包含胚胎型成红细胞的细胞群体及其制备方法、细胞培养组合物以及化合物试验方法

摘要

本发明提供包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法，所述方法包括：悬浮培养多潜能干细胞、形成细胞聚集体的步骤(1)，以及从前述步骤(1)中得到的细胞聚集体得到前述细胞群体的步骤(2)，前述步骤(2)包括贴壁培养前述细胞聚集体的步骤(2a)。另外，提供包含胚胎型成红细胞的细胞群体、以及包含该细胞群体的细胞培养组合物、以及应用包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法。

说明书

技术领域

本发明涉及包含胚胎型成红细胞的细胞群体及其制备方法，以及包含该细胞群体的细胞培养组合物。进一步地，本发明涉及应用该细胞群体的化合物试验方法。

背景技术

在化合物的发育毒性试验中，已知抑制血红蛋白合成等抑制红细胞的功能的化合物抑制胎儿生长并具有致畸性、胚胎致死作用。另外，已知与红细胞的氧运输能力有关的珠蛋白基因的转换现象，其中，伴随个体发育，基因的表达依次变换为胚胎型、胎儿型和成人型。

因此认为，为了在体外试验系统中评价化合物具有的红细胞功能的抑制所引起的致畸性，使用作为致畸性的临界期的血细胞的胚胎型成红细胞进行评价是正确且有效的。

在非专利文献1(Fujita A.et al.Stem Cells.2016Jun；34(6)：1541-52.)中，记载了从人的胚胎干细胞以及人工多潜能干细胞经由表达ε-珠蛋白的成红细胞制备高表达β-珠蛋白的成红细胞的方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Fujita A.et al.Stem Cells.2016Jun；34(6)：1541-52。

发明概述

发明要解决的课题

但是，非专利文献1中记载的方法需要熟练的技术，作为制备包含表达ε-珠蛋白的胚胎型成红细胞的细胞群体的方法，再现性并不能说一定是足够的。本发明的目的是提供再现性良好地从多潜能干细胞制备包含胚胎型成红细胞的细胞群体的方法、以及能够通过该制备方法得到的细胞群体、以及包含该细胞群体的细胞培养组合物。另外，本发明的目的是提供应用该包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法。

用于解决课题的方法

本发明提供以下示例的包含胚胎型成红细胞的细胞群体以及其制备方法、细胞培养组合物以及化合物试验方法。

[1]包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法，其包括：

悬浮培养多潜能干细胞、形成细胞聚集体的步骤(1)，以及

从前述步骤(1)中得到的细胞聚集体得到前述细胞群体的步骤(2)，

其中，前述步骤(2)包括贴壁培养前述细胞聚集体的步骤(2a)。

[2]根据[1]所述的制备方法，其中，前述步骤(2)进一步包括回收前述细胞群体的步骤(2b)。

[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，在构成前述细胞群体的细胞之中，至少70％的细胞是前述胚胎型成红细胞。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，在前述细胞群体中，在细胞表达的β珠蛋白基因家族之中，至少50％是ε-珠蛋白基因。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，应用细胞非粘附性的培养器材进行前述步骤(1)。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，应用细胞粘附性的培养器材进行前述步骤(2a)。

[7]根据[6]所述的制备方法，其中，前述细胞粘附性的培养器材用基膜制剂包被。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其包括在前述步骤(1)之前使多潜能干细胞分散的步骤。

[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，前述步骤(1)包括将前述多潜能干细胞离心的步骤。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，从前述步骤(1)开始至前述步骤(2a)开始的时间是12小时以上96小时以内。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，前述步骤(2a)的培养时间是2天以上18天以内。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，选自

由前述步骤(1)以及步骤(2a)组成的组中的至少1个步骤在ROCK抑制剂存在的情况下进行。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，前述步骤(2a)在选自由红细胞生成素、红细胞生成素受体激动剂以及红细胞生成素受体介导的信号转导途径作用物质组成的组中的至少1种存在的情况下进行。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，前述步骤(2a)在饲养细胞存在的情况下进行。

[15]根据[14]所述的制备方法，其中，前述饲养细胞是骨髓间充质细胞或骨髓间充质细胞衍生细胞株。

[16]根据[15]所述的制备方法，其中，前述饲养细胞是OP9细胞。

[17]根据[1]～[16]中任一项所述的制备方法，其中，前述步骤(2a)在选自干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子的至少1种存在的情况下进行。

[18]根据[1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，前述多潜能干细胞是灵长类多潜能干细胞或啮齿类多潜能干细胞。

[19]根据[1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，前述多潜能干细胞是人多潜能干细胞或大鼠多潜能干细胞。

[20]应用包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法，其包括：

悬浮培养多潜能干细胞、形成细胞聚集体的步骤(A)，

从前述步骤(A)中得到的细胞聚集体得到前述细胞群体的步骤(B)，在试验化合物存在的情况下培养前述细胞群体的步骤(C)，以及

测定选自下列的至少一个项目的步骤(D)：前述步骤(C)中培养的前述细胞群体的1)细胞数、2)细胞生存率、3)血红素浓度、4)原卟啉IX浓度、以及5)珠蛋白表达量，

其中，前述步骤(B)包括贴壁培养前述细胞聚集体的步骤(Ba)。

[21]根据[20]所述的化合物试验方法，其中，前述步骤(B)进一步包括回收前述细胞群体的步骤(Bb)。

[22]根据[20]或[21]所述的化合物试验方法，其中，在构成前述细胞群体的细胞之中，至少70％的细胞是前述胚胎型成红细胞。

[23]根据[20]～[22]中任一项所述的化合物试验方法，其中，在前述细胞群体中，在细胞表达的β珠蛋白基因家族之中，至少50％是ε-珠蛋白基因。

[24]根据[20]～[23]中任一项所述的化合物试验方法，其中，前述步骤(C)在饲养细胞不存在的情况下进行。

[25]根据[20]～[24]中任一项所述的化合物试验方法，其中，前述步骤(C)在选自由白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子组成的组中的至少1个不存在的情况下进行。

[26]根据[20]～[25]中任一项所述的化合物试验方法，其中，前述步骤(C)的培养时间是2天以上。

[27]根据[20]～[26]中任一项所述的化合物试验方法，其中，前述多潜能干细胞是灵长类多潜能干细胞或啮齿类多潜能干细胞。

[28]根据[20]～[26]中任一项所述的化合物试验方法，其中，前述多潜能干细胞是人多潜能干细胞或大鼠多潜能干细胞。

[29]根据[20]～[28]中任一项所述的化合物试验方法，其中，应用包含来自多个生物物种的胚胎型成红细胞的细胞群体，

在前述步骤(D)中，对从来自多个生物物种的多潜能干细胞得到的各自的细胞群体进行前述测定。

[30]根据[29]所述的化合物试验方法，其中，前述多个生物物种包含属于由灵长类以及啮齿类组成的组的生物之中的至少2种。

[31]根据[29]所述的化合物试验方法，其中，前述多个生物物种包含人以及大鼠。

[32]包含胚胎型成红细胞的细胞群体，其中，

在构成前述细胞群体的细胞之中，至少70％的细胞是前述胚胎型成红细胞。

[33]包含胚胎型成红细胞的细胞群体，其中，

细胞表达的β珠蛋白基因家族之中，至少50％是ε-珠蛋白基因。

[34]通过[1]～[19]中任一项所述的制备方法得到的细胞群体，或[32]或[33]所述的细胞群体，其在化合物试验中应用。

[35]通过[1]～[19]中任一项所述的制备方法得到的细胞群体或[32]～[34]中任一项所述的细胞群体，其以保持ε-珠蛋白的表达的状态保存。

[36]细胞培养组合物，其包含通过[1]～[19]中任一项所述的制备方法得到的细胞群体或[32]～[35]中任一项所述的细胞群体、和培养基。

[37]根据[36]所述的细胞培养组合物，其中，前述培养基不包含选自由白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子组成的组中的至少1种。

发明的效果

通过本发明，可以提供再现性良好地从多潜能干细胞制备包含胚胎型成红细胞的细胞群体的方法以及能够通过该制备方法得到的细胞群体、以及包含该细胞群体的细胞培养组合物。另外，通过本发明，可以提供应用该包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法。

附图简述

图1是显示在成红细胞中，伴随人发育，β-珠蛋白基因家族的表达的转换的图。

图2上部显示在预备实验中，应用从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天的细胞群体通过抗HBE1抗体的荧光免疫染色的结果。下部是输出由上部中的线段A-A’所示的感兴趣区域的线性荧光强度概况的图。

图3是示意性地显示在实施例1中从人iPS细胞(HC-6#10株)制备包含胚胎型成红细胞的细胞群体时的顺序的图。图中的天数表示从步骤(1)开始起的天数。

图4A是实施例1中从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天的，来自人iPS细胞(HC-6#10株)的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像。图4B是从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天的，来自人iPS细胞(HC-6#10株)的悬浮的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的倒置显微镜的明场观察图像。

图5是对细胞球团(pellet)摄影的照片，所述细胞球团是实施例1中，回收从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天的来自人iPS细胞(HC-6#10株)的包含胚胎型成红细胞的细胞群体并离心而成的。

图6是对细胞群体进行荧光免疫染色的荧光显微镜图像，所述细胞群体是实施例1中从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的来自人iPS细胞(HC-6#10株)的包含胚胎型成红细胞的细胞群体。A及B、C及D、以及E及F分别示出从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的ε-珠蛋白(HBE1)的染色图像以及其核染色图像。G及H、I及J、以及K及L分别表示从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的血型糖蛋白A(GPA)的染色图像以及其核染色图像。A、C、E、G、I以及K中的比例尺表示100μm。

图7是示意性地显示实施例2中从大鼠ES细胞制备包含胚胎型成红细胞的细胞群体时的顺序的图。图中的天数表示从步骤(1)开始起的天数。

图8A是实施例2中从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天的来自大鼠ES细胞的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像。图8B是从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天的悬浮的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的倒置显微镜的明场观察图像。

图9是对细胞沉淀摄影的照片，所述细胞沉淀是实施例2中，回收从悬浮培养(步骤(1))开始起第12天的来自大鼠ES细胞的包含胚胎型成红细胞的细胞群体并离心而成的。

图10是对细胞群体进行荧光免疫染色的荧光显微镜图像，所述细胞群体是实施例2中从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天、第10天以及第12天来自大鼠ES细胞的包含胚胎型成红细胞的细胞群体。A及B、C及D、以及E及F分别示出从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天、第10天以及第12天的Hbe1的染色图像以及其核染色图像。A、C以及E中的比例尺表示100μm。

图11是示意性地显示在实施例3中应用从人iPS细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验的顺序的图。图中的天数表示从步骤(A)开始起的天数。

图12是评价实施例3中试验化合物对包含胚胎型成红细胞的细胞群体的作用的图。(A)是测定血红素浓度的结果，(B)是测定原卟啉IX浓度的结果，(C)是测定活细胞数的结果，(D)是测定生存率的结果。

图13是示意性显示在实施例4中应用从大鼠ES细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验的顺序的图。图中的天数表示从步骤(A)开始起的天数。

图14是评价实施例4中试验化合物对包含胚胎型成红细胞的细胞群体的作用的图。

图15A是实施例5中从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天的来自人iPS细胞(201B7株)的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像。图15B是从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天的来自人iPS细胞(201B7株)的悬浮的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的倒置显微镜的明场观察图像。

图16是对细胞沉淀摄影的照片，所述细胞沉淀是实施例5中，回收从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天的来自人iPS细胞(201B7株)的包含胚胎型成红细胞的细胞群体并离心而成的。

图17是对细胞群体进行荧光免疫染色的荧光显微镜图像，所述细胞群体是实施例5中从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的来自人iPS细胞(201B7株)的包含胚胎型成红细胞的细胞群体。A及B、C及D、以及E及F分别示出从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的ε-珠蛋白(HBE1)的染色图像以及其核染色图像。G及H、I及J、以及K及L分别示出从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的血型糖蛋白A(GPA)的染色图像以及其核染色图像。A、C、E、G、I以及K中的比例尺表示100μm。

