用于治疗肥胖和体重管理的GLP-1组合物

摘要

本文公开了含有重组人GLP‑1肽的药物组合物及其用途。人GLP‑1肽和药物组合物可用于预防或治疗肥胖、贪食和/或超重。其他相关用途包括体重管理(例如诱导体重减轻)，延缓胃排空和增加饱腹感等。

说明书

本申请是2018年3月9日提交的名称为“用于治疗肥胖和体重管理的GLP-1组合物”，申请号为201810198521.0的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本公开涉及使用含有各种剂量的人重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)肠胃外水溶药物组合物用于治疗肥胖、体重管理和其它病症的用途。

背景技术

GLP-1作用于分布在全身的GLP-1受体，尤其作用于分泌胰岛素的胰β细胞。这种激素可以促进胰岛素分泌，并且独立地刺激胰岛素信号，从而引起血糖下降。GLP-1的不稳定性大致包括物理和化学两个方面。物理不稳定性包括变性、表面吸附、聚集、沉淀和凝胶化等，化学不稳定性包括水解、脱氨基、氧化、外消旋化、异构化、β-消除和二硫键交换等。不稳定性不仅缩短了保质期，而且还影响了GLP-1组合物的功效。为了解决不稳定性问题，可使用纳米颗粒递送GLP-1或修饰GLP-1以提高稳定性。然而，纳米颗粒递送提高了生产成本和制剂复杂性，并且GLP-1的修饰常常会造成毒性的增强。见Lee，BasicClin.Pharmacol.Toxicol.118(3)：173-180(2016).

因此，非常需要含有天然的未修饰的GLP-1的组合物，其稳定性增强，并在低剂量下功效改善。本文公开的技术和方法满足了本领域的这种需要。

发明内容

一方面，本公开提供了一种通过向患有肥胖或超重的受试者施用治疗有效量的组合物治疗肥胖或超重的方法，所述组合物包含GLP-1肽(例如GLP-1(7-36)，GLP-1(7-35)或GLP-1(7-37))，所述GLP-1肽治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重，或者约0.11mg/天至约0.66mg/天(例如，在人受试者中)。在一些实施方案中，GLP-1肽是人重组GLP-1肽。在一些实施方案中，包含GLP-1肽的组合物(GLP-1组合物)通过肠胃外注射施用。在一些实施方案中，通过静脉内注射，肌内注射或皮下注射来施用GLP-1组合物。在一些实施方案中，GLP-1组合物施用时间长达1年，长达2年，长达3年，长达4年，长达5年，长达6年，长达7年，长达8年，长达9年，长达10年，长达11年，长达12年，长达13年，长达14年，长达15年，长达16年，长达17年，长达18年，长达19年，长达20年，长达21年，长达22年，长达23年，长达24年，长达25年，长达26年，长达27年，长达28年，长达29年，长达30年，或长达31年，可以连续不断或不定期给药。

在一些实施方案中，用于治疗雌性受试者肥胖或超重的GLP-1组合物治疗有效量低于雄性受试者。在一些实施方案中，在雌性受试者治疗肥胖或超重的GLP-1的治疗有效量至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，或至少70％低于雄性受试者治疗肥胖或超重的治疗有效量时，仍可达到相同或相似的治疗效果。在一些实施方案中，用于治疗雌性受试者肥胖或超重的GLP-1治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重，或每天约0.11mg至约0.66mg(例如，在人受试者中)。在一些实施方案中，用于治疗雄性受试者肥胖或超重的GLP-1的治疗有效量为约30μg/kg体重至约60μg/kg体重，或每天约0.33mg至约0.66mg(例如，在人受试者中)。

另一方面，本公开了涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的组合物，其包含GLP-1(7-36)，优选人重组GLP-1(7-36)，来管理体重的方法，GLP-1组合物的治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重，或约0.11mg/天至约0.66mg/天。在一些实施方案中，通过胃肠外注射施用GLP-1组合物。在一些实施方案中，通过静脉内注射，肌内注射或皮下注射来施用GLP-1组合物。在一些实施方案中，GLP-1组合物长时间施用长达1年，长达2年，长达3年，长达4年，长达5年，长达6年，长达7年，长达8年，长达9年，长达10年，长达11年，长达12年，长达13年，长达14年，长达15年，长达16年，长达17年，长达18年，长达19年，长达20年，长达21年，长达22年，长达23年，长达24年，长达25年，长达26年，长达27年，长达28年，长达29年，长达30年，或长达31年，可以连续不断或不定期给药。在一些实施方案中，不接受GLP-1组合物的受试者体重减少小于GLP-1组合物的受试者的体重减小的100％，小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，或小于75％。在一些实施方案中，用于体重管理的GLP-1在雌性受试者中的治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重。在一些实施方案中，用于体重管理的GLP-1在雄性受试者中的治疗有效量为约30μg/kg体重至约60μg/kg体重。

