基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用

摘要

本发明涉及基于CRISPR‑Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用。所述检测系统包括CRISPR‑Cas14a系统、TSPE和磁性纳米粒子；所述CRISPR‑Cas14a系统包括通用sgRNA和Cas14a；所述TSPE为标签特异性引物扩增体系，包括含有Tag序列的标签正向引物和含有生物素标记序列的反向引物；所述磁性纳米粒子可与TSPE的反向引物连接。本发明检测系统具有通用sgRNA，且检测过程不需要PAM，检测过程得到简化，应用范围更广。所述检测方法操作简单，相较于传统检测方法，省去了多次制备sgRNA的过程，简化了标签特异性引物扩增体系的纯化过程(TSPE)，降低了检测过程中的操作难度和生产成本。所述应用具体值本发明检测系统在检测无PAM序列DNA的中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药检测技术的技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用。

背景技术

许多威胁生命的传染病通常具有相似的体征与症状，为了进一步确定如何用药，需要明确患者感染的细菌或病毒的具体种类。现今，核酸检测系统可用于鉴定细菌或病毒的种类，且具有高度灵敏、诊断速度快的优点。

在病毒和细菌检测领域中，常用的核酸检测系统主要依赖CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统(聚簇成规则间隔的短回文重复序列和相关蛋白)是细菌中的一种适应性免疫系统，可整合入侵的外源DNA；当病原体再次入侵时，转录形成crRNA，crRNA与Cas酶形成核糖核蛋白复合物，该复合物与外源DNA上的特定核酸序列(靶核酸序列)配对并切割，使病原体灭活。结合CRISPR-Cas系统的上述性质，再辅以通用荧光核酸传感平台，即可用于病原体的检测。

目前，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测系统主要包括基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统和基于CRISPR-Cas13a/Cas12a的核酸检测系统。这两种检测系统均已应用于临床的核酸检测、区分致病菌种；但是，使用时需要至少满足以下两点：

(1)需要靶核酸序列中的Protospacer相邻基序(PAM)；

(2)使用多重sgRNA进行多目标检测时，需要各待测病原体基因组片段中的特定目标和根据不同病原体的特定片段制备的多种sgRNA。

上述条件都限制了基于CRISPR-Cas系统的核酸检测系统的应用，增大了检测难度和检测成本；同时，也凸显出了对不使用PAM、通用sgRNA的CRISPR-Cas核酸检测系统的需求。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统，其具有通用sgRNA，且检测过程不需要PAM，检测过程得到简化，应用范围更广，实用性强。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统，包括CRISPR-Cas14a系统、TSPE和磁性纳米粒子；所述CRISPR-Cas14a系统包括通用sgRNA和Cas14a；所述TSPE为标签特异性引物扩增体系，包括含有Tag序列的标签正向引物和含有生物素标记序列的反向引物；所述磁性纳米粒子可与TSPE的反向引物连接。

进一步的，所述通用sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述CRISPR-Cas14a系统还包括探针DNA，所述探针DNA修饰有荧光基团和猝灭基团。

进一步的，所述TSPE还包括目标DNA模板。

进一步的，所述磁性纳米粒子为链霉亲和素磁珠。

本发明基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统的有益效果为：

(1)本发明检测系统的CRISPR-Cas14a系统中包括Cas14a，Cas14a是由通用sgRNA引导的、能够靶向ssDNA裂解的核酸内切酶，不需要PAM即可对目标DNA进行切割，克服了传统检测系统对PAM的依赖性，扩大了本发明检测系统的应用范围，提高了本发明的实用性；

(2)本发明检测系统中的通用sgRNA为自主设计，其具有通用性，可与不同细菌或病毒制备的TSPE的Tag序列端连接，激发Cas14a的切割活性，省去了根据细菌或病毒的种类分别制备sgRNA的过程，简化了检测步骤，降低了检测成本；

(3)本发明检测系统包括磁性纳米粒子，磁性纳米粒子具有独特的快速分离能力，其与TSPE结合后，便于检测人员对TSPE进行富集，进而保证检测结果的准确性和灵敏性。

本发明的另一目的在于提供一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法，该检测方法操作简单，相较于传统检测方法，省去了多次制备sgRNA的过程，简化了标签特异性引物扩增体系的纯化过程(TSPE)，降低了检测过程中的操作难度和生产成本。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样的DNA作为模板，利用DreamTaq

进一步的，所述富集操作包括以下操作：将TSPE与磁性纳米粒子的混合液室温下搅拌，并用PBS洗涤，通过磁分离获得磁珠复合物。

进一步的，还包括：sgRNA的预制备和Cas14a的纯化。

本发明基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法整体包括sgRNA的预制备、Cas14a的纯化、TSPE的制备与富集以及检测与分析，检测灵敏度高，操作过程简单，降低了检测过程中的操作难度和生产成本，实用性强。