图18A是实施例6中从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天的来自人ES细胞(KhES-1株)的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像。图18B是从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天的来自人ES细胞(KhES-1株)的悬浮的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的倒置显微镜的明场观察图像。

图19是对细胞沉淀摄影的照片，所述细胞沉淀是实施例6中，回收从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天的来自人ES细胞(KhES-1株)的包含胚胎型成红细胞的细胞群体并离心而成的。

图20是对细胞群体进行荧光免疫染色的荧光显微镜图像，所述细胞群体是实施例6中从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的来自人ES细胞(KhES-1株)的包含胚胎型成红细胞的细胞群体。A及B、C及D、以及E及F分别示出从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的ε-珠蛋白(HBE1)的染色图像以及其核染色图像。G及H、I及J、以及K及L分别示出从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的血型糖蛋白A(GPA)的染色图像以及其核染色图像。A、C、E、G、I以及K中的比例尺表示100μm。

用于实施发明的方式

[1.定义]

本说明书中，下述用语的定义如下述。“干细胞”意味着具有分化能力以及维持分化能力的增殖能力(特别是自我复制能力)的未分化的细胞。根据分化能力，干细胞中包含多潜能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。“多潜能干细胞”指可以在体外培养且具有可分化成构成生物体的全部细胞(来自三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的组织)的能力(分化多潜能性(pluripotency))的干细胞。“多能干细胞”意味着具有可分化成多种类型组织、细胞的能力，但不是全部的种类的干细胞。“单能干细胞”意味着具有可分化成特定的组织、细胞的能力的干细胞。

多潜能干细胞可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织内干细胞、体细胞等诱导。作为多潜能干细胞，可以列举胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)、EG细胞(胚胎生殖细胞(Embryonic germ cell))、人工多潜能干细胞(iPS细胞：诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell))等。从间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(多谱系分化应力持久细胞(Multi-lineage differentiating StressEnduring cell))、从生殖细胞(例如睾丸)制备的GS细胞也包含在多潜能干细胞中。

胚胎干细胞于1981年首次建立，1989年以后也用于敲除小鼠的制备。人胚胎干细胞在1998年建立，也正用于再生医学。ES细胞可以通过在饲养细胞上或含有白血病抑制因子(LIF)的培养基中培养内部细胞团而制备。ES细胞的制备方法在例如国际公开第96/22362号、国际公开第02/101057号、美国专利第5843780号说明书、美国专利第6200806号说明书、美国专利第6280718号说明书等中记载。胚胎干细胞可以从给定的机构获得，另外，也可以购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1、KhES-2以及KhES-3可从京都大学再生医科学研究所获得。两者均为小鼠胚胎干细胞的EB5细胞可从国立研究开发法人理化学研究所获得，D3株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。作为ES细胞之一的核移植ES细胞(ntES细胞)可以从将体细胞的细胞核移植到去除了细胞核的卵子中而产生的克隆胚胎建立。

可以通过在含有小鼠干细胞因子(mSCF)、LIF以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中培养原始生殖细胞来制备EG细胞(Cell，70：841-847，1992)。

人工多潜能干细胞是通过利用已知方法等对体细胞重编程(reprogramming)而诱导了多潜能性的细胞。具体地，可列举将成纤维细胞、外周血单核细胞等分化的体细胞通过选自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等的重编程基因群的多个基因的组合中的任一的表达进行重编程并诱导多分化能力的细胞。在2006年，由山中等人在小鼠细胞中建立人工多潜能干细胞(Cell，2006，126(4)pp.663-676)。人工多潜能干细胞也在2007年在人成纤维细胞中建立，与胚胎干细胞同样地具有多潜能性和自我复制能力(Cell，2007，131(5)pp.861-872；Science，2007，318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)pp.101-106)。作为人工多潜能干细胞，除了通过基因表达直接重编程的制备方法之外，也可以通过化合物添加等从体细胞诱导人工多潜能干细胞(Science，2013，341pp.651-654)。

作为制备人工多潜能干细胞时应用的体细胞，没有特别限定，可列举来自组织的成纤维细胞、血细胞谱系细胞(例如外周血单核细胞、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。

制备人工多潜能干细胞时，在通过数种基因(例如Oct3/4、Sox2、Klf4、以及Myc这4种因子)的表达进行重编程的情况下，用于使基因表达的手段没有特别限制。作为用于使基因表达的手段，可列举例如应用病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体)的感染方法、应用质粒载体(例如质粒载体、附加型载体)的基因导入方法(例如磷酸钙法、脂质转染法、Retronectin法、电穿孔法)、应用RNA载体的基因导入方法(例如磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法)、蛋白质的直接注入方法等。

多潜能干细胞中也包括基因改造的多潜能干细胞。基因改造的多潜能干细胞可以通过利用例如同源重组技术制备。作为改造的染色体上的基因，可列举例如细胞标记物基因、组织相容性抗原的基因、与基于神经系统细胞的障碍的疾病相关的基因等。染色体上的目标基因的改造可以应用Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、GeneTargeting,A Practical Approach(基因靶向，实践方法),IRL Press at OxfordUniversity Press(1993)、“生物指南系列8，基因靶向，使用ES细胞的变异小鼠的制备，YODOSHA CO.，LTD.(1995)”等中记载的方法进行。

具体地，例如分离改造的目标基因(例如细胞标记物基因、组织相容性抗原的基因、疾病相关基因等)的基因组基因，应用分离的基因组基因制备用于将目标基因同源重组的目标载体。将制备的目标载体导入干细胞，通过选择在目标基因与目标载体之间发生同源重组的细胞，可以制备染色体上的基因被改造的干细胞。

作为分离目标基因的基因组基因的方法，可列举Molecular Cloning,ALaboratory Manual,(分子克隆，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)、Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，JohnWiley&Sons(1987-1997)等中记载的公知的方法。通过应用基因组DNA文库筛选系统(Genome Systems制)、Universal GenomeWalker Kits(Clontech制)等，也可以分离目标基因的基因组基因。

用于将目标基因同源重组的目标载体的制备、以及同源重组体的有效选择可以按照Gene Targeting，A Practical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at OxfordUniversity Press(1993)、“生物指南系列8，基因靶向，使用ES细胞的变异小鼠的制备，YODOSHA CO.，LTD.(1995)”等中记载的方法进行。作为目标载体，可以应用置换型或插入型中的任一。作为选择方法，可以应用阳性选择、启动子选择、阳性选择或聚腺苷酸(polyA)选择等方法。作为从选择的细胞株中选择作为目标的同源重组体的方法，可列举对基因组DNA的DNA杂交方法、PCR方法等。

“哺乳动物”中包含啮齿类、有蹄类、猫目、兔目、灵长类等。啮齿类中包含小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。有蹄类中包含猪、牛、山羊、马、绵羊等。猫目中包含狗、猫等。兔目中包含兔等。“灵长类”是指属于灵长目的哺乳动物，作为灵长类，可列举包括原猴亚目(prosimian)如狐猴(lemur)，懒猴(loris)，攀鼩目等，和猿猴亚目(anthropoidea)，如猴，类人猿(ape)，人等。

“细胞粘附(Cell adhesion)”中包含细胞与细胞的粘附(细胞-细胞粘附)以及细胞与细胞外基质(基质)的粘附(细胞-基质粘附)。在体外人工培养环境下发生的细胞对培养器材等的粘附也包含在细胞粘附中。细胞-细胞粘附中形成的连接是细胞-细胞连接(cell-cell junction)，细胞-基质粘附中形成的连接是细胞-基质连接(cell-substratumjunction)。作为细胞粘附的种类，例如，可列举锚定连接(anchoring junction)、通讯连接(communicating junction)、封闭连接(occluding junction)。

作为细胞-细胞连接，可列举“紧密连接(Tight junction)”、“粘附连接(adherence junction)”。紧密连接是比较强的细胞-细胞连接，可以发生在上皮细胞等的特定细胞彼此中。细胞间紧密连接存在与否，可以应用例如针对紧密连接的构成成分的抗体(抗紧密连接蛋白抗体、抗ZO-1抗体等)通过免疫组织化学等手段检测。粘附连接在细胞聚集体中发生的频率比较高。

“悬浮培养”是指保持细胞在培养液中悬浮存在的状态下培养。也即悬浮培养在细胞不粘附于培养器材以及培养器材上的饲养细胞等(下文称为“培养器材等”)的条件下进行，在粘附于培养器材等的条件下进行的培养(贴壁培养)区别于悬浮培养。更详细地，悬浮培养是指细胞与培养器材等之间没有形成牢固的细胞-基质连接的条件下的培养。本领域技术人员可以例如通过在显微镜观察时摇动培养器材容易地判定培养的细胞处于悬浮培养状态还是贴壁培养。

“贴壁培养”是指保持细胞粘附于培养器材等存在的状态下培养。此处，细胞粘附于培养器材是指细胞与培养器材等之间可以形成作为细胞粘附的一种的牢固的细胞-基质间结合。

在悬浮培养中的细胞聚集体中，细胞与细胞平面粘附。对于悬浮培养中的细胞聚集体，细胞与培养器材等之间不形成牢固的细胞-基质连接，细胞-基质连接几乎不形成，或即使形成，其贡献也小。悬浮培养中的细胞聚集体的内部也可以存在内在的细胞-基质连接。

“细胞与细胞平面粘附(plane attachment)”是指细胞与细胞以面与另一个细胞连接。更详细地，“细胞与细胞平面粘附”是指在某一细胞的表面积之中，与其它细胞的表面发生粘附的比例是例如1％以上、优选地3％以上、更优选地5％以上。细胞的表面可以通过借助对膜染色的试剂(例如DiI)染色、细胞粘附因子(例如E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白等)的免疫组织化学等手段检测。

进行悬浮培养时应用的培养器材没有特别限制，只要其可以悬浮培养即可，本领域技术人员可以适当地确定。作为这种培养器材，例如，可列举烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿(dish)、皮氏培养皿(petri dish)、组织培养皿、多孔皿、微板、微孔板、微孔、多板、多孔板、腔式载玻片、培养皿、试管、托盘、培养袋、旋转烧瓶、滚瓶、芯片上的器官等生物功能芯片等。为了可以悬浮培养，这些培养器材优选是细胞非粘附性的。作为细胞非粘附性的培养器材，可以使用培养器材的表面不进行以增加与细胞的粘附性为目的而进行后述人工处理的器材等。另外，作为细胞非粘附性的培养器材，也可以使用培养器材的表面以降低与细胞的粘附性为目的而进行人工处理(例如2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC)聚合物等的超亲水性处理、蛋白低吸附处理等)的器材等。培养器材的培养表面可以是平底、U形底或V形底，也可以具有凹凸。

进行贴壁培养时应用的培养器材没有特别限制，只要其可以贴壁培养即可，本领域技术人员可以适当地确定。作为这种培养器材，例如，可列举烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿、组织培养用培养皿、多孔皿、微板、微孔板、微孔、多板、多孔板、腔式载玻片、培养皿、试管、托盘、培养袋、芯片上的器官等生物功能芯片等。作为细胞粘附性的培养器材，可以使用培养器材的表面以增加与细胞的粘附性为目的而进行人工处理的器材等。作为人工处理，例如可列举通过细胞外基质、聚合物等的包被处理、以及气体等离子体处理、正电荷处理等表面加工。作为细胞粘附的细胞外基质，例如，可列举基膜制剂、层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白、明胶等，作为聚合物，可列举聚赖氨酸、聚鸟氨酸等。培养器材的培养表面可以是平底，也可以具有凹凸。