附图说明

图1显示与溶剂对照和利拉鲁肽相比，接受各种剂量贝那鲁肽的雄性和雌性大鼠的胃碳末残留率。

图2显示了与溶剂对照和利拉鲁肽相比，接受各种剂量的贝那鲁肽的雄性和雌性大鼠小肠碳末推进率。

图3显示了治疗食蟹猴肥胖症的实验设计。四种饮食诱导的肥胖食蟹猴分为两个治疗组，每组有一只雄性猴和一只雌性猴。在研究的第1周，测量每只动物的食物摄取量、体重、BMI和身体组成，并将其记录为基线指数。在治疗期间(第2周至第7周)，第1组动物在开始3周(第2周至第4周)皮下施用溶剂对照，并在随后三周(第5周至第7周)皮下施用贝那鲁肽。第2组动物在头3周(第2周至第4周)皮下施用贝那鲁肽，并在随后三周(第5周至第7周)施用溶剂对照。两组均于第8周停止给予贝那鲁肽或溶剂对照。对第4、7和8周的食物摄取量、体重、体重指数、身体组成和基线水平进行比较，评估贝那鲁肽治疗的疗效和可逆性。

图4A-4C显示贝那鲁肽治疗减少了肥胖食蟹猴的食物摄入量。图4A显示了第1组每只食蟹猴的每日卡路里摄入量。图4B显示了第2组每只食蟹猴的每日卡路里摄入量。图4C显示了贝那鲁肽治疗前后每只动物的平均每周食物摄入量。治疗前：第1组，第1周至第4周，第2组，第1周；治疗期间：第1组，第5周至第7周，第2组，第2周至第4周。在治疗期间，每只动物的平均每周食物摄入量显著降低。

图5A-5B显示了肥胖食蟹猴体重的减少。图5A显示了8周研究期间每只动物体重变化的百分比。贝那鲁肽治疗显示为实线，溶剂对照用虚线表示。图5B显示了贝那鲁肽治疗前后每只动物的体重。所有动物组均在贝那鲁肽治疗后显示出显著的体重减轻(n＝4)。

图6A-6C显示了贝那鲁肽与格列吡嗪或二甲双胍联用对受试者的效果。图6A显示了5A试验各组治疗第12周体重指数变化。图6B显示了5B试验各组治疗第2-12周体重指数变化(每个剂量组各有四组数据，从左到右分别显示第2周，第4周，第8周和第12周的体重指数)。图6C显示了5C试验中超重及肥胖患者试验期间体重的历时性变化折线图。

图7显示与溶剂对照相比，接受从10μg/kg体重至60μg/kg体重不同剂量的贝那鲁肽雄性和雌性大鼠的胃碳末残留率。

图8显示了与溶剂对照相比，施用从10μg/kg体重至60μg/kg体重不同剂量的贝那鲁肽的雄性和雌性大鼠的小肠中碳末的推进率。

图9显示了在15周的时间内，高脂肪饮食和低脂肪饮食的小鼠体重变化。

图10显示了在15周的时间内高脂肪饮食和低脂肪饮食的小鼠的食物摄取情况。

图11显示了在特殊饮食结束时腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)的结果，以确认是否成功诱导胰岛素抵抗超重和肥胖。

图12A显示了与溶剂对照相比，雄性DIO小鼠胃碳末残留率，其接受从15μg/kg体重至100μg/kg体重不同剂量的贝那鲁肽。图12B显示了与溶剂对照相比，接受从15μg/kg体重至100μg/kg体重不同剂量贝那鲁肽的雄性DIO小鼠小肠碳末推进率。*P＜0.05，**P＜0.1。

具体实施例

在显著较低的剂量下，本文所述的GLP-1组合物在治疗超重和肥胖时出乎意料地显示了与利拉鲁肽组合物显著不同的药代动力学。此外，雌性受试者的GLP-1组合物的治疗有效量显著低于实现相同或相似治疗效果的雄性受试者的GLP-1组合物的治疗有效量。

自1948年以来，世界卫生组织(WHO)将肥胖列为疾病。自1980年以来，世界范围内的肥胖发病率已经翻了一倍多。Ng et al.，Lancet.384：766-781(2014)超重或肥胖被描述为由于长期能量摄入超过能量消耗而造成的身体脂肪的异常或过度积累。超重和肥胖是非传染性疾病如心血管疾病、2型糖尿病(T2DM)、骨骼肌异常和某些癌症的重要危险因素。VanBloemendaal et al.，J..Endocrinol.221：T1-T16(2014)。这些与超重或肥胖相关的疾病和病症是公共医疗保健的重大经济负担。

