一种培养iPS细胞的无滋养层培养基

摘要

本发明公开了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，属于生物技术领域。所述培养iPS细胞的无滋养层培养基，所述无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。该培养iPS细胞的无滋养层培养基，该无滋养层培养基能够促使iPS细胞生长明显，本发明实施例提供的无滋养层培养基在短时间内能够快速扩增细胞并获得大量的细胞，且细胞的状态良好，细胞存活率高，细胞的凋亡率低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种培养iPS细胞的无滋养层培养基。

背景技术

iPS细胞(Induced pluripotent stem cells，诱导性多能干细胞)是由体细胞诱导而成的干细胞，具有发育的多潜能性。iPS细胞技术具有巨大的潜在应用价值，利用iPS细胞技术能够获得病人或者疾病特异的多能性干细胞，这样可以避免移植过程中的免疫排斥问题，也绕开了人类胚胎干细胞研究所带来的伦理问题，因此，在再生医疗领域具有广阔的应用前景。在iPS细胞技术中，iPS细胞培养基及培养体系十分重要，目前的iPS细胞培养基及培养体系培养的iPS细胞，在培养过程中iPS细胞存在大量凋亡的情况，致使其细胞存活率较低，这并不利于iPS细胞技术的发展。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基。所述技术方案如下：

本发明提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，其特征在于，所述无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。

具体地，所述Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:(1～5):(1～7)。

具体地，所述Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:(1～3):(1～5)。

具体地，所述Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:2:3。

具体地，所述Y27632、Activin A和JAK1的终浓度分别：10μM、20ng/mL和30ng/mL。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，该无滋养层培养基能够促使iPS细胞生长明显，本发明实施例提供的无滋养层培养基在短时间内能够快速扩增细胞并获得大量的细胞，且细胞的状态良好，细胞存活率高，细胞的凋亡率低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的第一天的hPSC细胞生长情况图；

图2是本发明实施例一提供的第三天的hPSC细胞生长情况图；

图3是本发明实施例一提供的第五天的hPSC细胞生长情况图；

图4是本发明实施例一提供的第七天的hPSC细胞生长情况图；

图5是本发明对比例提供的第一天的hPSC细胞生长情况图；

图6是本发明对比例提供的第三天的hPSC细胞生长情况图；

图7是本发明对比例提供的第五天的hPSC细胞生长情况图；

图8是本发明对比例提供的第七天的hPSC细胞生长情况图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。

具体地，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:(1～5):(1～7)。

具体地，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:(1～3):(1～5)。

具体地，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:2:3。

具体地，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度分别：10μM、20ng/mL和30ng/mL。

本发明实施例提供的Y27632别名为(R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺；Activin A为激活素A；JAK1为Janus激酶1，购置于上海美迪西生物医药公司。

实施例一

本发明实施例提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。

具体地，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:2:3。

下面简单介绍一下将本发明实施例提供的无滋养层培养基用于培养iPS细胞，本发明实施例选取iPS细胞中的人多能干细胞(Human Pluripotent Stem Cell，hPSC)进行实验，具体方法如下：

1、复苏人多能干细胞

1)包被培养皿：每孔六孔板，取50μL的人类重组层粘连蛋白LN521原液(购置于上海逍鹏生物科技有限公司)，向人类重组层粘连蛋白LN521原液中加950μL杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，DPBS)，该杜氏磷酸缓冲液中包括Ca

2)配制基础培养基：取50mL的Stem-Partner ACF培养基，加入浓度为40μg/mL的b-FGF溶液100μL，以及终浓度为80ng/μL的碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)并混匀，于2℃～8℃保存，2周内用完。

3)配制无滋养层培养基：取20mL步骤2)获得的基础培养基，向该基础培养基中加入Y27632、Activin A和JAK1，其中Y27632的终浓度为10μM；Activin A的终浓度为20ng/mL，JAK1的终浓度为30μM。

4)复苏人多能干细胞：取出液氮罐中人多能干细胞，于37℃快速水浴解冻，解冻后将人多能干细胞放入安全柜内并转移至15mL离心管中，向离心管中加入DPBS将体积补至10mL，并混匀后进行离心，离心转速为400g，离心时间为5min。