作为本发明中用于细胞培养的培养基，可以将动物细胞培养中通常应用的培养基配制为基础培养基。作为基础培养基，例如，可列举Basal Medium Eagle(BME)、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)、改良的MEM锌选择培养基、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、Medium 199、Eagle MinimumEssential Medium(Eagle MEM)、Alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、F-12培养基、DMEM/F12、IMDM/F12、Ham′s培养基、RPMI 1640、费希尔(Fischer’s)培养基或这些的混合培养基等。

在多潜能干细胞的培养中，可以应用以上述基础培养基为基础的用于多潜能干细胞培养的培养基、优选公知的用于胚胎干细胞或人工多潜能干细胞的培养基、用于在无饲养细胞下培养多潜能干细胞的培养基(无饲养细胞培养基)等。作为无饲养细胞培养基，可列举例如Essential 8培养基、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基、StemFit培养基等。

“无血清培养基”意味着不包含未调整或未纯化的血清的培养基。混入纯化的血液来源成分、动物组织来源成分(例如生长因子)的培养基只要不包含未调整或未纯化的血清，也包含在无血清培养基中。

无血清培养基也可以含有血清替代物。作为血清替代物，可以列举适当含有例如白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、痕量元素、2-巯基乙醇或3′硫醇甘油或它们的等同物等的那些。相关的血清替代物可以例如通过国际公开第98/30679号中记载的方法配制。作为血清替代物，也可以利用市售品。作为市售的血清替代物，例如，可列举Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)(下文也称为“KSR”。)、化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated，Thermo Fisher Scientific公司制)、Glutamax(Thermo Fisher Scientific公司制)、B27 Supplement(Thermo FisherScientific公司制)、N2补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制)等。

悬浮培养以及贴壁培养中应用的无血清培养基也可以适当含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂，无机盐类等。

为了避免制备的复杂性，作为这种无血清培养基，可以应用市售的用于干细胞的培养基，例如STEMdiff Hematopoietic基础培养基(有时记载为“Stemdiff.basalmedium”)与STEMdiff Hematopoietic Supplement A(有时记载为“Supp.A”)，或与STEMdiff Hematopoietic Supplement B(有时记载为“Supp.B”)的混合液(STEMCELLTechnologies公司制)、Stemline II造血干细胞增殖培养基(Sigma Aldrich公司制)、Hematopoietic Progenitor Medium(Promo Cell公司制)、STEMα.A(STEM ALPHA公司制)、PRIME-XV Hematopoietic Cell Basal XSFM(Irvine Scientific公司制)等。本发明中应用的无血清培养基优选地是STEMdiff Hematopoietic基础培养基与STEMdiffHematopoietic Supplement A或与STEMdiff Hematopoietic Supplement B的混合液。

“血清培养基”意味着包含未调整或未纯化的血清的培养基。该培养基也可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、1-单硫代甘油、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。

对于本发明中应用的培养基，从避免化学上未确定成分的混入的观点出发，优选为含有成分在化学上确定的培养基(Chemically defined medium；CDM)。

“基膜制剂”是指包含在其上接种并培养具有基底膜形成能力的期望细胞的情况下、具有控制上皮细胞样的细胞形态、分化、增殖、运动、功能表达等的功能的基底膜构成成分的那种。在本发明中，进行细胞聚集体的贴壁培养时，可以在基膜制剂存在的情况下培养。此处，“基底膜构成成分”是指动物的组织中上皮细胞层与间充质细胞层等之间存在的薄膜状的细胞外基质分子。作为基底膜构成成分，可列举IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(串珠素，perlecan)、巢蛋白/触觉蛋白、细胞因子、生长因子等。基膜制剂例如可以如下制备，应用具有该细胞的脂质溶解能力的溶液、碱性溶液等，将具有经由基底膜粘附于支持体上的基底膜形成能力的细胞从支持体除去。作为基膜制剂，可列举包括作为基底膜配制物市售的商品(例如，基质胶(Corning公司制))、Geltrex(LifeTechnologies公司制)、公知为基底膜成分的细胞外基质分子(例如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、巢蛋白等)的那些。

在本发明中，从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤等的组织或细胞提取、使其可溶的基质胶(Corning公司制)等基膜制剂可以用于细胞以及组织的培养。作为同样地用于细胞培养的基底膜成分，也可以应用人可溶化羊膜(株式会社生物资源应用研究所公司制)、HEK293细胞中产生的人重组层粘连蛋白(BioLamina公司制)、人重组层粘连蛋白片段(Nippi,Inc.制)、人重组玻连蛋白(Thermo Fisher Scientific公司制)等。

“包含物质X的培养基”以及“在物质X存在的情况下”分别意味着添加了外源性(exogenous)物质X的培养基或包含外源性物质X的培养基、以及在外源性物质X存在的情况下。外源性物质X与例如培养基中存在的细胞或组织所内源性(endogenous)表达、分泌或产生该物质X的内源性物质X相区别。

“饲养细胞”是在培养干细胞时共存的除了该干细胞以外的细胞。作为多潜能干细胞的未分化维持培养中应用的饲养细胞，例如，可列举小鼠成纤维细胞(MEF)、人成纤维细胞、SNL细胞等。作为多潜能干细胞的分化诱导中应用的饲养细胞，例如，可列举OP9细胞、PA6细胞、C3H10T1/2细胞(clone8)等。饲养细胞优选经增殖抑制处理的饲养细胞。作为增殖抑制处理，可列举增殖抑制剂(例如丝裂霉素C)处理或γ射线照射等。多潜能干细胞的未分化维持培养中应用的饲养细胞通过液性因子(优选为未分化维持因子)的分泌、用于细胞粘附的构架(细胞外基质)的形成等而促成维持多潜能干细胞的未分化。多潜能干细胞的分化诱导中应用的饲养细胞通过液性因子(优选为分化诱导因子)的分泌、用于细胞粘附的构架(细胞外基质)的形成等，而促成多潜能干细胞分化为特定细胞以及组织。

“细胞聚集体”(cell Aggregate)是指培养基中分散的细胞集合形成的团块，是细胞彼此粘附的团。细胞团块、胚样体(Embryoid body)、球体(Sphere)、球状体(Spheroid)、类器官(Organoid)也包含在细胞聚集体中。对于细胞聚集体，优选地细胞彼此平面粘附。在一部分方式中，在细胞聚集体的一部分或全部中，存在细胞彼此形成粘附、例如粘附连接(adherence junction)的情况。

“均一的细胞聚集体”意味着培养多个细胞聚集体时的各细胞聚集体的大小是一定的，在通过最大直径的长度评价细胞聚集体的大小的情况下，均一的细胞聚集体意味着最大直径的长度的分散小。更具体地，意味着在多个细胞聚集体中75％以上的细胞聚集体中，其最大直径在多个细胞聚集体的最大直径平均值的±100％以内、优选地最大直径平均值的±50％以内、更优选地最大直径平均值的±20％以内。

“细胞群体”是指由两个以上的细胞构成的细胞群，例如，可以由1000个以上的细胞构成，也可以由1×10

“使分散”是指将细胞粘附的细胞以及组织等通过酶处理、物理处理等分散处理分离，优选地分离成单个细胞。

“成红细胞”表示在分化为红细胞的过程中的阶段的有核的原始的红细胞前体细胞。“胚胎型成红细胞”以及“胚胎型红细胞”分别表示作为早期胚胎期的初次造血在卵黄囊中产生的、在β-珠蛋白基因家族中主要含有ε-珠蛋白的成红细胞以及红细胞。“胎儿型成红细胞”以及“胎儿型红细胞”分别表示作为胚胎期的二次造血在中肾(mesonephros)(主动脉-性腺-中肾：AGM)区域以及肝脏和脾脏产生的、在β-珠蛋白基因家族中主要含有γ-珠蛋白的成红细胞以及红细胞。“成人(成体)型成红细胞”以及“成人(成体)型红细胞”分别表示在妊娠晚期后在骨髓中产生的、在β-珠蛋白基因家族中主要含有β-珠蛋白的成红细胞以及红细胞。本说明书中，β-珠蛋白基因家族是指ε-、γ-以及β-珠蛋白基因。

“血红蛋白”表示生物体内成红细胞和红细胞中含有的牵涉氧运输的蛋白质。血红蛋白由作为含有铁原子的络合物的血红素和珠蛋白构成。血红蛋白中的珠蛋白是异四聚体，由2个α-以及ζ-珠蛋白中的任一珠蛋白、与2个ε-、γ-以及β-珠蛋白中的任一珠蛋白构成。在α-、ζ-珠蛋白之中，ζ-珠蛋白仅在初次造血期表达，而α-珠蛋白在初次造血期以及二次造血期二者中表达。胚胎初期的胚胎型成红细胞以及胚胎型红细胞包含主要含有ε-珠蛋白作为亚基的血红蛋白，胎儿型成红细胞以及胎儿型红细胞包含主要含有γ-珠蛋白作为亚基的血红蛋白，成人型成红细胞以及成人型红细胞包含主要含有β-珠蛋白作为亚基的血红蛋白。图1中显示从人胎儿期至出生后，成红细胞以及红细胞表达的β-珠蛋白基因家族的表达比例。

参照表1，血红素在成红细胞的细胞质以及线粒体中通过由以下第1反应～第8反应构成的8阶段反应进行生物合成。

对于第1反应，在线粒体中，通过氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS2)，由甘氨酸和琥珀酰-CoA合成δ氨基乙酰丙酸。

对于第2反应，δ氨基乙酰丙酸从线粒体转移到细胞质，在细胞质中通过氨基乙酰丙酸脱氢酶(ALAD)变成胆色素原。

对于第3反应，胆色素原在细胞质中通过胆色素原脱氨酶(PBGD)变成羟甲基胆色烷(Hydroxymethylbilane)。

对于第4反应，羟甲基胆色烷在细胞质中通过尿卟啉原III合成酶(URO3S)变成尿卟啉原III。

对于第5反应，尿卟啉原III在细胞质中通过尿卟啉原III脱羧酶(UROD)变成粪卟啉原III。

对于第6反应，粪卟啉原III从细胞质转移到线粒体内，在线粒体中通过粪卟啉原氧化酶(CPO)变成原卟啉原IX。

对于第7反应，原卟啉原IX在线粒体中通过原卟啉原氧化酶(PPO)变成原卟啉IX(PPIX)。

对于第8反应，在线粒体中通过亚铁螯合酶(FECH)向原卟啉IX(PPIX)添加铁，变成血红素。

血红素转移到细胞质，与珠蛋白结合变成血红蛋白。

[表1]

在血红素生物合成途径的第8反应中，在FECH的作用受到抑制的情况下，作为其底物的原卟啉IX(PPIX)蓄积。

另外，在第7反应中，在原卟啉原氧化酶(PPO)的作用受到抑制的情况下，原卟啉原IX向细胞质漏出并自然氧化，变成原卟啉IX(PPIX)。由于细胞质中不存在亚铁螯合酶(FECH)，原卟啉IX(PPIX)在细胞质中蓄积。

因此，在抑制生物合成途径的下游酶(PPO或FECH)的化合物暴露的情况下，血红素的生物合成受到抑制，原卟啉IX(PPIX)蓄积。因此，原卟啉IX(PPIX)的蓄积成为血红素生物合成抑制以及下游酶抑制的指标。

另一方面，对于生物合成途径的上游酶(ALAS2、ALAD、PBGD、URO3S、UROD、CPO)的作用受到抑制的情况，血红素的生物合成受到抑制，但原卟啉IX(PPIX)不蓄积。

在血红素的生物合成抑制强烈发生的情况下诱发贫血。贫血在胚胎发生期的非常重要的时期被诱发的情况下，具有产生胎儿死亡、胎儿发育延迟、心脏肥大伴随的室中隔缺损等致畸性的可能性。

[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]

本发明提供包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法。下文也称为本发明的制备方法。本发明的制备方法即使在实施多次的情况下也能够获得再现性良好的结果。本发明的制备方法的一个方式包括：

