拉伯树胶、塔尔哈型树胶、车前子、米糠、角豆胶、柑橘渣、果胶、低聚果糖、短链低聚果糖、甘露低聚果糖、大豆纤维、阿拉伯半乳聚糖、低聚半乳糖、阿拉伯糖基木聚糖或者它们的混合物。

或者，纤维源可以是可发酵纤维。可发酵纤维先前曾被描述为有益于伴侣动物的免疫系统。技术人员已知的提供益生元促进肠内益生菌生长的可发酵纤维或其他组合物也可掺入到组合物中，以有助于增强本发明提供给动物免疫系统的有益效果。

在这些组合物和方法的每一者中，宠物食物组合物可为湿润的食物、半湿食物或干燥食物。在一个实施方案中，宠物食物组合物可为共混的组合物的一种或多种组分。在一些实施方案中，宠物食物组合物为粗磨食物，并且在一些实施方案中，宠物食物组合物为仿肉产品。

本文所公开的宠物食物组合物可包含植物油、风味剂、着色剂和水。合适的植物油包括大豆油、玉米油、棉籽油、葵花油、芥花油、花生油、红花油等等。合适的风味剂的示例包括酵母、牛脂、加工的动物粮(例如，家禽肉、牛肉、羊羔肉和猪肉)、风味提取物或共混物(例如，烤牛肉)、动物消化物等。合适的着色剂包括FD&C色素，诸如蓝色1号、蓝色2号、绿色3号、红色3号、红色40号、黄色5号、黄色6号等等；天然色素，诸如焦糖色素、胭脂树红、叶绿酸、胭脂虫红、甜菜苷、姜黄、藏红花、辣椒色素、番茄红素、接骨木汁、班兰精、蝶豆花色素等；二氧化钛；以及技术人员已知的任何合适的食物着色剂。

本文所公开的宠物食物组合物可任选地包括另外成分，诸如另外或替代面粉的其它谷物和/或其它淀粉、氨基酸、纤维、糖、动物油、香味物质、另外或替代植物油的其它油、湿润剂、防腐剂、多元醇、盐、口腔护理成分、抗氧化剂、维生素、矿物质、益生菌微生物、生物活性分子或它们的组合。

合适的淀粉包括谷物，诸如com、稻米、小麦、大麦、燕麦、大豆等等，以及这些谷物的混合物，并且可以至少部分地包含在任何面粉中。合适的湿润剂包括盐、糖、丙二醇，以及多元醇(诸如甘油和山梨糖醇)等。合适的口腔护理成分包括含有叶绿素的苜蓿营养浓缩物、碳酸氢钠、磷酸盐(例如，磷酸三钙、酸性焦磷酸盐、焦磷酸四钠、偏磷酸盐和正磷酸盐)、薄荷、丁香、欧芹、姜等等。合适的抗氧化剂的示例包括丁基化羟基苯甲醚(“BHA”)、丁基化羟基甲苯(“BHT”)和维生素E(生育酚)等等。

可使用的维生素的非限制性示例包括维生素A、复合维生素B(诸如B-1、B-2、B-6和B-12)、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K、烟酸和酸性维生素(诸如泛酸和叶酸)以及生物素。合适的矿物质的非限制性示例包括钙、铁、锌、镁、碘、铜、磷、锰、钾、铬、钼、硒、镍、锡、硅、钒、硼等等。