天然形式的GLP-1由肠道L细胞饭后分泌，强效促进胰岛素分泌。GLP-1是2型糖尿病的潜在疗法。Holst，Physiol.Rev.87：1409-1439(2007)。GLP-1具有GLP-1(7-36)-NH2和GLP-1(7-37)两种活性形式。在进入体循环后，GLP-1被二肽基肽酶-4(DPP4)快速降解，半衰期仅有短短2分钟。Kieffer et al.，Endocrinology 136：3585-3596(1995).除了控制血糖外，GLP-1及其类似物已发现具有诱导体重减轻，减缓胃排空和增加饱腹感的作用。Monamiet al.，Exp.Diabetes Res.2012：672658(2012)。FDA于2014年12月批准了Saxenda(利拉鲁肽3mg)，这是GLP-1类似物第一项用于长期体重管理的NDA申请，辅以低热量饮食以及增加运动量，治疗对象为至少患有一种与超重相关疾病或病症的肥胖成年人，例如2型糖尿病肥胖。

在本公开的上下文中，本文所用的包含GLP-1的药物组合物的“治疗有效量”或“有效量”是指在受试者中产生所需治疗效果的药物组合物的量，例如治疗肥胖或超重，体重管理，引起体重减轻等。在某些实施方案中，治疗有效量是产生最大治疗效果的药物组合物的量。在其它实施方案中，治疗有效量是产生小于最大治疗效果的药物组合物的量。例如，治疗有效量可以是产生治疗效果的量，同时避免与产生最大治疗效果的剂量相关的一种或多种副作用。在一些实施方案中，治疗有效量是产生治疗效果的最小量。特定组合物的治疗有效量将基于多种因素而变化，包括但不限于治疗组合物的特征(例如，活性、药代动力学、药效学和生物利用度)，受试者的生理状况(例如，年龄、体重、性别、疾病类型和阶段、病史、一般身体状况，对给定剂量的反应和其他现有药物)，组合物中任何药学上可接受的载体、赋形剂和防腐剂的性质以及给药途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验来确定治疗有效量，即通过监测受试者对药物组合物施用的反应并相应地调整剂量。有关其他指导，请参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，22

在一些实施方案中，包含本文公开的GLP-1的药物组合物治疗有效量在约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1的范围内，或约0.11mg/天至约0.66mg/天的GLP-1(例如，在人受试者中)。在一些实施方案中，药物组合物治疗有效量包含本文公开的雄性受试者接受的从约30μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1剂量，或从约0.33mg/天至约0.66mg/天的剂量(例如，在人受试者中)。在一些实施方案中，药物组合物治疗有效量包含本文公开的雌性受试者接受的从约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1剂量，或从约0.11mg/天至约0.66mg/天的剂量(例如，在人受试者中)。

本文所用的关于病症的术语“治疗”是指部分或全部缓解病症，防止病症发生或复发的可能性，减缓疾病的进展或发展，或消除、减少或减缓与病症相关的一种或多种症状的发展。

本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物受试者，优选人。“有需要的受试者”是指被诊断患有肥胖或超重，有体重增加风险或希望控制体重增加或减轻体重的受试者。术语“受试者”和“患者”可以在本文中互换使用。

本文所用的关于组合物或方法的术语“包含”意指组合物或方法至少包括所述的元素。术语“主要由...组成”是指组合物或方法包括所列举的元素，并且还可以包括不会实质上影响组合物或方法的新颖性和基本特征的一种或多种另外的元素。例如，基本上由所列举的元素组成的组合物可以包括那些列举的元素加上来自分离和纯化方法的一种或多种微量污染物，药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。术语“由...组成”是指组合物或方法仅包括所述元素。由各种过渡词定义的实施方案都在本发明的范围内。

包含GLP-1的药物组合物

在一些实施方案中，本文公开的GLP-1组合物包含具有以下序列的重组人GLP-1(7-36)肽：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va1-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO：1)，例如，在本文中提到的贝那鲁肽。贝那鲁肽分子式为C

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(SEQ ID NO：2)，以及

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO：3)。

在使用猴模型的临床药代动力学研究中，贝那鲁肽在皮下给药时，其半衰期约为15-30分钟。中国进行的治疗糖尿病的临床试验III期显示，与113例对照组患者相比，346例接受贝那鲁肽(0.2mg，TID)治疗12周的糖尿病患者体重明显减轻，血糖水平也降低了。这些患者最常见的副作用是恶心和呕吐，但是这些副作用是暂时的，且并不会比其他类似的GLP-1类似物治疗产生的副作用更严重。