悬浮培养多潜能干细胞、形成细胞聚集体的步骤(1)，以及

从步骤(1)中得到的细胞聚集体得到包含胚胎型成红细胞的细胞群体的步骤(2)。

＜步骤(1)＞

步骤(1)中应用的培养基没有特别限定，只要是上述定义项中记载的培养基即可。步骤(1)中应用的培养基可以是含血清的培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定成分的混入，以及防止血清的制造商、批次的差异引起的成分偏差影响再现性的观点出发，优选使用无血清培养基。为了避免配制的复杂性，优选使用市售的用于干细胞的培养基，例如STEMdiff Hematopoietic基础培养基与STEMdiff Hematopoietic Supplement A的混合液(STEMCELL Technologies公司制)。也另外优选步骤(1)中应用的培养基含有细胞保护剂。为了抑制细胞死亡，其时应用的细胞保护剂优选地包含Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制物质，更优选地包含Y-27632。优选地，步骤(1)在不存在红细胞生成素、干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素11(IL-11)、氢化可的松以及胰岛素样生长因子(IGF)等生长因子、以及饲养细胞的条件下进行。

在步骤(1)开始时，优选地，在维持未分化状态的条件下培养的多潜能干细胞被分散为单个细胞。因此，优选在步骤(1)之前进行使多潜能干细胞分散的操作。通过分散操作得到的“分散的细胞”优选地是单个细胞，但也可以包含例如由2个以上100个以下的少数细胞组成的细胞的团块，也可以包含由2个以上50个以下的细胞组成的细胞的团块。“分散的细胞”也可以包含例如70％以上的单个细胞以及30％以下的细胞的团块，优选地包含80％以上的单个细胞以及20％以下的细胞的团块。“分散的细胞”列举几乎不存在细胞彼此的粘附(例如平面粘附)的状态。在一部分方式中，“分散的细胞”可列举几乎不存在细胞-细胞连接(例如粘附连接)的状态。

作为使在维持未分化状态的条件下培养的多潜能干细胞分散的方法，可列举机械分散处理、细胞分散液处理、添加细胞保护剂的处理，也可以组合进行这些处理。对分散处理而言，优选地，可与添加细胞保护剂的处理同时进行细胞分散液处理，随后进行机械分散处理。分散的细胞在上述培养基中悬浮。

作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理、利用刮刀的刮片操作等。

作为细胞分散液处理中应用的细胞分散液，可以列举包含胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等酶以及乙二胺四乙酸等螯合剂中至少1种的溶液。也可以应用市售的细胞分散液，例如TripLE Select(Thermo FisherScientific公司制)、TripLE Express(Thermo Fisher Scientific公司制)、Accutase(Innovative Cell Technologies公司制)、Accumax(Innovative Cell Technologies公司制)等。

作为添加细胞保护剂的处理中应用的细胞保护剂，可以列举FGF信号转导途径作用物质、肝素、Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制物质、肌球蛋白抑制物质或血清替代物。作为优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。为了抑制通过分散诱导的多潜能干细胞(特别是人多潜能干细胞)的细胞死亡，也可以在从步骤(1)开始时添加ROCK抑制物质。作为ROCK抑制物质，可以列举Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺，二盐酸盐)、法舒地尔(Fasudil)(HA1077)(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪，盐酸盐)、H-1152(5-[[(2S)-六氢-2-甲基-1H-1,4-二氮杂

作为使多潜能干细胞分散的方法，可列举例如，将多潜能干细胞的集群在作为细胞保护剂的ROCK抑制物质存在的情况下用细胞分散液(Accumax，Accutase等)处理，进一步通过吹打进行分散的方法。

通过将分散的多潜能干细胞的悬浮液接种在培养器材中，将分散的多潜能干细胞在针对培养器材非粘附性的条件下培养、也即悬浮培养，由此多个多潜能干细胞汇聚而形成细胞聚集体。为了进行悬浮培养，优选在步骤(1)中，培养器材应用上述细胞非粘附性的培养器材。

此时，可以通过将分散的多潜能干细胞接种在如10cm培养皿的比较大的培养器材中而在1个培养器材中同时形成多个细胞聚集体，但从不容易引起各个细胞聚集体的大小的偏差的观点出发，优选例如在如细胞非粘附性的96孔微板的多孔板(U形底、V形底)的各孔中接种一定数目的分散的多潜能干细胞。通过将其静置培养、细胞迅速凝聚，能够在每个孔中形成1个细胞聚集体。作为多孔板，例如，可列举PrimeSurface 96V底板(MS-9096V，住友Bakelite株式会社制)。如果从多个孔回收该细胞聚集体，可以得到均一的细胞聚集体的群体。如果细胞聚集体是均一的，则在其后的步骤中，每孔以及每个重复实验的制备效率更稳定，能够再现性更好地得到包含胚胎型成红细胞的细胞群体。

为了更均一、有效地形成细胞聚集体，可以适当设定步骤(1)中接种的多潜能干细胞的细胞数。例如，在应用96孔微孔板悬浮培养人多潜能干细胞的情况下，将使得成为每1个孔通常约1×10

用于从分散的多潜能干细胞形成细胞聚集体所需的悬浮培养的时间可以根据应用的多潜能干细胞适当确定，但为了形成均一的细胞聚集体，期望为尽可能短的时间。在从分散的细胞形成细胞聚集体中，细胞集合、随后集合的细胞形成细胞聚集体。例如，在人多潜能干细胞(人iPS细胞等)的情况下，从接种分散的细胞的时间点(也即悬浮培养开始时)起，细胞在优选地约24小时以内、更优选地约12小时以内、进一步优选地6小时以内集合，细胞聚集体在优选地约72小时以内、更优选地约48小时以内、进一步优选地24小时以内形成。至该团块形成的时间可以通过调整使细胞凝集的用具、离心条件等而适当调节。

在本发明的制备方法中，优选通过使分散的多潜能干细胞迅速地聚集形成均一的细胞聚集体。作为使细胞聚集的实验性操作，可列举例如应用小孔的板(例如孔的底面积以平底换算为0.1～2.0cm

在步骤(1)中，将多潜能干细胞接种在培养器材之后离心使细胞集合，促进细胞聚集体的形成是优选的。离心的条件可以适当设定，但例如，通过应用摆动转子的板用的离心机在100G至300G的离心加速度下进行1分钟至10分钟离心操作，可以促进细胞聚集体的形成。

步骤(1)中的培养温度、CO

细胞聚集体的形成可以基于细胞聚集体的大小以及细胞数目、宏观的形态、通过组织染色分析的微观的形态以及其均一性、分化以及未分化标记物的表达以及其均一性、分化标记物的表达控制以及其同步性、分化效率在团块间的再现性等判断。

细胞聚集体形成后，为了得到期望的细胞聚集体，也可以原样继续细胞聚集体的培养。对步骤(1)中悬浮培养的时间，也即至上述细胞聚集的时间、至细胞聚集体形成的时间、与按需要继续的悬浮培养时间的总计时间而言，通常是约8小时以上6天以内，优选地约12小时以上96小时以内。也即，优选地，从步骤(1)开始至后述步骤(2a)开始的时间优选为约12小时以上96小时以内。培养时间过短，则具有构成细胞聚集体的细胞的数目少的倾向，培养时间过长，则具有细胞分化过度进行的倾向。

＜步骤(2)＞

步骤(2)是从步骤(1)中得到的细胞聚集体得到包含胚胎型成红细胞的细胞群体的步骤。

包含胚胎型成红细胞的细胞群体可以是任何细胞群体，只要其包含胚胎型成红细胞即可，可以包含源自细胞聚集体的全部细胞，也可以是包含全部细胞的细胞群体的一部分。细胞群体优选地在与生物体内胚胎型成红细胞存在的环境不同的环境下存在，优选为与生物体内胚胎型成红细胞存在的环境中的细胞的群体相比，构成所述细胞群体的细胞的种类或细胞的存在比率不同的那些。

步骤(2)中得到的细胞群体包含胚胎型成红细胞。胚胎型成红细胞是上述定义的项目中陈述的细胞，是否为胚胎型成红细胞可通过对ε-珠蛋白免疫染色鉴定。假定细胞群体中包含的胚胎型成红细胞的基因表达以及功能与生物体内胚胎型成红细胞的那些同样。

免疫染色的结果的解释可以通过本领域技术人员通过目视辨别、或使用图像分析软件对摄下的图像进行定量分析等本领域技术人员公知的方法进行。解释免疫染色的结果时，例如，参照蛋白质核酸酶Vol.54No.2(2009)P185-192等，必需排除自发荧光、二次抗体的非特异性吸附、多重染色时的荧光泄露等引起的假阳性。ε-珠蛋白表达的有无按照后述的预备实验中示出的方法判断。

包含胚胎型成红细胞的细胞群体是指任意细胞群体，但在构成细胞群体的细胞之中，优选地至少70％、更优选地至少80％的细胞是胚胎型成红细胞。根据本发明涉及的制备方法，可以得到数目多的胚胎型成红细胞，群体中包含的胚胎型成红细胞的比例也可以变大。对细胞群体中胚胎型成红细胞的比例而言，可以在通过核染色观察的活细胞之中的、通过与后述预备实验中的免疫染色同样的方法确定为ε-珠蛋白进行表达的细胞的数目而求得。

另外，在细胞群体中，在细胞表达的β珠蛋白基因家族之中，优选地至少50％、更优选地至少60％是ε-珠蛋白基因。根据本发明涉及的制备方法，可以得到高表达ε-珠蛋白的细胞群体。对β珠蛋白基因家族之中的ε-珠蛋白基因的表达比例而言，可以作为β珠蛋白基因家族的mRNA的总量中的、ε-珠蛋白基因的mRNA的相对表达量而求得。mRNA的相对表达量可以通过与后述实施例1中实时PCR同样的方法求得。

＜步骤(2a)＞

步骤(2)包含将细胞聚集体贴壁培养的步骤(2a)。

步骤(2a)中应用的培养基没有特别限制，只要其是如上述定义的项目中记载的那种即可。步骤(2a)中应用的培养基可为含有血清的培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定成分的混入，以及防止血清的制造商、批次的差异引起的成分偏差影响再现性的观点出发，本发明中优选使用无血清培养基。为了避免配制的复杂性，优选使用市售的用于干细胞的培养基，例如STEMdiff Hematopoietic基础培养基与STEMdiff HematopoieticSupplement B的混合液(STEMCELL Technologies公司制)。为了抑制多潜能干细胞的细胞死亡，步骤(2a)中应用的培养基也优选另外含有细胞保护剂。其时应用的细胞保护剂优选与步骤(1)中应用的那种同样的物质，更优选地包含ROCK抑制物质，进一步优选地包含Y-27632。

优选地，步骤(2a)应用细胞粘附性的培养器材进行。细胞粘附性的培养器材没有特别限定，只要进行可以进行上述细胞粘附的表面处理等即可。作为这样的培养器材，例如，可以应用市售的用于粘附细胞培养的3.5cm培养皿、6cm培养皿、10cm培养皿、以及24孔板、6孔板等的用于细胞培养的板等。

对于步骤(2a)中应用的培养器材，从促进细胞聚集体的粘附与向成红细胞的分化的观点看来，优选用促进细胞的粘附、附着的基质进行包被。作为如上述的基质，例如，可列举基膜制剂、重组细胞外基质、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、Synthemax等合成基质。本发明中应用的促进细胞的粘附、附着的基质优选地包含基膜制剂，更优选地包含基质胶。

步骤(2a)中的贴壁培养通过将步骤(1)中形成的细胞聚集体转移至细胞粘附性的培养器材进行。其时应用的转移方法没有特别限制，但对细胞聚集体的物理负荷少是优选的。作为这种转移方法，例如，可列举应用大口移液管头和微量移液管的团块的转移等。

