一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，至少包括以下步骤：(1)配制琼脂培养基；(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞接种于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组，连续培养21天后于显微镜下，观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况，从而判定细胞的体外成瘤状况。所述步骤(2)中观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。使用50μm作为判断标准，能够提高判断的对比明显度与准确性。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法。

背景技术

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞的来源广泛，主要来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞和心肌细胞等多向分化的潜能。并且间充质干细胞易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。一些细胞在体外培养时，存在体外成瘤的可能性，但是现有的关于间充质干细胞在体外培养时，体外成瘤的检测方法不明显，不能有效的判断人间充质干细胞在体外培养时成瘤的可能性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，至少包括以下步骤：

(1)配制琼脂培养基；

(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞接种于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组，连续培养21天后于显微镜下，观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况，从而判定细胞的体外成瘤状况。

优选的，所述步骤(2)中观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

优选的，所述琼脂培养基包括不相融合的底层琼脂培养基和上层琼脂培养基。

优选的，所述底层琼脂培养基的制备原料包括1％(M/V)的琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基，所述琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基之间的体积比为：3:3(1-3)。

优选的，所述上层琼脂培养基的制备原料包括0.7％(M/V)的琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基，所述琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基之间的体积比为：3:3(1-3)。

优选的，所述1％(M/V)的琼脂溶液和0.7％(M/V)的琼脂溶液均在121℃下，经过30-60min的灭菌。

优选的，所述DMEM培养基为高糖培养基。

优选的，所述RPMI1640培养基中的胎牛血清浓度为10-15％wt。

优选的，所述步骤(2)中的将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞放置于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组的具体操作方法至少包括以下步骤：

(1)取底层琼脂培养基分别加入4个6孔板中，2-3ml/孔，静置使其凝固备用；

(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞分别接种于3个凝固有底层琼脂培养基的6孔板中；

(3)取上层琼脂培养基分别加入上述6孔板中，2-3ml/孔，其中未接种细胞的作为对照组。

优选的，所述人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的接种浓度为：1.5*10

有益效果：本技术方案中通过对使用一定胎牛血清浓度的RPMI1640培养基、琼脂溶液和DMEM培养基进行复配时，不仅能够使人胚肺成纤维细胞得到较好的生长，还能使人间充质干细胞得到较好的生长，减少了细胞生长状态之间的差异，减少了死细胞的个数，保证了各细胞具有较统一的生长状态，能够较明显的判定各细胞是否有集落现象，提高了检测人间充质干细胞体外成瘤的准确性和对比明显度。选定50μm作为集落细胞判断的标准，能够减小单个细胞或者死细胞的干扰性，进一步提高观察的对比明显度。

具体实施方式

为了下面的详细描述的目的，应当理解，本发明可采用各种替代的变化和步骤顺序，除非明确规定相反。此外，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。

当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。例如，从“1至10”的指定范围应视为包括最小值1与最大值10之间的任何及所有的子范围。范围1至10的示例性子范围包括但不限于1至6.1、3.5至7.8、5.5至10等。

为解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，至少包括以下步骤：

(1)配制琼脂培养基；

(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞接种于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组，连续培养21天后于显微镜下，观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况，从而判定细胞的体外成瘤状况。

作为一种优选的技术方案，所述步骤(2)中观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

细胞悬液中单个细胞直径在16-20μm，考虑到细胞在生长状态下有延伸，或单个细胞死亡后内容物破裂扩散，以及存在2个细胞的状况，所以选定50μm作为集落细胞判断的标准。人间充质干细胞和人胚肺成纤维细胞都是贴壁生长的细胞，正常的人间充质干细胞和人胚肺成纤维细胞在悬浮状态下不能增殖，肿瘤细胞在悬浮状态下能够快速增殖，因此在悬浮状态下存在集落细胞的认定为存在体外成瘤的可能性。

作为一种优选的技术方案，所述琼脂培养基包括不相融合的底层琼脂培养基和上层琼脂培养基。

作为一种优选的技术方案，所述底层琼脂培养基的制备原料包括1％(M/V)的琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基，所述琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基之间的体积比为：3:3(1-3)。