5)接种细胞：弃掉离心管内的上清液，保留沉淀，向沉淀中加入2mL无滋养层培养基进行重悬，得到重悬液，将重悬液全部转移至包被培养皿中，并立即混匀，将包被培养皿置于温度为37℃并充有浓度为5％的CO

2、hPSC细胞换液(复苏后18h～24h)

每天更换培养基，且培养基为基础培养基。

3、hPSC细胞传代

1)包被培养皿：与步骤1.1的方法相同，在此不再赘述。

2)配制基础培养基：与步骤1.2的方法相同，在此不再赘述。

3)配制无滋养层培养基：与步骤1.3的方法相同，在此不再赘述。

4)分别取出包被的培养皿、无滋养层培养基、ReLeSR和DPBS缓冲液(该DPBS缓冲液不含Ca

5)从培养箱中取出hPSC细胞，弃掉旧培养皿中的培养基，用DPBS缓冲液(该DPBS缓冲液不含Ca

6)弃掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入无滋养层培养基进行重悬，得到细胞悬液，其中沉淀与无滋养层培养基的重量体积比为1:100，吹打细胞悬液使细胞吹散成单个细胞，按照1:(80～100)进行传代。同时，分别观察hPSC细胞的细胞生长情况，并将hPSC细胞生长于第3天、第5天和第7天时分别进行拍照，其生长情况分别如图1至图4所示。

4、hPSC细胞冻存

1)细胞冻存液配制：将无滋养层培养基与二甲亚砜DMSO按照体积比为9:1进行混合。

2)从培养箱中取出hPSC细胞，弃掉旧的培养基，用DPBS缓冲液(该DPBS缓冲液不含Ca

3)弃掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入细胞冻存液进行重悬细胞，吹打不超过十次，使细胞呈小的团块，将吹打后的重悬冻存液分装于多只冻存管中，且每只1mL。

在每只冻存管上分别标记日期、细胞类型、细胞数量、细胞代次以及操作人。将冻存管放入程序降温盒中，于-80℃暂存，或转移至生物样本库(液氮)中长期保存。

结合图1至图4可知，细胞生长明显，且第3天、第5天和第7天均有明显生长的趋势，7天后的细胞克隆与克隆之间已经融合，可以传代，这说明含有本发明实施例提供的无滋养层培养基在短时间内能够快速扩增细胞并获得大量的细胞，且细胞的状态良好，细胞存活率高，细胞的凋亡率低。

实施例二

本发明提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。具体地，本实施例二与实施例一的区别在于配制无滋养层培养基时，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:1:1。

实施例三

本发明提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。具体地，本实施例三与实施例一的区别在于配制无滋养层培养基时，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:3:4。

实施例四

本发明提供了一种培养iPS细胞的无滋养层培养基，无滋养层培养基包括：Y27632、Activin A和JAK1。具体地，本实施例四与实施例一的区别在于配制无滋养层培养基时，Y27632、Activin A和JAK1的终浓度比为：1:5:7。

对比例

本对比例提供了一种完全培养基，本对比例与实施例一的区别在于将对比例提供的完全培养基全部替代实施例一提供的无滋养层培养基，具体地，该完全培养基包括：Y27632和Activin A，且Y27632和Activin A的终浓度比为1:2，具体地，配制无滋养层培养基：取20mL步骤2)获得的基础培养基，向该基础培养基中加入Y27632和Activin A，其中Y27632的终浓度为10μM；Activin A的终浓度为20ng/mL。

具体地，按照实施例一提供的复苏人多能干细胞的方法进行，

并在步骤3、hPSC细胞传代后分别观察hPSC细胞的细胞生长情况，并将hPSC细胞生长于第3天、第5天和第7天时分别进行拍照，其生长情况分别如图5至图8所示。将图5至图8分别与图1至图4对比可知，对比例提供的完全培养基培养的细胞生长没有实施例明显，且细胞状态和扩增速度均不及本发明实施例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。