贝那鲁肽可以被大肠杆菌表达后分离，随后配制成可注射制剂。在本文公开的药物组合物中，GLP-1肽的浓度为约0.1至约20mg/mL，约0.2至约10mg/mL，约0.05至约0.5mg/mL，约0.5至约5mg/mL，约1至约5mg/mL，或约2至约4mg/mL。除非另有规定，否则“约”是指±10％范围内的规定数值差。例如，在本公开的制剂中，GLP-1浓度高达2mg/mL，并且可以在2-8℃下黑暗中储存约2年。

本文公开的药物组合物的pH值为约3.5至约5.0，约3.5至约4.5，约3.6至约4.2，约3.6至约4.1，约3.6至约4.0，或约3.6至约3.9。在该pH范围内，GLP-1组合物的稳定性提高，并且组合物可以在2至8℃下在黑暗中储存约2年或更长时间。

本文公开的GLP-1组合物可以含有一种或多种缓冲盐，以保持组合物的所需pH范围，包括乙酸钠、乙酸等。GLP-1组合物的另外的成分可以包括一种或多种防腐剂(例如酚类等)，等渗剂(例如甘露醇，丙二醇等)和促溶剂(例如丙二醇等)。

在一些实施方案中，可以通过皮下注射来向患有超重或肥胖症的患者施用贝那鲁肽，以减轻体重。也可以使用其他合适的注射方式。通过实施例证明了贝那鲁肽对控制或减轻体重的作用。

GLP-1组合物的预防和/或治疗用途

本文公开了GLP-1的药物组合物用于治疗或预防各种病症(包括肥胖，贪食和/或超重)的用途。本公开还涉及包含GLP-1的药物组合物用于体重管理，减缓胃排空和/或改善饱腹感的用途。

根据疾病控制和预防中心(CDC)和世界卫生组织(WHO)发布的标准，BMI低于18.5表示体重不足，BMI处于18.5和24.9之间的表示正常或健康体重，BMI在25.0和29.9之间表示超重，30.0以上的BMI表示肥胖。

治疗肥胖

一方面，本文提供了一种治疗肥胖症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含GLP-1的药物组合物，治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1，或约0.11mg/天至约0.66mg/天的GLP-1(例如，在人受试者中)。

治疗贪食症

一方面，本文提供了一种治疗贪食症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含GLP-1的药物组合物，治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1，或约0.11mg/天至约0.66mg/天的GLP-1(例如，在人受试者中)。

体重管理

在另一方面，本文提供了一种管理受试者体重的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含GLP-1的药物组合物，使得体重指数(BMI)降低至少0.5％，至少1％，至少2％，或至少3％，治疗有效量为约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1，或约0.11mg/天至约0.66mg/天的GLP-1剂量(例如，在人受试者中)。可选择地，本文提供了一种管理受试者体重的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含GLP-1的药物组合物，使得体重降低至少2％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，或至少50％，治疗有效量在约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1的范围内，或约0.11mg/天至约0.66mg/天的GLP-1(例如，在人受试者中)。

在一些实施例中，体重管理包括引起体重减轻。在一些实施方案中，不接受GLP-1组合物的受试者的体重减少小于GLP-1组合物的受试者的体重减小的100％，小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，小于80％，小于75％。

延缓胃排空

另一方面，本文提供的是减缓胃排空的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含GLP-1的药物组合物，治疗有效量在约10μg/kg体重至约60μg/kg体重的活性成分GLP-1，或约0.11mg/天至约0.66mg/天的GLP-1(例如，在人受试者中)。

GLP-1的用量

GLP-1组合物的剂量显著低于含有利拉鲁肽的药物组合物的情况下，本文公开的各种条件可达到和其相同或相似的治疗效果。此外，在雌性受试者中引起治疗效果的GLP-1的最小剂量显著低于在男性受试者中引起相同或相似治疗效果的GLP-1的最小剂量。在一些实施方案中，雌性受试者的GLP-1的最小剂量为用于雄性受试者达到相同或相似的治疗效果的GLP-1最小剂量的约95％，约90％，约85％，约80％，约75％，约70％，约65％，约60％，约55％，约50％，约45％，约40％，约35％，约30％，或约25％。通常，人的剂量为约1/12的小鼠剂量，大约1/6的大鼠剂量，或约1/3的猴剂量。在一些实施方案中，本文提供了包含每天一次0.1mg-0.4mg GLP-1剂量的产品。

本文提供以下实施例以更好地说明实施例，并且不应被解释为这会限制任何要求保护的范围。至于所涉及的特定材料，仅仅是为了说明目的，并不意图限制本发明。本领域技术人员可以在不需创造能力的情况下开发等同的方法或反应物，而不脱离本发明的范围。本发明人意在将这些变化包括在本发明的范围内。