作为一种优选的技术方案，所述上层琼脂培养基的制备原料包括0.7％(M/V)的琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基，所述琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基之间的体积比为：3:3(1-3)。

作为一种优选的技术方案，所述1％(M/V)的琼脂溶液和0.7％(M/V)的琼脂溶液均在121℃下，经过30-60min的灭菌。

作为一种优选的技术方案，所述DMEM培养基为高糖培养基。

高糖型的DMEM培养基有利于细胞停泊在一个位置并生长，为后期观察细胞，提供了便利的基础。

作为一种优选的技术方案，所述RPMI1640培养基中的胎牛血清浓度为10-15％wt。

作为一种优选的技术方案，所述RPMI1640培养基中的胎牛血清浓度为10％wt。

发明人选用浓度为1％(M/V)的高浓度琼脂溶液作为底层琼脂培养基中的凝固成分，选用0.7％(M/V)的中浓度琼脂溶液作为上层琼脂培养基中的营养成分但不发生凝固作用，能够较好的模拟生物体的真实环境，使细胞处于悬浮的生长状态。发明人选用琼脂溶液和高糖型的DMEM培养基进行复配，对人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞进行培养，培养一段时间后发明人发现不同细胞之间的生长状况出现的差异较大。人胚肺成纤维细胞的生长状态较好，出现的死细胞较少，由于人宫颈癌细胞的生命力比较强，生长状态也比较好，然而人间充质干细胞的生长状态较差，出现的死细胞较多，个细胞的生长状态不统一，严重影响细胞体外成瘤的判断。发明人认为可能是琼脂溶液和高糖型的DMEM培养基所提供的营养比较适宜人胚肺成纤维细胞的增长，所以导致不同细胞之间的生长状况出现差异。发明人意外发现通过在琼脂溶液和DMEM培养基中复配一定胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基，不仅能够使人胚肺成纤维细胞得到较好的生长，还能使人间充质干细胞得到较好的生长，减少了细胞生长状态之间的差异，减少了死细胞的个数，保证了各细胞具有较统一的生长状态，能够较明显的判定各细胞是否有集落现象，提高了检测人间充质干细胞体外成瘤的准确性。

作为一种优选的技术方案，所述步骤(2)中的将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞放置于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组的具体操作方法至少包括以下步骤：

(1)取底层琼脂培养基分别加入4个6孔板中，2-3ml/孔，静置使其凝固备用；

(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞分别接种于3个凝固有底层琼脂培养基的6孔板中；

(3)取上层琼脂培养基分别加入上述6孔板中，2-3ml/孔，其中未接种细胞的作为对照组。

作为一种优选的技术方案，所述人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的接种浓度为：1.5*10

作为一种优选的技术方案，所述人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的接种浓度为：1.5*10

另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。

实施例1

该实施例中提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，包括以下步骤：

(1)底层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制1％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:1的比例加入4个6孔板中，2ml/孔，静置使其凝固备用，所述琼脂粉购于BIOWEST，货号为111860，所述超纯水购于Hyclone，货号为SH30529.02,所述2*DMEM培养基通过DMEM粉末、NaHCO

(2)取细胞的密度为1.5*10

(3)上层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制0.7％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:1的比例加入上述4个6孔板中，2ml/孔，使细胞在培养基重悬，上述未接种细胞的6孔板作为空白对照组，每隔两天更换0.1ml的RPMI1640培养基，连续培养21天，后观察细胞有无集落状况；

(4)观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

实施例2

该实施例中提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，包括以下步骤：

(1)底层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制1％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:2的比例加入4个6孔板中，2ml/孔，静置使其凝固备用，所述琼脂粉购于BIOWEST，货号为111860，所述超纯水购于Hyclone，货号为SH30529.02,所述2*DMEM培养基通过DMEM粉末、NaHCO

(2)取细胞的密度为1.5*10

(3)上层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制0.7％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:2的比例加入上述4个6孔板中，2ml/孔，使细胞在培养基重悬，上述未接种细胞的6孔板作为空白对照组，每隔两天更换0.1ml的RPMI1640培养基，连续培养21天，后观察细胞有无集落状况；