如本文所讨论，组合物还可包含益生元或其它益生菌。益生菌是摄取后在预防和治疗特定医疗状况方面具有有益效应的活微生物。据信，益生菌通过被称为定植抗力的现象发挥生物学效应。益生菌有利于原生厌氧菌区系限制消化道中潜在有害细菌(主要是需氧菌)的浓度的过程。其它作用方式，诸如供应酶或影响酶在胃肠道中的活性，也可导致已被认为是由益生菌引起的一些其它功能。益生元是通过选择性刺激结肠中细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主健康的不易消化的食物成分。益生元包括低聚果糖(FOS)、低聚木糖(XOS)、低聚半乳糖(GOS)和低聚甘露糖(通常用于非人类食物，诸如宠物食物)。许多食物诸如小麦、洋葱、香蕉、蜂蜜、大蒜和韭菜中天然存在益生元低聚果糖(FOS)。FOS也可从菊苣根分离或从蔗糖酶促合成。结肠中的FOS发酵导致大量生理效应，包括增加结肠中双歧杆菌的数量、增加钙吸收、增加粪便重量、缩短通过胃肠时间，并可能降低血脂水平。益生菌增强全身细胞免疫应答，并可作为膳食补充剂用于增强原本健康的成年人的天然免疫力，或提供如本文所述的其它有益效果。通常已知的益生菌包括许多类型的细菌，但通常选自四类细菌：嗜酸乳杆菌属(Lactobacilllus acidophillus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、乳球菌属(Lactococcus)和片球菌属(Pediococcus)。有益物种包括肠球菌属(Enterococcus)和酵母属(Saccharomyces)物种。待施用给动物的益生菌和益生元的量由技术人员基于益生元和益生菌的类型和性质以及动物的类型和性质(例如，年龄、体重、总体健康状况、性别、微生物消耗的程度、有害细菌的存在和动物的饮食)来确定。一般来讲，益生菌以每天约十亿至约两百亿个菌落形成单位(CFU)的量施用于动物，以用于维持健康的肠微生物区系，并且在一个方面，每天约50亿至约100亿活细菌。一般来讲，益生元以足以积极刺激肠道中的健康微生物区系并且使这些“有益”细菌繁殖的量施用。典型的量为每份约1克至约10克，或者推荐的动物每日膳食纤维的约5％至约40％。益生菌和益生元可通过任何合适的手段成为组合物的一部分。例如，试剂可与组合物混合，或者例如通过喷洒或喷雾施加于组合物的表面。当试剂是套件的一部分时，试剂可与其他物质混合，也可在其自己的包装中。

合适的防腐剂的非限制性示例包括山梨酸钾、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯钠、丙酸钙、丙酸及它们的组合。

本文所公开的宠物食物组合物中的每种另外成分的特定量将取决于多种因素，诸如第一可食用物质和任何第二可食用物质中包含的成分；动物的物种；动物的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；动物的进食率；向动物施用食物产品的目的；等等。因此，组分及它们的用量可以广泛变化。

例如，可基于对退行性二尖瓣疾病的估计影响来减少或增加任何上述成分的量。

以下非限制性实施例是本公开的实施方案的说明。

收集来自四组狗的粪便样品：组1，没有心脏病迹象的狗；组2，具有阶段B1粘液瘤二尖瓣疾病(MMVD)的狗；组3，具有阶段B2 MMVD的狗；以及组4，具有阶段C MMVD的狗。由经委员会认证的兽医心脏病专家根据美国兽医内科学院(ACVIM)的共同声明，基于体检和超声心动图对狗进行检查和分类。根据年龄、性别、身体状况评分(BCS)对四组中的狗进行匹配。排除患有以下病症的狗：1)在过去的60天内接受抗生素，2)患有活动性腹泻或呕吐，3)患有主要的系统性疾病，诸如癌症、糖尿病、肾衰竭或系统性高血压，4)先天性心脏病和其他心脏异常，5)BCS大于或等于8或小于或等于3，6)小于7岁。记录药物历史。

在排便后30分钟内收集新鲜粪便，并在6小时内送至实验室。将来自每只狗的1-2克的三个等分试样储存在-80℃冷冻机中直至使用。

使用PowerFecal DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories，Inc，Carlsbad，CA)按照制造商规程提取粪便DNA，并使用PicoGreen测定法(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)定量。16S rDNA文库制备根据Illumina的16S宏基因组测序文库制备指南进行。16S扩增子PCR正向和反向引物的序列分别为：5’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG和5’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC。使用Illumina MiSeq测序仪，采用试剂试剂盒v2和500循环形式进行测序，以产生2x250个碱基对(bp)配对末端读数。