实施例1

本实施例旨在说明贝那鲁肽注射剂对减缓胃排空的作用。2.1毫升贝那鲁肽注射剂含有4.2mg(42，000U)如SEQ ID NO：1所示的贝那鲁肽。

五十只体重为248g至308g(雄性)或184g至218g(雌性)的八周龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠进行适应性喂养7天，每只称重，然后分为如下五组：溶剂对照组，低剂量贝那鲁肽组(15μg/kg)，中剂量贝那鲁肽组(30μg/kg)，高剂量贝那鲁肽组(60μg/kg)和利拉鲁肽对照组(270μg/kg)。每组10只，一半雄性，一半雌性。大鼠的尾巴标记如下：

剂量选择是基于人体剂量计算的。临床人体剂量估计为约0.4mg/次注射，母大注射一次，根据体表面积计算后，相当于36μg/kg大鼠剂量。因此，以中等剂量的30μg/kg，中等剂量50％的低剂量和中等剂量200％的高剂量来测试大鼠。用于治疗肥胖症的利拉鲁肽人临床剂量为3.0mg/注射，每天注射一次，相当于基于体表面积计算的270μg/kg大鼠剂量。

贝那鲁肽注射剂由上海仁会生物制药股份有限公司(以下简称“仁会生物”)提供，其为2.1毫升无色透明液体，含有4.2毫克(42，000U)贝那鲁肽。贝那鲁肽注射剂于黑暗中2-8℃保存。溶剂对照是贝那鲁肽注射剂的临床安慰剂，为无色透明液体，也由仁会生物提供，储存于2-8℃。阳性对照是利拉鲁肽注射剂，储存在黑暗密封的条件下。大鼠由上海中医药大学实验动物中心养殖并保存。

在实验时制备注射制剂并稀释如下：

大鼠禁食16小时，只提供水。在分组之前，称重大鼠并记录体重(笼编号和尾标)。根据体重，将大鼠随机分为5组，每组10只，一半雄，一半雌。分组后，大鼠标记如表1所示。

基于其体重，大鼠皮下注射适量的贝那鲁肽或利拉鲁肽。雌性大鼠继雄性大鼠后，按照它们组数的顺序注射：101，201，301，401，501，102，202，302，402和502等。术者提起大鼠背部皮肤，注射器刺入皮下注药。拔针时，左手捏住针刺部位，防止药液外漏。注入药量为0.1mL/100g体重。

皮下注射药物5min后，使用5％炭末混悬液(2％羧甲基纤维素溶液)1.5mL/100g体重进行灌胃。15min后处死大鼠，立即剖开腹腔，迅速开腹结扎胃的贲门口及幽门口。取胃用滤纸拭干后称定全胃质量。洗去胃内容物后拭干，称定胃净质量。分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，置托盘上，将小肠自然拉直铺平，分别测量从幽门括约肌至炭末混悬液前端及至大肠末端的长度。

·碳末在肠内推进距离(cm)＝幽门至碳末前沿；

·所灌炭末混悬液质量＝炭末混悬液浓度×体积；

·碳末推进率(％)＝碳末在肠内推进距离(cm)/肠管全长(cm)×100％；

·胃残留率(％)＝(胃全重-胃净重)/所灌炭末混悬液质量×100％

如表3和表4以及图1和图2所示，和溶剂对照组相比，给予高剂量贝那鲁肽的雄性大鼠组和施用低剂量、中剂量和高剂量贝那鲁肽的雌性大鼠组胃残留率更高，且这些贝那鲁肽组与对照组差异有统计学意义。和溶剂对照组相比，施用中等剂量和高剂量贝那鲁肽的雄性大鼠组和施用低剂量、中剂量和高剂量贝那鲁肽的雌性大鼠组碳末推进率较低，且这些贝那鲁肽组与对照组的差异有统计学意义。尽管利拉鲁肽对胃排空和碳末推进率都有一定程度的抑制，但是该利拉鲁肽组和对照组之间的差异无统计学意义。因此，贝那鲁肽可以有效减缓大鼠的胃排空，而利拉鲁肽不能。

注：与安慰剂组相比*P＜0.05，**P＜0.01。

注：与安慰剂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例2

本实施例旨在说明贝那鲁肽对GLP-1受体信号通路的活化作用。

GLP-1受体属于G蛋白偶联受体家族，并有七个跨膜结构域。实验运用胞内钙离子的荧光检测方法，在稳定表达GLP-1受体的CHO-K1细胞上分析贝那鲁肽和阳性对照GLP-1(7-36)-NH

实施例3

本实施例旨在说明贝那鲁肽对正常血糖和糖尿病模型动物中血糖水平的影响。

贝那鲁肽降低了由葡萄糖引起的具有正常升糖指数的小鼠和家兔的高血糖，也使四氧嘧啶和链脲霉素引起具有正常升糖指数的小鼠和大鼠的血糖升高明显降低，表明贝那鲁肽具有明显降低血糖的作用。实验所用动物均有正常的升糖指数，在糖负荷正常动物的血糖降低时，胰岛素明显增加，且有很明显的对应关系。但对于正常血糖的动物，贝那鲁肽既不降低血糖，也不增加血中胰岛素，这说明贝那鲁肽促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖浓度。