(4)观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

实施例3

该实施例中提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，包括以下步骤：

(1)底层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制1％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:3的比例加入4个6孔板中，2ml/孔，静置使其凝固备用，所述琼脂粉购于BIOWEST，货号为111860，所述超纯水购于Hyclone，货号为SH30529.02,所述2*DMEM培养基通过DMEM粉末、NaHCO

(2)取细胞的密度为1.5*10

(3)上层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制0.7％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:3的比例加入上述4个6孔板中，2ml/孔，使细胞在培养基重悬，上述未接种细胞的6孔板作为空白对照组，每隔两天更换0.1ml的RPMI1640培养基，连续培养21天，后观察细胞有无集落状况；

(4)观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

实施例4

该实施例中提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，包括以下步骤：

(1)底层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制1％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基按照体积比为1：1的比例加入4个6孔板中，2ml/孔，静置使其凝固备用，所述琼脂粉购于BIOWEST，货号为111860，所述超纯水购于Hyclone，货号为SH30529.02,所述2*DMEM培养基通过DMEM粉末、NaHCO

(2)取细胞的密度为1.5*10

(3)上层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制0.7％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基按照体积比为1：1的比例加入上述4个6孔板中，2ml/孔，使细胞在培养基重悬，上述未接种细胞的6孔板作为空白对照组，每隔两天更换0.1ml的RPMI1640培养基，连续培养21天，后观察细胞有无集落状况；

(4)观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

实施例5

该实施例中提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，包括以下步骤：

(1)底层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制1％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:4的比例加入4个6孔板中，2ml/孔，静置使其凝固备用，所述琼脂粉购于BIOWEST，货号为111860，所述超纯水购于Hyclone，货号为SH30529.02,所述2*DMEM培养基通过DMEM粉末、NaHCO

(2)取细胞的密度为1.5*10

(3)上层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制0.7％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:4的比例加入上述4个6孔板中，2ml/孔，使细胞在培养基重悬，上述未接种细胞的6孔板作为空白对照组，每隔两天更换0.1ml的RPMI1640培养基，连续培养21天，后观察细胞有无集落状况；

(4)观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

实施例6

该实施例中提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，包括以下步骤：

(1)底层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制1％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:5的比例加入4个6孔板中，2ml/孔，静置使其凝固备用，所述琼脂粉购于BIOWEST，货号为111860，所述超纯水购于Hyclone，货号为SH30529.02,所述2*DMEM培养基通过DMEM粉末、NaHCO

(2)取细胞的密度为1.5*10

(3)上层琼脂培养基的制备：使用琼脂粉和超纯水，配制0.7％(M/V)的琼脂溶液，并在121℃的条件下，进行30min的灭菌处理，然后与2*DMEM培养基、胎牛血清浓度为10％wt的RPMI1640培养基按照体积比为3:3:5的比例加入上述4个6孔板中，2ml/孔，使细胞在培养基重悬，上述未接种细胞的6孔板作为空白对照组，每隔两天更换0.1ml的RPMI1640培养基，连续培养21天，后观察细胞有无集落状况；

(4)观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

性能测试

性能测试一

按照实施例1-6所述的测试方法，在显微镜下观察人间充质干细胞的集落状况，以评价人间充质干细胞体外成瘤的可能性。

性能测试二

按照实施例1-6所述的测试方法，在显微镜下随机观察20个人间充质干细胞分别记录各个细胞的大小，并计算细胞大小的方差，得到方差一；在显微镜下随机观察20个人宫颈癌细胞分别记录各个细胞的大小，并计算细胞大小的方差，得到方差二，计算方差一与方差二的平均值为细胞生长方差，以表征各细胞生长状况的均匀性。

从上述数据中可以看出，当使用一定胎牛血清浓度的RPMI1640培养基、琼脂溶液和DMEM培养基进行复配时，不仅能够使人胚肺成纤维细胞得到较好的生长，还能使人间充质干细胞得到较好的生长，减少了细胞生长状态之间的差异，减少了死细胞的个数，保证了各细胞具有较统一的生长状态，能够较明显的判定各细胞是否有集落现象，提高了检测人间充质干细胞体外成瘤的准确性。

由以上数据可知，该测试方法的稳定性以及差异性效果显著，适应性较好。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。