步骤(2a)也可以在饲养细胞存在的情况下进行。作为饲养细胞没有特别限制，但优选骨髓间充质细胞、骨髓间充质细胞衍生细胞株或成纤维细胞，优选OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞)或C3H10T1/2细胞(clone8)(小鼠胚胎衍生成纤维细胞)，更优选OP9细胞。通过在接种的饲养细胞上贴壁培养细胞聚集体，能够促进向胚胎型成红细胞的分化，特别是在作为多潜能干细胞应用大鼠ES细胞的情况下，能够更加增加向胚胎型成红细胞的分化效率。

步骤(2a)优选在选自红细胞生成素、红细胞生成素受体激动剂、红细胞生成素受体介导的信号转导途径作用物质中的至少1种存在的情况下进行。作为红细胞生成素受体激动剂，例如，可列举达贝泊汀(darbepoetin)、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(Epoetinbeta)、红细胞生成素模拟肽等。作为红细胞生成素受体介导的信号转导途径作用物质，例如，可列举使Janus激酶2(JAK2)活化的物质、对于JAK2的脱磷酸化酶的抑制剂等。上述物质的浓度可以适当设定，但从向胚胎型成红细胞分化的有效性的观点出发，在红细胞生成素存在的情况下进行步骤(2a)时，其浓度是例如1ng/mL以上500ng/mL以下，优选地10ng/mL以上100ng/mL以下。在应用红细胞生成素以外的物质时，以与上述浓度的红细胞生成素显示同等的信号转导途径作用的浓度应用是优选的。另外，这些因子的添加时期可以与步骤(2a)开始同时，也可以与其不同。

另外，从向胚胎型成红细胞分化的有效性的观点出发，步骤(2a)也可以在进一步的增殖因子等存在的情况下进行，优选地，在选自由干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素11(IL-11)、氢化可的松以及胰岛素样生长因子(IGF)组成的组中的至少1种存在的情况下进行。这些因子的浓度可以适当设定，但在干细胞因子存在的情况下进行步骤(2a)时，其浓度是例如1ng/mL以上500ng/mL以下，优选地10ng/mL以上100ng/mL以下。在白细胞介素3存在的情况下进行步骤(2a)时，其浓度是例如0.1ng/mL以上100ng/mL以下，优选地1ng/mL以上50ng/mL以下。在白细胞介素11存在的情况下进行步骤(2a)时，其浓度是例如0.1ng/mL以上100ng/mL以下，优选地1ng/mL以上50ng/mL以下。在氢化可的松存在的情况下进行步骤(2a)时，其浓度是例如0.01μM以上50μM以下，优选地0.1μM以上10μM以下。在胰岛素样生长因子存在的情况下进行步骤(2a)时，其浓度是例如0.1ng/mL以上100ng/mL以下，优选地1ng/mL以上50ng/mL以下。另外，这些因子的添加时期可以与步骤(2a)开始同时，也可以与其不同。

步骤(2a)中的培养温度、CO

对步骤(2a)的培养时间而言，在至得到目的细胞群体期间，可以根据细胞的种类、培养条件而适当设定。对于应用人iPS细胞的情况，例如，是2天以上18天以内，优选地3天以上18天以内，更优选地4天以上10天以内。对于应用大鼠ES细胞的情况，例如，是2天以上18天以内。优选地2天以上10天以内，更优选地3天以上8天以内。培养时间过短，则具有得不到胚胎型成红细胞的倾向，培养时期过长，则具有胚胎型成红细胞的分化过度进行的倾向。

＜步骤(2b)＞

步骤(2)可以进一步包括回收包含胚胎型成红细胞的细胞群体的步骤(2b)。

在步骤(2b)中回收的细胞群体可以是选自步骤(2a)的培养后得到的粘附细胞以及悬浮细胞组成的组中的至少一种，但从增加细胞群体中胚胎型成红细胞所占比例的观点出发，优选仅回收悬浮细胞。通过仅回收悬浮细胞，容易得到在构成细胞群体的细胞之中优选地至少70％、更优选地至少80％的细胞是胚胎型成红细胞的细胞群体。另外，通过仅回收悬浮细胞，容易得到细胞表达的β珠蛋白基因家族之中优选地至少50％、更优选地至少60％是ε-珠蛋白基因的细胞群体。回收的悬浮细胞可以是悬浮细胞的全部，也可以是其一部分。

作为回收悬浮细胞的方法没有特别限定，只要是能够将含有悬浮细胞的培养基用移液管等回收到管等中的方法即可。通过将管等离心、除去上清液，可以得到细胞群体的球团。作为回收悬浮细胞的其它方法，例如，可列举应用针对细胞表面标记物的抗体的荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting：FACS)、磁性激活细胞分选(MACS)、过滤等。

为了使细胞稳定，步骤(2b)也可以在细胞保护剂存在的情况下进行，其时应用的细胞保护剂优选地包含ROCK抑制物质，更优选地包含Y-27632。

＜步骤(3)＞

也可以包括步骤(3)，所述步骤(3)将通过步骤(2)得到的包含胚胎型成红细胞的细胞群体进一步培养。

步骤(3)中培养的细胞群体优选地是步骤(2b)中回收的细胞群体，更优选地是将步骤(2b)中悬浮的细胞回收而成的、包含胚胎型成红细胞的细胞群体。步骤(3)优选地应用细胞粘附性的培养器材进行悬浮培养。通过应用细胞粘附性的培养器材悬浮培养细胞群体，能够使成红细胞以外的粘附性的细胞粘附于培养器材，从悬浮的细胞群体除去粘附性的细胞。另外，步骤(3)优选地在饲养细胞不存在的情况下进行。

步骤(3)中应用的培养基可以与上述步骤(2a)中应用的培养基相同，也可以与其不同。对于步骤(3)，在应用人iPS细胞的情况下，例如，使用市售的STEMdiffHematopoietic基础培养基与STEMdiff Hematopoietic Supplement B的混合液(STEMCELLTechnologies公司制)是优选的。在应用大鼠ES细胞的情况下，使用StemlineII培养基(Sigma Aldrich公司制)是优选的。为了使细胞稳定，步骤(3)中应用的培养基也可以包含细胞保护剂，优选地包含ROCK抑制物质，更优选地包含Y-27632。

步骤(3)在选自由红细胞生成素、红细胞生成素受体激动剂、红细胞生成素受体介导的信号转导途径作用物质组成的组中的至少1种存在的情况下进行是优选的。作为这些因子，也可以继续应用上述步骤(2a)中应用的因子。这些因子的浓度可以是与上述步骤(2a)中应用的浓度相同的浓度，也可以与其不同。在红细胞生成素存在的情况下进行步骤(3)时，其浓度是例如1ng/mL以上500ng/mL以下，优选地10ng/mL以上100ng/mL以下。在应用除了红细胞生成素以外的物质时，优选应用与上述浓度的红细胞生成素显示同等的信号转导途径作用的浓度。另外，步骤(3)也可以在干细胞因子存在的情况下进行。干细胞因子可以以与上述(2a)中应用的浓度相同的浓度应用，也可以与其不同。这些因子的添加时期可以与步骤(3)开始同时，也可以与其不同。

另外，在步骤(3)中，优选不包含选自由白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子组成的组中的至少1种，更优选不包含白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子中的全部。另外，步骤(3)优选在饲养细胞不存在的条件下进行。已知如果在分化诱导条件下继续培养包含胚胎型成红细胞的细胞群体，则作为胚胎型成红细胞的标记物的ε-珠蛋白的表达减少，γ-珠蛋白以及β-珠蛋白的表达增加，向胎儿型或成人型成红细胞的分化会进展。但是，当在上述条件下进行步骤(3)时，即使继续培养，也可以保持构成细胞群体的细胞之中表达ε-珠蛋白的胚胎型成红细胞的比例较高不变，另外，可以保持群体中细胞表达的β珠蛋白基因家族之中的ε-珠蛋白的表达量较高。

步骤(3)中的培养温度、CO

为了得到目的细胞群体，步骤(3)的培养时间可以根据细胞的种类、培养条件适当设定，可以设为例如2天以上。对于应用人iPS细胞的情况，可以设为4天以上，也可以设为8天以上14天以内。对于应用大鼠ES细胞的情况，可以设为3天以上，也可以设为4天以上10天以内。

本发明涉及的制备方法中应用的多潜能干细胞没有特别限定，优选地是ES细胞或iPS细胞。对于本发明涉及的制备方法中应用的多潜能干细胞，优选是哺乳动物的多潜能干细胞，更优选为灵长类多潜能干细胞、啮齿类多潜能干细胞或兔多潜能干细胞，进一步优选为人多潜能干细胞或大鼠多潜能干细胞。

[3.应用包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法]

应用包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法包括：

悬浮培养多潜能干细胞、形成细胞聚集体的步骤(A)，

从步骤(A)中得到的细胞聚集体得到包含胚胎型成红细胞的细胞群体的步骤(B)，

在试验化合物存在的情况下培养细胞群体的步骤(C)，以及

测定下列之中至少一个项目的步骤(D)：步骤(C)中培养的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的1)细胞数、2)血红素浓度、3)原卟啉IX浓度、以及4)珠蛋白表达量。

＜步骤(A)＞

步骤(A)可以以与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]中的步骤(1)相同的方法进行。

＜步骤(B)＞

步骤(B)可以以与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]中的步骤(2)相同的方法进行。步骤(B)包括贴壁培养细胞聚集体的步骤(Ba)。步骤(Ba)可以以与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]中的步骤(2a)相同的方法进行。另外，步骤(B)也可进一步包括回收细胞群体的步骤(Bb)。步骤(Bb)可以以与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]中的步骤(2b)相同的方法进行。

＜步骤(C)＞

对于步骤(C)，在试验化合物存在的情况下培养步骤(B)中得到的细胞群体。步骤(C)中培养的细胞群体优选地是步骤(Bb)中回收的细胞群体，更优选地是步骤(Bb)中回收悬浮细胞而成的细胞群体。

如果没有特别记载，步骤(C)中应用的培养基、生长因子、培养器材、其它培养条件等优选地应用与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]的步骤(3)相同的那些。优选地，步骤(C)优选地应用细胞粘附性的培养器材进行悬浮培养。另外，步骤(C)优选地在饲养细胞不存在的情况下进行。

步骤(C)的试验化合物没有特别限定，但优选应用诱导血红蛋白合成的抑制、胎儿的正常发育的抑制、致畸性或胚胎致死性的物质，或疑为这些的物质。作为试验化合物，例如，可列举二氢青蒿素、琥珀酰丙酮等。试验化合物的浓度可以在适合试验的范围适当设定。作为试验化合物的对照，可以应用用于溶解试验化合物的溶剂，例如，可列举二甲亚砜(DMSO)等，也可以应用不添加试验化合物的条件。

在试验化合物存在的情况下培养细胞群体的方法没有特别限定，只要是构成细胞群体的细胞与试验化合物进行接触的方法即可，例如，可列举在培养细胞群体的培养基中添加试验化合物的方法、或用预先添加试验化合物的培养基开始细胞群体的培养的方法。

在本方法中，在构成细胞群体的细胞之中，优选地至少70％、更优选地至少80％的细胞是胚胎型成红细胞。也即，对在步骤(B)中得到、在步骤(C)中培养、到进行步骤(D)的分析而言，对于细胞群体，其70％以上的细胞中保持作为胚胎型成红细胞标记物的ε-珠蛋白的表达是优选的。对细胞群体中胚胎型成红细胞的比例而言，可以在通过核染色观察的活细胞之中的、通过与后述预备实验中的免疫染色同样的方法确定为ε-珠蛋白进行表达的细胞的数目而求得。如果细胞群体中胚胎型成红细胞的比例为上述范围，则可以更适当地研究化合物对胚胎型成红细胞的影响。