实施例4

本实施例旨在说明贝那鲁肽对饮食诱导的肥胖食蟹猴体重减轻的作用。

通过对饮食诱导肥胖(DIO)食蟹猴进行贝那鲁肽注射液皮下注射给药，连续三周，每天两次或三次，来评价其对于抑制饮食量和减重的有效性，以及在给药结束后的恢复期的减肥效果的持续性和可逆性。

本研究中使用了两只雄性(10.5-11.5kg)和两只雌性(6.0-6.5kg))肥胖食蟹猴，年龄在14-19岁之间，BMI大于40kg/m

该实验包括三个阶段：基线周期(第1周)，治疗周期(第2-7周)，恢复期(第8周)。在适应性饲养猴子至少30天之后，在第一基线期的第7天确定每只动物的体重、BMI和身体成分。这几项评价指标将作为贝那鲁肽有效性评价实验的基线数据。

在治疗周期(第2-7周)，第1组猴在第二至第四周每天三次皮下注射溶剂对照品，第五至第七周每天两次注射贝那鲁肽。第2组猴在第二至第四周每天三次皮下注射贝那鲁肽，第五至第七周每天两次注射溶剂对照品。为了提高动物对于贝那鲁肽的耐受性和找到动物对于该药物的最大耐受量，在研究中按照梯度调升药物剂量。第2组动物在第二周每天注射剂量为10μg/kg/次，每天三次；第三周每天注射剂量为20μg/kg/次，每天三次；第四周每天注射剂量为40μg/kg/次，每天三次。如表6所示，由于观察到严重的厌食反应，在第4周的剩余4天内，每次的剂量降至20μg/kg。

第1组动物在第5至7周的注射剂量将根据第2组动物在第2至4周注射时获得的注射剂量探索结果来确定。组1动物在第5周每天施用两次10μg/kg的剂量，在第6周每天施用两次20μg/kg的剂量，在第7周每天施用两次20μg/kg的剂量(与第6周相同剂量)。在6周的治疗期间，每周结束时测量每只动物的体重和坐高。第4周和第7周测量身体脂肪含量。第8周不给药。

在研究的八周内，记录每只动物每餐的摄食量。在第4周和第7周，通过与基线水平进行比较，对第1组贝那鲁肽对食物摄取、体重和BMI的影响进行评估。通过第1周和第4周基线水平进行比较，对第2组贝那鲁肽对食物摄取、体重和BMI的影响进行评估。

在该药物注射30分钟之前，将浓度为2mg/mL的贝那鲁肽稀释，配制成浓度为0.2，0.4，或者0.8mg/mL的注射药物，固定注射容量为0.05mL/kg。实验所使用的动物每天进食三餐，包括每天上午(约8:30)和下午(约16:00)喂食标准实验猴饲料和中午喂食的水果餐(约14:00)。每只动物给予150克猴饲料。半小时后，如果所有的猴饲料都被吃完，那么再给予动物额外的50g猴饲料。给动物约一个小时进食时间，并将残留物称重并记录以计算食物摄入量。根据表7，为每只动物提供相同热量的水果。

每周测量一次每只动物体重，坐高在第1周，第4周，第7周实验结束时进行DEXA(Dual-Energy X-ray Absorptiometry)扫描时测量。通过肌肉注射0.02mL/kg舒眠宁麻醉动物并使其保持侧卧姿势。测量动物头部顶至尾巴根部作为坐高记录。使用以下公式计算动物体重指数(BMI)：BMI＝体重(kg)/坐高(m)^2。在动物麻醉时进行DEXA扫描，并且基于DEXA扫描分析身体组成。

在研究期间，每天至少有三次观察动物的任何异常行为或疼痛或紧张症状。在给予贝那鲁肽或溶剂对照后，观察动物是否存在以下任何症状，包括食欲不振，嗜睡，腹泻，便秘，冷漠，呕吐，炎症或注射区域周围的任何其他病症。如果观察到诸如发抖或昏迷的低血糖症状，则对动物进行血糖测试以确认低血糖，并对动物进行保守治疗。

食物摄取

在整个研究期间监测每只动物的每日食物摄入量。如图4A所示，在第2周至第4周期间施以溶剂对照时，第一组动物的食物摄入量与第1周相同，而当第5周至第7周期间施用贝那鲁肽时，食物摄取显著降低。第8周的食物摄入量在第8周恢复至与第1周相当的程度。如图4B所示，与第1周的食物摄入相比，当给予贝那鲁肽时，组2动物在第2周至第4周的食物摄取量显著降低。第5周，食欲开始恢复，第7周给药完成后，恢复到基线水平。