对于43个中值覆盖率为54,127的样品，总共获得11,498,568个读数。使用软件PEAR以默认设置将每个配对末端读数合并并集合成单个读数。这产生11,434,008个集合读数，导致99.4％集合率。丢弃具有小于350个碱基或大于475个碱基的集合序列。将来自不同样品的所有序列组合以产生单个文件。去除冗余序列，得到3,250,951个独特序列。使用UPARSE-OTU聚类算法，基于最小97％的同一性，将去复制序列分类并聚类成操作分类单元(OTU)。使用UCHIME(4.2.40版)检测并丢弃嵌合序列。用952个OTU构建OTU表。

通过从Greengenes数据库(2013年8月版本)中搜索参考序列文件，使用Mothur(版本1.39.5)中实施的基于kmer的K最近邻搜索算法进行分类分配。

使用PyNAST进行序列比对。使用FastTree由比对的序列构建系统发育树。QIIME(版本1.9.1)函数被要求用于分类分配、OTU表和系统发育树。

在16S rRNA基因丰度数据上使用PICRUSt(Phylogenetic Investigation ofCommunities by Reconstruction of Unobserved States)估算推定的细菌宏基因组功能。在宏基因组功能预测之前，通过将每个OTU除以已知或预测的16S拷贝数丰度来归一化OTU表。通过计算相对丰度将OTU表归一化，其中每个特征计数除以每个样品中的总序列计数并以平方根转化。去除所有样品中大于或等于90％零或小于0.01％相对丰度的分类。

α和β多样性指数均在QIIME中计算。首先通过将全OTU表二次采样到每个样品20,000个序列的深度覆盖来对OTU表进行稀薄化，进行100次迭代。针对每个二次采样OTU表计算Faith的系统发育多样性指数，并且获取每个度量的样本平均值。

使用线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)软件鉴定差异丰度的KEGG途径(KyotoEncyclopedia of Genes and Genome)。使用非参数秩检验来鉴定差异丰度分类。在关键超声心动图变量和差异丰度分类之间计算Spearman的秩相关系数。

系统发育多样性(PD)是分类群的系统发育类似物。阶段A中的狗具有与阶段B1、B2或C中的狗可区分的PD指数。另外，一致地，阶段A狗具有比阶段B1、B2和C的狗(分别为99、81和90)大的数量的属(116)。

在健康阶段A狗中，四个属，Erysipelatoclostridium、瘤胃菌科UCG014、丁酸球菌属和粪杆菌属，显示出狗比具有DMVD各个阶段的狗高的丰度(表1)。有趣的是，它们的丰度与左心脏的大小负相关，表明随着心脏扩大，细菌丰度降低。

*归一化相对丰度

Erysipelatoclostridium丰度随着左心室直径的增加而降低。

丁酸球菌属丰度与左心房和主动脉根的比率和左心室直径负相关。

普氏栖粪杆菌丰度随左心室直径增加而降低。

瘤胃菌科UCG014(未表征的属-https://www.arb-silva.de/browser/ssu/silva/X98011/)在与患有DMVD的狗相比时在健康狗(阶段A)中是高丰度的。丰度示出与左心房直径、左心房与主动脉根的比率和左心室直径的逆相关性。

在阶段B2 DMVD的狗中，当与健康阶段A狗比较时，两种宏基因组途径，即心磷脂生物合成和缬氨酸降解是过量的，而在健康狗中，当与B2狗比较时，谷氨酰胺/谷氨酸生物合成和色氨酸生物合成是不足的。

总之，健康狗的肠道微生物多样性高于DMVD狗的肠道微生物多样性。健康狗中的四种细菌属即Erysipelatoclostridium、瘤胃菌科UCG014、丁酸球菌属和粪杆菌属比DMVD狗中的丰度更高。

应当理解，对本文所述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明主题的实质和范围且不减弱其预期优点的前提下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。