另外，在本方法中，在细胞群体中，细胞表达的β珠蛋白基因家族之中，优选地至少50％、更优选地至少60％为ε-珠蛋白基因是优选的。也即，对在步骤(B)中得到、在步骤(C)中培养、到进行步骤(D)的分析而言，对于细胞群体，在细胞表达的β珠蛋白基因家族之中，优选地至少50％表达ε-珠蛋白基因，更优选地至少60％表达ε-珠蛋白基因。对β珠蛋白基因家族之中的ε-珠蛋白基因的表达比例而言，可以作为β珠蛋白基因家族的mRNA的总量中ε-珠蛋白基因的mRNA的相对表达量而求得。mRNA的相对表达量可以通过与后述实施例1中的实时PCR同样的方法求得。如果β珠蛋白基因家族的mRNA的总量中ε-珠蛋白基因的mRNA的相对表达量是上述范围，则可以准确性更好地研究化合物对胚胎型成红细胞的影响。

在步骤(C)中，优选不包含选自由白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子组成的组中的至少1种，更优选不包含白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子的全部。另外，步骤(C)优选在饲养细胞不存在的条件下进行。已知如果在分化诱导条件下继续培养包含胚胎型成红细胞的细胞群体，则作为胚胎型成红细胞的标记物的ε-珠蛋白的表达减少，γ-珠蛋白以及β-珠蛋白的表达增加，向胎儿型或成人型成红细胞的分化会进展。但是，如果在上述条件下进行步骤(C)，则即使继续培养，也可以保持构成细胞群体的细胞之中表达ε-珠蛋白的胚胎型成红细胞的比例较高不变，另外，可以保持群体中细胞表达的β珠蛋白基因家族之中的ε-珠蛋白的表达量较高。因此，即使在为了研究化合物的影响而期望进行数天培养的情况下，也可以研究特别是对胚胎型成红细胞的影响。

步骤(C)的培养时间可以根据细胞的种类、培养条件适当设定，可以设为例如2天以上。对于应用人iPS细胞的情况，可以设为4天以上，也可以设为8天以上14天以内。对于应用大鼠ES细胞的情况，可以设为3天以上，也可以设为4天以上10天以内。

＜步骤(D)＞

对于步骤(D)，测定选自下列的至少1个项目：步骤(C)中培养的细胞群体的1)细胞数、2)细胞生存率、3)血红素浓度、4)原卟啉IX浓度、以及5)珠蛋白表达量。通过测定上述项目的测定结果、与在对照(例如DMSO等溶剂对照)存在的情况下进行了步骤(C)的细胞群体的上述项目，可以研究试验化合物对胚胎型成红细胞的影响。另外，通过应用包含对照化合物的多个试验化合物、测定在各个试验化合物存在的情况下进行了步骤(C)的细胞群体的上述项目、并对结果进行比较，也可以筛选能够诱导血红蛋白合成的抑制、胎儿正常发育的抑制、致畸性或胚胎致死性的试验化合物。

1)细胞数以及2)细胞生存率

细胞数可以通过用血细胞计数器、自动细胞计数器等，对步骤(C)的培养后细胞群体中的活细胞数进行计数而求得。细胞生存率可以通过下列方法适当测定：借助台盼蓝染色的利用死细胞染色的方法，通过细胞内源性的ATP定量的方法，利用线粒体活性的MTT测定法，应用钙黄绿素AM的活细胞的酯酶活性测定方法等。例如，对于借助台盼蓝染色的方法，是指用步骤(C)的培养结束时的台盼蓝阴性细胞数除以台盼蓝阴性细胞数与阳性细胞数的合计值而成的值。

3)血红素浓度以及4)原卟啉IX浓度

血红素浓度以及原卟啉IX的浓度可以通过用液相色谱-质谱分析法(LC-MS)等分析细胞群体而测定。

5)珠蛋白表达量

珠蛋白表达量可以通过用于检测RNA或蛋白质的表达的公知方法测定。珠蛋白的RNA表达量可以例如在用公知方法从细胞群体提取RNA后，通过实时PCR、转录组分析等测定。珠蛋白的蛋白质表达量可以例如，在用公知方法从细胞群体提取蛋白质后，通过蛋白质印迹、酶联免疫吸附法(ELISA)、液相色谱-质谱分析法(LC-MS)等测定。

除了上述1)～5)的项目之外，可以通过测定分化标记物基因的表达而研究对细胞的分化的影响。除了示例的方法以外，上述项目也可以通过代谢组学分析、外显子组分析(exome analysis)、表观基因组变化分析等研究试验化合物对包含胚胎型成红细胞的细胞群体的影响。

本发明涉及的试验方法中应用的多潜能干细胞没有特别限定，但优选地是ES细胞或iPS细胞。对于本发明涉及的试验方法中应用的多潜能干细胞优选是哺乳动物的多潜能干细胞，更优选为灵长类多潜能干细胞、啮齿类多潜能干细胞或兔多潜能干细胞，进一步优选为人多潜能干细胞或大鼠多潜能干细胞。

＜应用包含来自多个生物物种的胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法＞

也可以应用包含来自多个生物物种的胚胎型成红细胞的细胞群体进行上述的化合物试验方法，在步骤(D)中，对从来自多个生物物种的多潜能干细胞得到的各自的细胞群体进行测定。通过对从来自多个生物物种的多潜能干细胞得到的各自的细胞群体进行上述测定、比较其结果，可以研究试验化合物对细胞群体的影响的物种差异。

对于多个生物物种，优选为哺乳动物，更优选包括属于由灵长类、啮齿类以及兔目组成的组的生物之中的至少2种，进一步优选包括人以及大鼠。

[4.包含胚胎型成红细胞的细胞群体]

在本发明涉及的包含胚胎型成红细胞的细胞群体中，构成细胞群体的细胞之中至少70％的细胞是胚胎型成红细胞，优选地至少80％、更优选地至少90％、进一步优选地至少95％、最优选地至少99％的细胞是胚胎型成红细胞。

包含胚胎型成红细胞的细胞群体可以与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]中记载的方法同样地进行而制备，其中，例如，可以通过回收悬浮的细胞群体，得到有至少70％或80％的细胞是胚胎型成红细胞的细胞群体。可以通过对悬浮的细胞群体进一步通过FACS、MACS等收集表达ε-珠蛋白的细胞，得到有至少90％的细胞是胚胎型成红细胞的细胞群体。

包含胚胎型成红细胞的细胞群体也可以是化合物试验中应用的细胞群体。化合物试验例如列举上述[3.应用包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法]中记载的试验。

包含胚胎型成红细胞的细胞群体以保持ε-珠蛋白的表达的状态进行保存是优选的。所谓进行保存，包括例如将细胞群体置于可以移动的状态。另外，保持ε-珠蛋白的表达的状态是指，细胞群体中胚胎型成红细胞的比例、或细胞群体中β珠蛋白基因家族之中ε-珠蛋白的表达量在保存前与保存后的变化量是例如30％以内、优选地20％以内。

作为这种保存状态，可列举以下状态：例如，以不与选自由白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子组成的组中的至少1种，及饲养细胞以及饲养细胞的培养上清液进行接触的状态，保存在培养基、生理盐水、保存液等中。另外，保存可以在冷冻条件下(不足0℃)、低温条件下(例如0℃以上不足25℃)，也可以在与培养温度接近的条件下(25℃以上38℃以下)。对于冷冻条件下，例如，可以在细胞冷冻液中悬浮细胞群体，将其分配到冷冻管等中，在超低温(-150℃～-70℃)或液氮(-196℃)下冷冻保存。

当细胞群体以保持ε-珠蛋白的表达的状态进行保存时，当例如将细胞群体进一步培养时，可以培养胚胎型成红细胞的比例较高的细胞群体。

[5.细胞培养组合物]

细胞培养组合物包含含有胚胎型成红细胞的细胞群体与培养基。含有胚胎型成红细胞的细胞群体也可以与上述[2.包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备方法]中记载的方法同样地制备。细胞培养组合物可以是将细胞群体在培养基中悬浮的悬浮液，也可以细胞群体与培养基是分开的。

作为培养基，也可以使用上述[3.应用包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验方法]的步骤(C)中应用的培养基。

细胞培养组合物中包含的培养基优选不包含选自由白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子组成的组中的至少1种，更优选不包含白细胞介素3、白细胞介素11、氢化可的松以及胰岛素样生长因子的全部。另外，在细胞培养组合物包含的培养基中，优选不包含饲养细胞的培养上清液。

另外，对细胞培养组合物中包含的培养基而言，优选包含选自由红细胞生成素、红细胞生成素受体激动剂、红细胞生成素受体介导的信号转导途径作用物质组成的组中的至少1种。另外，细胞培养组合物包含的培养基中也可以含有干细胞因子。

实施例

下文示出实施例，对本发明进行更详细说明，但它们不限制本发明的范围。另外，除非另有限定，使用的试剂以及材料可以商购获得。

[预备实验：免疫染色结果的定量与判断标准]

进行用于荧光免疫染色标本的阳性或阴性的辨别的荧光强度的定量。作为染色强度的定量手段，对实施例1中制备的从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天的悬浮的细胞群体的涂抹标本，通过与实施例1同样的方法进行了借助抗HBE1抗体的荧光免疫染色。对于所得的拍摄图像(图2的上部)(最大激发波长490nm，最大荧光波长525nm)，输出由线段A-A’显示的感兴趣区域的线性荧光强度概况，比较了有细胞的区域与不存在细胞的区域的荧光强度。对于图2的下部示出的分析结果，不存在细胞的区域的荧光强度是170，目视辨别为阳性的荧光强度强的区域的数值是4095，荧光强度比上述弱的阳性区域的数值是1438。另一方面，目视辨别为阴性的区域的数值是511。因此可知，如图2的下部的图中以虚线所示，与在明场中确认不存在细胞的区域的荧光强度的平均值相比，通过将显示了为5倍以上高的数值之处作为阳性，定量地进行了抗原的染色结果的阳性或阴性的辨别。以下的实验通过与本预备实验同样的方法进行表达的阳性或阴性的判断。

[实施例1：从人iPS细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体]

＜维持培养＞

人iPS细胞(HC-6#10株，从理化学研究所得到)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养条件下维持培养。作为无饲养培养基，应用StemFit AK02N培养基(AJINOMOTO CO.,INC.)(下文称为“StemFit培养基”)，无饲养构架应用了Laminin511-E8(Nippi,Inc.制)。

作为具体的维持培养操作，首先将成为亚汇合的人iPS细胞用PBS洗涤，之后用Accumax(Innovative Cell Technologies公司制)进行酶处理，之后添加StemFit培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥离细胞，通过吹打分散成单个细胞。其后，将分散为单个细胞的人iPS细胞以0.5μg/cm

＜步骤(1)＞

按照图3示出的顺序，开始人iPS细胞的分化诱导。将配制的亚汇合的人iPS细胞用PBS洗涤，用Accumax进行酶处理，之后添加StemFit培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥离细胞，通过吹打分散成单个细胞。将包含人iPS细胞的悬浮液离心，除去培养基。将人iPS细胞再次悬浮于STEMdiff Hematopoietic基础培养基与STEMdiff HematopoieticSupplement A的混合液(STEMCELL Technologies公司制)(下文称为“STEMdiff+A培养基”)，在Y27632(终浓度20μM)存在的情况下，在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface96V底板，住友Bakelite株式会社制)中接种使得每1孔75μL的培养基中为3×10

将培养板用离心机(日立工机株式会社制，CF8DL)以1000rpm离心5分钟离心后，在37℃、5％CO

＜步骤(2)＞

在用20倍稀释的生长因子减少的基质胶(growth factor-reduced Matrigel,Corning公司制)包被的细胞粘附性的6孔板中，用微量移液器将每1孔转移5个从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天的来自人iPS细胞的细胞聚集体，在37℃、5％CO

从悬浮培养(步骤(1))开始起第7天(从步骤(2a)开始起第4天)，进一步追加0.5mL的STEMdiff+B培养基。从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)应用倒置显微镜进行了明场观察，结果在培养基中观察到悬浮的细胞群体(图4的B)。