通过动物摄食量计算每只动物摄入的热量值，实验组里的每只动物在给予贝那鲁肽治疗之前和治疗时以及治疗之后的摄食数据进行了对比，结果如图4C所示。动物在接受贝那鲁肽治疗期间的每周平均食物/热量摄取明显低于动物治疗前阶段的食物/热量摄取(p＜0.05)。

因此，每天两次或三次贝那鲁肽皮下注射可显著降低雄性和雌性肥胖食蟹猴中的食物摄取量。事实上，第2组动物在第4周头三天以40μg/kg贝那鲁肽的剂量施用时显示出严重厌食症状，因此在第4周的其余几天内剂量必须降至20μg/kg。据计算，饮食诱导的肥胖食蟹猴贝那鲁肽的最大耐受剂量是每天三次，每次20-40μg/kg。

体重和BMI

在整个研究期间，每只猴子每周称重，所有体重信息记录在表8中。

如图5A所示，在第2至第4周施用溶剂对照时，第1组的雄性和雌性动物体重没有显著变化，而组2施用贝那鲁肽的猴子体重持续减轻。此外，第1组动物在第5周至第7周期间施用贝那鲁肽时体重减轻。第2组中的雌性猴子在第5周切换到溶剂对照后体重逐步增加；然而，当贝那鲁肽施用结束时，组2中的雄性猴子体重没有显著增加。图5B比较了贝那鲁肽治疗前后每只动物的体重。与基线期的体重相比，三周治疗后，动物体重显著减轻(p＜0.05)。

在第1周、第4周和第7周结束时测量每只动物的坐高，并根据体重和坐高计算BMI。两组动物在三周贝那鲁肽治疗后BMI降低。

身体成分分析

在第1周、第4周和第7周结束时对每只动物进行DEXA扫描，关于身体成分的信息示于表9中。

在第4周结束时，与基线水平相比，第1组动物施用溶剂对照后，身体脂肪含量略有增加；而施用贝那鲁肽的第2组动物身体脂肪含量显著降低。在第7周结束时，与基线水平相比，使用贝那鲁肽的第1组动物身体脂肪含量也降低。身体脂肪百分比是根据总体重的体脂百分比计算的。

实施例5

在试验5A中，对于磺脲类药物(例如，格列吡嗪)血糖控制不佳的人类2型糖尿病患者对象(96例)施用贝那鲁肽(0mg、0.1mg、0.15mg和0.2mg共四个剂量组，一日三次用药，每次0mg、0.1mg、0.15mg或0.2mg)与格列吡嗪(格列吡嗪控释片(瑞易宁)，给药方式为一日一次口服5mg)，观察不同剂量下贝那鲁肽与格列吡嗪分别单独使用以及合用时施药对象的体重和BMI变化，以及胃肠道反应等不良反应。

糖尿病治疗的首选药物是二甲双胍。在试验5B中，对于单用二甲双胍控制血糖不佳的人类2型糖尿病患者对象(240例)施用贝那鲁肽(0mg、0.1mg、0.15mg和0.2mg共四个剂量组，一日三次用药，每次0mg、0.1mg、0.15mg或0.2mg)与二甲双胍(单药口服，治疗剂量≥1,000mg/天，剂量至少已稳定3个月)，系统观察贝那鲁肽与二甲双胍分别使用和合用的效果。

试验5A和5B的结果可见：贝那鲁肽注射后起效快，达峰时间为给药后20分钟。尽管其作用时间较短(半衰期约为15分钟)，但与格列吡嗪或二甲双胍合用均能取得较单用格列吡嗪或二甲双胍更优的治疗效果，贝那鲁肽临床试验中不良事件主要为轻到中度的恶心呕吐，大部分可被受试者耐受及在用药过程中缓解。

试验5C以试验5B为基础，增加受试2型糖尿病患者例数，设计扩大的多中心临床试验方案，进一步评价贝那鲁肽(0.2mg剂量，一日三次用药，每次0.2mg)与口服降糖药(二甲双胍)合用的有效性和安全性。

表10(试验5A，与格列吡嗪合用)，表11(试验5B，与二甲双胍合用)和表12(试验5C，与二甲双胍合用)显示了受试2型糖尿病患者12周的BMI的改变情况。

表10：5A试验各组BMI(kg/m

注：①组内比较*P＜0.05，**P＜0.001；②治疗后降低值与0mg组比较#P＜0.05，##P＜0.01

三个贝那鲁肽受试药组(0.1mg、0.15mg和0.2mg)受试者体重指数在治疗第8周和第12周显示了具有统计学意义(P＜0.05)的体重降低，其中0.2mg组受试者在治疗第12周的体重指数(kg/m