在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)，回收包含悬浮的细胞群体的培养基(步骤(2b))，用离心机(Eppendorf公司制，centrifuge 5424)以7500rpm进行3分钟离心，之后除去上清液。

＜步骤(3)＞

对于一部分细胞，在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)，用微量移液器将含有悬浮的细胞群体的培养基转移到15mL试管，用离心机(日立工机株式会社制，CF8DL)以1000rpm进行5分钟离心。除去上清液后，在沉淀中添加Stemdiff+B培养基悬浮细胞，在细胞粘附性的6孔板(Corning公司制)中接种使得每1孔1.5mL的培养基中为2×10

进一步地对于一部分细胞，在从悬浮培养(步骤(1))开始起第14天(从步骤(3)开始起第4天)追加1mL的STEMdiff+B培养基，继续进行培养。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天(从步骤(3)开始起第8天)，用与上述回收方法相同的方法，回收了细胞群体。观察得到的细胞球团时，显示非常深的红色(图5)。

＜通过免疫染色的细胞群体的评价＞

通过免疫染色调查了在构成上述细胞群体的细胞之中胚胎型成红细胞的比例。将从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天得到的细胞群体用PBS(ThermoFisher Scientific公司制)洗涤，之后用4％多聚甲醛(和光纯药株式会社制)进行15分钟固定。应用Cytospin 4(Thermo Fisher Scientific公司制)和Cytofunnels(ThermoFisher Scientific公司制)制备了涂抹标本的载玻片后，应用添加0.2％Triton X-100(和光纯药株式会社制)的TBS(宝生物株式会社制)进行5分钟膜渗透处理。随后，将上述载玻片用Superblock封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司制)封闭1小时至3小时后，应用作为胚胎型成红细胞标记物的抗ε-珠蛋白(HBE1)抗体(Genetex公司制，稀释率750倍)以及作为成红细胞标记物的抗血型糖蛋白A(GPA)抗体(Novusbio公司制，稀释率100倍)进行了荧光免疫染色。作为荧光标记二次抗体分别应用Alexa488标记的驴抗兔抗体以及驴抗小鼠抗体(Thermo Fisher Scientific公司制，稀释率1000倍)。另外，为了核的对照染色，将2μg/ml的Hoechst 33342(同仁化学公司制)添加到二次抗体稀释液中。在染色的细胞的观察以及图像的取得中，应用了正立荧光显微镜Axio Imager M2(Carl Zeiss公司制)以及所附软件Axio Vision。

染色结果图像在图6中示出。从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天得到的细胞之中约80％以上是ε-珠蛋白阳性且血型糖蛋白A阳性(图6的A、B、G以及H)。显示能够通过本发明涉及的制备方法从人iPS细胞制备含有较多胚胎型成红细胞的细胞群体。另外，从悬浮培养(步骤(1))开始起第14天以及第18天得到的细胞群体也有约80％以上是ε-珠蛋白阳性且血型糖蛋白A阳性(图6的C、D、I及J，以及E、F、K及L)。可知通过本发明涉及的制备方法，在继续进行细胞群体的培养后也可以保持细胞群体中的胚胎型成红细胞的比例较高。

＜通过实时PCR的细胞群体的评价＞

通过实时PCR调查了上述细胞群体中细胞表达的β珠蛋白基因家族的表达比例。将含有从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的悬浮的细胞群体的培养基用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm进行5分钟离心后，除去上清液。将得到的细胞用PBS(Thermo Fisher Scientific公司制)洗涤后，用离心机(Eppendorf公司制，centrifuge5424)以7500rpm进行3分钟离心后，用RNeasy Micro试剂盒(QIAGEN公司制)从细胞提取总RNA。将得到的总RNA用SuperScript III(Thermo Fisher Scientific公司制)逆转录，将得到的cDNA作为模板，用TaqMan探针(Thermo Fisher Scientific公司制)以及TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific公司制)，在96孔板中以Fast PCR的条件，按照所附说明书的记载进行实时PCR。对Taqman探针而言，应用了表2中记载的人的探针。

用包含针对ε-珠蛋白、γ-珠蛋白以及β-珠蛋白的各β珠蛋白基因家族的TaqMan探针的目标序列的基因产物，制成标准曲线，对表达的各β珠蛋白基因家族的mRNA拷贝数进行定量。将表达的各β珠蛋白基因家族的拷贝数除以总β珠蛋白基因家族的拷贝数，得到的值显示为各β珠蛋白基因家族的表达比例。包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备与通过实时PCR的分析独立地进行3次，求出其平均值与标准误差。

结果在表3中示出。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的任一细胞群体中，细胞表达的总β珠蛋白基因家族之中约60％以上为胚胎型成红细胞标记物ε-珠蛋白基因。显示通过本发明涉及的制备方法能够从人iPS细胞制备高表达ε-珠蛋白的细胞群体。另外，可知通过本发明涉及的制备方法，在继续进行细胞群体的培养后，也保持ε-珠蛋白的表达较高。另外，进行了3次独立实验，其标准误差也十分小，可以说本发明的制备方法是再现性高的方法。

[表2]

实时PCR中使用的Taqman探针

[表3]

人iPS细胞衍生的成红细胞中的β珠蛋白基因家族的相对表达量(％)

[实施例2：从大鼠ES细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体]

＜维持培养＞

将大鼠ES细胞(来自DA大鼠，从DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.获得)接种在经丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞(ReproCELL公司制)上，在37℃、5％CO

作为具体的维持培养操作，将悬浮状态的大鼠ES细胞株的集群回收在15mL离心管中，用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm进行3分钟离心操作，除去上清液。其后，应用Accutase(Innovative Cell Technologies公司制)进行酶处理后，通过吹打分散为单个细胞。随后，将分散为单个细胞的大鼠ES细胞离心，除去上清液，之后添加大鼠ES培养基并通过吹打分散为单个细胞。其后，将分散为单个细胞的大鼠ES细胞接种在接种了经丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞(ReproCELL公司制)的塑料培养皿上，在37℃、5％CO

＜步骤(1)＞

按照图7所示的顺序，开始大鼠ES细胞的分化诱导。将配制的悬浮状态的大鼠ES细胞株的集群回收在15mL离心管中，用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm进行5分钟离心操作，除去上清液。其后，用Accutase(Innovative Cell Technologies公司制)进行酶处理后，通过吹打分散为单个细胞。随后，将分散为单个细胞的大鼠ES细胞离心，除去上清液。将大鼠ES细胞在STEMdiff+A培养基中悬浮，在Y27632(终浓度20μM)存在的情况下，在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板，住友Bakelite公司制)中接种使得每1孔75μL的培养基中为3×10

用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm离心5分钟后，在37℃、5％CO

＜步骤(2)＞

预先准备了用于进行步骤(2a)的饲养细胞。作为饲养细胞应用了OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞，从ATCC获得)。对于OP9细胞，应用了添加了10％FBS(Corning公司制)以及1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich公司制)的αMEM培养基(Nacalai Tesque公司制)(下文称为“OP9培养基”)，在10cm培养皿(Corning公司制)上进行维持培养。3至4天进行一次传代操作。作为传代操作，从OP9细胞贴壁的培养皿上除去上清液并用PBS进行洗涤，用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA溶液(Nacalai Tesque公司制)进行酶处理后，添加OP9培养基并吹打，回收OP9细胞。用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm进行3分钟离心操作后，除去上清液，将OP9细胞以每1个培养皿为1×10

用微量移液器每1孔转移5个从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天的来自大鼠ES细胞的细胞聚集体到上述6孔板中，在37℃、5％CO

从悬浮培养(步骤(1))开始起第5天(从步骤(2a)开始起第2天)从6孔板除去培养基，添加1mL在大鼠STEMdiff+B培养基中添加了氢化可的松(和光纯药株式会社制，终浓度1μM)、大鼠重组白细胞介素3(R&D Systems公司制，终浓度10ng/mL)、人重组白细胞介素11(R&D Systems公司，终浓度20ng/mL)、人重组胰岛素样生长因子1(R&D Systems公司制，终浓度20ng/mL)以及大鼠重组红细胞生成素(R&D Systems公司制，终浓度60ng/mL)的培养基。从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天(从步骤(2a)开始起第5天)用倒置显微镜以明场观察，结果在培养基中观察到悬浮的细胞群体(图8的B)。

按每个培养基回收从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天(从步骤(2a)开始起第5天)的悬浮的细胞群体(步骤(2b))、用离心机(Eppendorf公司制，centrifuge 5424)以7500rpm离心3分钟，除去上清液。

＜步骤(3)＞

对于一部分细胞，在从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天(从步骤(2a)开始起第5天)，用微量移液器将含有悬浮的细胞群体的培养基转移到15mL试管，用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm离心5分钟。除去上清液后，在沉淀中加入添加了大鼠重组红细胞生成素(R&D Systems公司制，终浓度60ng/mL)、大鼠重组干细胞因子(R&D Systems公司制，终浓度30ng/mL)以及Y27632(和光纯药株式会社制，终浓度20μM)的StemlineII培养基(Sigma Aldrich公司制)(下文称为大鼠StemlineII培养基)并悬浮细胞，用细胞粘附性的6孔板(Corning公司制)开始悬浮培养(步骤(3)开始)。以使得每1孔1.5mL的大鼠StemlineII培养基中为2×10

进一步地对于一部分细胞，在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(3)开始起第2天)添加1mL的大鼠StemlineII培养基，继续进行培养。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第12天(从步骤(3)开始起第4天)，用与上述回收方法相同的方法，回收细胞群体。观察得到的细胞球团，结果显示非常深的红色(图9)。

＜通过免疫染色的细胞群体的评价＞

对从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天、第10天以及第12天得到的细胞群体进行免疫染色，调查了胚胎型成红细胞的比例。免疫染色以与实施例1相同的方法进行。分别地，一次抗体应用了作为胚胎型成红细胞标记物的抗ε-珠蛋白(HBE1)抗体(Genetex公司制，稀释率750倍)，作为荧光标记二次抗体应用了Alexa488标记的驴抗兔抗体(Thermo FisherScientific公司制，稀释率1000倍)。在染色的细胞的观察以及图像的取得中，应用了正立荧光显微镜Axio Imager M2(Carl Zeiss公司制)以及所附软件Axio Vision。

染色结果在图10中示出。从悬浮培养(步骤(1))开始起第8天得到的细胞之中约80％以上是ε-珠蛋白阳性(图10的A以及B)。显示通过本发明涉及的制备方法能够从大鼠ES细胞制备包含较多胚胎型成红细胞的细胞群体。另外，从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天以及第12天得到的细胞群体也有约80％以上是ε-珠蛋白阳性(图10的C～F)。可知通过本发明涉及的制备方法，继续进行细胞群体的培养后，胚胎型成红细胞的比例也保持较高。

＜通过实时PCR的细胞群体的评价＞

求得在从上述悬浮培养(步骤(1))开始起第10天以及第12天的细胞群体中的、细胞表达的β珠蛋白基因家族的表达比例。实时PCR以与实施例1相同的方法进行。对Taqman探针而言，应用了表2中记载的大鼠的探针。

用包含针对ε-珠蛋白、γ-珠蛋白以及β-珠蛋白的各β珠蛋白基因家族的TaqMan探针的目标序列的基因产物，制成标准曲线，对表达的各β珠蛋白基因家族的mRNA拷贝数进行定量。将各β珠蛋白基因家族的拷贝数除以总β珠蛋白基因家族的拷贝数，得到的值显示为各β珠蛋白基因家族的表达比例。包含胚胎型成红细胞的细胞群体的制备与通过实时PCR的分析独立地进行3次，求出其平均值与标准误差。