表11：5B试验各组BMI(kg/m

注：①组内比较*P＜0.05，**P＜0.01

5B试验中三组受试者体重指数的变化情况与体重的变化情况基本一致。综合12周的组间两两比较分析显示0.2mg组的体重指数降低最明显，与0mg、0.1mg组均有显著差异(P＝0.0000和P＝0.0020)，而0mg组和0.1mg组之间无显著差异(P＝0.2317)(图6B)。

如表10-11所示，当贝那鲁肽与格列吡嗪或二甲双胍组合使用时，能够以剂量依赖的方式显著降低受试者的BMI。

根据超重受试者(27.9≥BMI≥24.0kg/m

表12B：超重及肥胖患者试验期间体重的历时性变化(kg)(ITT)(试验5C数据)

表13：组间体重相对基线变化的协方差分析(试验5C数据)

注：采用协方差分析进行组间比较，因变量为体重相对基线变化，协变量为基线。

体重相对基线变化＝治疗后-基线。数据来源于5C试验数据。

如表12和13所示，治疗12周后，贝那鲁肽+二甲双胍治疗组相对基线体重下降率≥3％的受试者比例为40.32％，体重下降≥5％的受试者比例为20.97％，对照组(单用二甲双胍组)下降率分别为27.27％和10.39％。对治疗后相对基线变化的数值分别进行两组内配对T检验和组间协方差分析，p值均＜0.05，差异均有统计学意义。统计分析结果表明：贝那鲁肽+二甲双胍治疗组在减轻体重方面优于对照组。

实施例6

本实施例说明了各种剂量的贝那鲁肽注射剂对减缓雄性和雌性大鼠胃排空的影响。2.1mL贝那鲁肽注射剂含有4.2mg(42,000U)的如SEQ ID NO：1所示的贝那鲁肽。

将112只8周龄的体重为240g至287g(雄性)或194g至227g(雌性)的Sprague-Dawley(SD)大鼠分为7组：第1组(溶剂对照组)，第2组(贝那鲁肽10μg/kg)，第3组(贝那鲁肽12.5μg/kg)，第4组(贝那鲁肽15μg/kg)，第5组(贝那鲁肽30μg/kg)，第6组(贝那鲁肽45μg/kg)和第7组(贝那鲁肽60μg/kg)。由贝那鲁肽注射剂配制各种剂量的贝那鲁肽溶液，在注射动物前保持在室温下至少3小时。动物在注射前29-33小时禁食，注射前5-7小时不给动物喂水。以0.1mL/100g体重的剂量颈部皮下注射。如实施例1所述进行实验。

如表14和15以及图7和图8所示，和溶剂对照组相比，接受30μg/kg，45μg/kg或60μg/kg贝那鲁肽的雄性和雌性大鼠，胃残留率更高。和溶剂对照组相比，接受30μg/kg，45μg/kg或60μg/kg贝那鲁肽的雄性大鼠以及接受10μg/kg，12.5μg/kg，15μg/kg，30μg/kg，45μg/kg或60μg/kg贝那鲁肽的雌性大鼠，碳末推进率更低。因此，注射贝那鲁肽明显抑制胃排空的雄性大鼠和雌性大鼠的有效剂量可以低至分别为30μg/kg和10μg/kg，分别对应于人类剂量为0.33mg/天和0.11mg/天。

注：和溶剂对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

注：和溶剂对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

实施例7

本实施例说明了各种剂量的贝那鲁肽注射剂对减缓饮食诱导的肥胖(DIO)雄性小鼠胃排空的影响。除了使用不同的动物模型之外，以与实施例6中所述相同的方式进行实验。

56只4-6周龄的C57BL/6J小鼠分别喂食高脂肪饮食(60％脂肪)和低脂肪饮食(10％脂肪)15周，直到喂食高脂肪饮食小鼠的体重显著增加至39.2-47.9g。图9和图10显示了在15周的时间内，高脂肪饮食和低脂肪饮食的小鼠的体重变化和食物摄取。如图11所示，随着特殊饮食期的结束，通过腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)证实了胰岛素抵抗和肥胖的成功诱导。

如表16和图12A和12B所示，雄性DIO小鼠接受50μg/kg或以上剂量贝那鲁肽后，胃残留率明显高于溶剂对照组。雄性DIO小鼠接受15μg/kg或以上剂量的贝那鲁肽后，和溶剂对照组相比，碳末推进率显著降低。因此，数据表明，注射贝那鲁肽明显抑制DIO小鼠的胃排空的有效剂量可以低至15μg/kg，对应于人类剂量为0.12mg/天。

序列表

<110> 上海仁会生物制药股份有限公司

<120> 用于治疗肥胖和体重管理的GLP-1组合物

<130> 057783-8014.CN01

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly

20 25

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30