结果在表4中示出。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天以及第12天的任一细胞群体中，细胞表达的总β珠蛋白基因家族之中约60％以上是胚胎型成红细胞标记物ε-珠蛋白基因。显示通过本发明涉及的制备方法能够从大鼠ES细胞制备高表达ε-珠蛋白的细胞群体。另外，可知通过本发明涉及的制备方法在继续进行细胞群体的培养后，也可以得到保持ε-珠蛋白的表达较高的细胞群体。另外，进行了3次的独立实验，其标准误差也十分小，可以说本发明的制备方法是再现性高的方法。

[表4]

来自大鼠ES细胞的成红细胞中β珠蛋白基因家族的相对表达量(％)

[参考例1：K562细胞的培养与分化阶段的评价]

作为其它的血液谱系细胞，应用了来自人慢性骨髓性白血病的细胞株K562细胞(从Health Science Research Resources Bank得到)研究了ε-珠蛋白的表达。K562细胞如下进行了维持培养。用添加了10％FBS(Corning公司制)、以及1％青霉素-链霉素(SigmaAldrich公司制)的RPMI培养基(Roswell Park Memorial Institute 1640，Thermo FisherScientific公司制)(下文称为“K562培养基”)，在低粘附6cm培养皿(住友Bakelite株式会社制)上悬浮培养。每7天一次回收包含悬浮细胞的培养基，用离心机(日立工机公司制，SCT5BA)以1000rpm离心5分钟，除去上清液。以每1个培养皿5×10

已知在加入诱导因子(丁酸钠)时，K562细胞的ε-珠蛋白的表达升高。因此，研究了从加入丁酸钠起的ε-珠蛋白的随时间表达变化。在K562细胞的分化培养中，应用了包含1mM丁酸钠(Sigma Aldrich公司制)的K562培养基。以使得每1个低粘附6cm培养皿为5×10

与实施例1的通过实时PCR的评价方法同样地，求得细胞表达的各β珠蛋白基因家族的表达比例。结果在表5中示出。在任一条件下，在表达的β珠蛋白基因家族之中，约30％以下为胚胎型成红细胞标记物ε-珠蛋白基因。

[表5]

K562细胞中β珠蛋白基因家族的相对表达量(％)

[参考例2：REL细胞的培养与分化阶段的评价]

作为其它的血液谱系细胞，应用了大鼠红白血病细胞REL细胞(从Institute ofMolecular Genetics and Genetic Engineering(Prof.Popovic Serbia)得到)，研究了ε-珠蛋白表达变化。REL细胞如下进行维持培养。应用了添加了40％FBS(Corning公司制)以及1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich公司制)的RPMI培养基(Roswell Park MemorialInstitute 1640，Thermo Fisher Scientific公司制)(下文称为“REL培养基”)，在低粘附6cm培养皿(住友Bakelite株式会社制)上悬浮培养。2天一次回收包含悬浮细胞的培养基，用离心机(日立工机公司制，SCT5BA)以1000rpm离心5分钟，除去上清液。以使得每1个培养皿为5×10

向REL细胞添加诱导因子(Hexamethylene bisacetamide：HMBA)，研究了ε-珠蛋白的随时间的表达变化。在REL细胞的分化培养中，应用在REL培养基中添加了HMBA(SigmaAldrich公司制，终浓度1mM)的培养基。以每1个低粘附6cm培养皿(住友Bakelite株式会社制)REL细胞为5×10

与实施例1的通过实时PCR的评价方法同样，求得细胞表达的各β珠蛋白基因家族的表达比例。结果在表6中示出。在任一条件下，在表达的β珠蛋白基因家族之中，几乎全部为成体型成红细胞标记物β-珠蛋白基因。

[表6]

REL细胞中β珠蛋白基因家族的相对表达量(％)

[实施例3：应用从人iPS细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验]

按照图11中示出的顺序，进行应用了从人iPS细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验。通过与实施例1同样的方法分化诱导人iPS细胞，得到从悬浮培养(步骤(A))开始起第10天的包含胚胎型成红细胞的细胞群体(步骤(A)以及步骤(B))。用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm离心5分钟，除去上清液。随后，在沉淀中添加Stemdiff+B培养基并悬浮细胞，在细胞粘附性的6孔板(Corning公司制)中以使得每1孔1.5mL的培养基中为2×10

在从悬浮培养(从步骤(A))开始起第18天(从步骤(C)的开始起第8天)，从6孔板回收包含细胞群体的培养基。取0.4×10

测定结果在图12中示出。血红素浓度以及PPIX浓度显示为对于每10

[实施例4：应用从大鼠ES细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验]

按照图13示出的顺序，进行了应用从大鼠ES细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体的化合物试验。通过与实施例2同样的方法分化诱导了大鼠ES细胞，得到从悬浮培养(步骤(A))开始起第8天的包含胚胎型成红细胞的细胞群体(步骤(A)以及步骤(B))。用离心机(日立工机公司制，CF8DL)以1000rpm离心5分钟，除去上清液。随后，在沉淀中添加大鼠StemlineII培养基并悬浮细胞，在细胞粘附性的6孔板(Corning公司制)中，接种以使得每1孔1.5mL的培养基中为2×10

在从悬浮培养(步骤(A))开始起第12天(从步骤(C)开始起第4天)，从6孔板回收包含细胞群体的培养基。取0.35×10

血红素浓度的测定结果在图14中示出。血红素浓度显示为对于每10

另外，根据实施例3和实施例4的结果可知，将来自人的多潜能干细胞的胚胎型成红细胞、与来自大鼠的多潜能干细胞的胚胎型成红细胞进行比较，结果在人与大鼠中几乎相同程度地受到DHA引起的血红素合成抑制的作用。

[实施例5：从人iPS细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体]

应用与实施例1不同的人iPS细胞株制备了包含胚胎型成红细胞的细胞群体。

＜维持培养＞

人iPS细胞(201B7株)从京都大学得到。以与实施例1中记载的人iPS细胞的维持培养方法同样的方法维持培养了人iPS细胞(201B7株)。

＜步骤(1)～步骤(3)＞

通过与实施例1同样的方法进行了人iPS细胞(201B7株)的分化诱导。将从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天(步骤(2a)开始后立即)的细胞聚集体的明场观察图像示于图15的A中。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)，观察了培养基中悬浮的细胞群体(图15的B)。

在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)、从悬浮培养(步骤(1))开始起第14天(从步骤(3)开始起第4天)、以及从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天(从步骤(3)开始起第8天)，回收了包含悬浮的细胞群体的培养基，除去上清液并回收细胞群体。观察从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天的细胞球团，结果显示了非常深的红色(图16)。

＜通过免疫染色的细胞群体的评价＞

对从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天得到的细胞群体进行免疫染色，调查了胚胎型成红细胞的比例。免疫染色以与实施例1相同的方法进行。

染色结果图像在图17中示出。从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天得到的细胞之中，约80％以上是ε-珠蛋白阳性且血型糖蛋白A阳性(图17的A、B、G以及H)。显示通过本发明涉及的制备方法能够从各种人iPS细胞株制备包含较多胚胎型成红细胞的细胞群体。另外，从悬浮培养(步骤(1))开始起第14天以及第18天得到的细胞群体也有约80％以上为ε-珠蛋白阳性且血型糖蛋白A阳性(图17的C、D、I及J，以及E、F、K及L)。可知通过本发明涉及的制备方法，继续进行细胞群体的培养后，也可以维持细胞群体中的胚胎型成红细胞的比例较高。

＜通过实时PCR的细胞群体的评价＞

在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的细胞群体中，通过实时PCR研究了细胞表达的β珠蛋白基因家族的表达比例。实时PCR以与实施例1相同的方法进行。对Taqman探针而言，应用了表2中记载的人的探针。

用包含针对ε-珠蛋白、γ-珠蛋白以及β-珠蛋白的各β珠蛋白基因家族的TaqMan探针的目标序列的基因产物，制成标准曲线，对表达的各β珠蛋白基因家族的mRNA拷贝数定量。将各β珠蛋白基因家族的拷贝数除以总β珠蛋白基因家族的拷贝数得到的值显示为各β珠蛋白基因家族的表达比例。

结果在表7中示出。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的任一细胞群体中，细胞表达的总β珠蛋白基因家族之中约60％以上为胚胎型成红细胞标记物ε-珠蛋白基因。显示通过本发明涉及的制备方法能够从各种人iPS细胞株制备高表达ε-珠蛋白的细胞群体。另外，可知通过本发明涉及的制备方法，在继续进行细胞群体的培养后，ε-珠蛋白的表达也保持较高。

[表7]

来自人iPS细胞(201B7株)的成红细胞中β珠蛋白基因家族的相对表达量(％)

[实施例6：从人ES细胞制备的包含胚胎型成红细胞的细胞群体]

＜维持培养＞

人ES细胞(KhES-1株)从京都大学得到。以与实施例1中记载的人iPS细胞的维持培养方法相同的方法维持培养了人ES细胞。

＜步骤(1)～步骤(3)＞

通过与实施例1相同的方法进行了人ES细胞的分化诱导。从悬浮培养(步骤(1))开始起第3天(步骤(2a)开始后立即)的细胞聚集体的明场观察图像示于图18的A。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)，观察了培养基中悬浮的细胞群体(图18的B)。

在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天(从步骤(2a)开始起第7天)、从悬浮培养(步骤(1))开始起第14天(从步骤(3)开始起第4天)、以及从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天(从步骤(3)开始起第8天)，回收包含悬浮的细胞群体的培养基，除去上清液并回收细胞群体。观察从悬浮培养(步骤(1))开始起第18天的细胞球团，结果显示非常深的红色(图19)。

＜通过免疫染色的细胞群体的评价＞

对从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天得到的细胞群体进行免疫染色，调查了胚胎型成红细胞的比例。免疫染色以与实施例1相同的方法进行。

染色结果图像在图20中示出。从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天得到的细胞之中，约80％以上是ε-珠蛋白阳性且血型糖蛋白A阳性(图20的A、B、G以及H)。显示通过本发明涉及的制备方法能够从人ES细胞制备包含较多胚胎型成红细胞的细胞群体。另外，从悬浮培养(步骤(1))开始起第14天以及第18天得到的细胞群体也有约80％以上为ε-珠蛋白阳性且血型糖蛋白A阳性(图20的C、D、I及J，以及E、F、K及L)。可知通过本发明涉及的制备方法，继续进行细胞群体的培养后，也可以维持细胞群体中的胚胎型成红细胞的比例较高。

＜通过实时PCR的细胞群体的评价＞

在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的细胞群体中，通过实时PCR研究了细胞表达的β珠蛋白基因家族的表达比例。实时PCR以与实施例1相同的方法进行。对Taqman探针而言，应用了表2中记载的人的探针。

用包含针对ε-珠蛋白、γ-珠蛋白以及β-珠蛋白的各β珠蛋白基因家族的TaqMan探针的目标序列的基因产物，制成标准曲线，对表达的各β珠蛋白基因家族的mRNA拷贝数定量。将各β珠蛋白基因家族的拷贝数除以总β珠蛋白基因家族的拷贝数，得到的值显示为各β珠蛋白基因家族的表达比例。

结果在表8中示出。在从悬浮培养(步骤(1))开始起第10天、第14天以及第18天的任一细胞群体中，细胞表达的总β珠蛋白基因家族之中约60％以上为胚胎型成红细胞标记物ε-珠蛋白基因。显示通过本发明涉及的制备方法能够从人ES细胞制备高表达ε-珠蛋白的细胞群体。另外，可知通过本发明涉及的制备方法，在继续进行细胞群体的培养后，ε-珠蛋白的表达也保持较高。由于应用1株人ES细胞与2株人iPS细胞总计3种株的人多潜能干细胞，也能够制备以高比例包含胚胎型成红细胞的细胞群体，因此可以说本发明的制备方法是再现性高的方法。

[表8]

来自人ES细胞(KhES-1株)的成红细胞中β珠蛋白基因家族的相对表达量(％)