本发明的另一目的在于提供一种根据权利要求1-5任一项所述的检测系统在检测无PAM序列DNA中的应用。

附图说明

图1是本发明基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统的检测原理；

图2是本发明的实施例1检测大肠杆菌(Escherichia)的实时荧光曲线图；

图3是本发明的实施例2检测伤寒杆菌(Eberthella)的实时荧光曲线图；

图4是本发明的实施例3检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas)的实时荧光曲线图；

图5是本发明的实施例4检测酿脓链球菌(Streptococcus)的实时荧光曲线图；

图6是本发明的实施例5中检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)的实时荧光曲线图；

图7是本发明的实施例6检测粪肠球菌(Enterococcus)的实时荧光曲线图；

图8是本发明的实施例7中检测SARS-CoV-2的实时荧光曲线图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统可应用于无PAM序列DNA的检测中，具体检测原理如图1所示。

预制备

(1)Cas14a的表达和纯化

S1.准备克隆载体(pLBH531-MBP-Cas14a1)，购自Jennifer Doudna Lab质粒。使用带有10xHis-MBP-Cas14a1的表达载体转化大肠杆菌transtta(DE3)，然后在无菌的LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/LNaCl溶液)中37℃恒温培养，过程中持续摇动，直至OD

S2.向上述培养基中添加异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，直至终浓度为1mM，并在18℃恒温摇动培养基12h，离心，收集细菌细胞，将收集的细菌细胞重悬于裂解缓冲液(50mMTris-HCl，20mM咪唑，1mMDTT，500mMNaCl，0.2mMPMSF，pH＝7.5)中。

S3.使用超声细胞破碎系统，将上述裂解缓冲液中的细菌细胞于冰中破碎，然后在4℃下离心30分钟，分离碎片，并用0.22um的过滤器过滤上清液，最后在冰浴中通过Bio-ScaleTM Mini NuviaTM IMAC(Bio-Rad Laborataries，Inc)进行纯化。

S4.将上述操作中得到的含有蛋白质的流分与TEV蛋白酶在4℃中孵育过夜，分别除去MBP和His-tag。

S5.将上述操作中得到的蛋白质交换至平衡溶液(2MNaCl，20mM Tris-HCl，5mMβ巯基乙醇)中，并加载至HiTrapTM Heparion HP(GE Healthcare)上；将蛋白质从平衡溶液洗脱到洗脱液(20mM HEPES，pH7.5，0.5mM TCEP，1.250M NaCl)中，得到Cas14a，冰浴储存备用。

(2)通用sgRNA的制备

从含有T7启动子、与如表1所示序列匹配的核苷酸靶序列(SEQ ID NO.1)和sgRNA抗性的pUC19载体中PCR扩增通用sgRNA的模板。使用扩增的PCR产物作为DNA模板，通过T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃下体外转录通过sgRNA 16小时，然后使用RNA纯化试剂盒(NEB)纯化，得到通用sgRNA，-70℃下储存备用。

表1通用sgRNA的序列

制备例

(1)大肠杆菌的培养与cDNA的制备

大肠杆菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种大肠杆菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至10

将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得大肠杆菌的cDNA。

(2)伤寒杆菌的培养与cDNA的制备

伤寒杆菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种伤寒杆菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至10

将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得伤寒杆菌的cDNA。

(3)铜绿假单胞菌的培养与cDNA的制备

铜绿假单胞菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种铜绿假单胞菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至10

将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得铜绿假单胞菌的cDNA。

(4)酿脓链球菌的培养与cDNA的制备

酿脓链球菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种酿脓链球菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至10

将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得酿脓链球菌的cDNA。

(5)金黄色葡萄球菌的培养与cDNA的制备

金黄色葡萄球菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种金黄色葡萄球菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至10

将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得金黄色葡萄球菌的cDNA。

(6)粪肠球菌的培养与cDNA的制备

粪肠球菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种粪肠球菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至10

将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得粪肠球菌的cDNA。

(7)SARS-CoV-2的来源与制备

重组质粒涉及SARS-CoV-2的全长N基因(Genbank Accession NO.MN908947.3)，由Tiandz Biotech构建，N基因的引物序列按照中国疾病预防控制中心(CDC)设计。

实施例1

(1)大肠杆菌TSPE的制备

通过MegAlign软件(DNASTAR)选择大肠杆菌的目标区域(SEQ ID NO.2)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.3)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.4)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM具有大肠杆菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及大肠杆菌等六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA分别作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对大肠杆菌DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于大肠杆菌的检测

分别将上述得到的以六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA为模板制备的TSPE产品进行下列检测。

将20μL的TSPE产品与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针和预制的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置30分钟，制得混合液。

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对大肠杆菌的特异性检测结果如图2所示。7种TSPE产品中只有以大肠杆菌的cDNA为模板的扩增体系中含有TSPE，检测中荧光信号随时间显著增强，说明设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

实施例2

(1)伤寒杆菌TSPE的制备

通过MegAlign软件(DNASTAR)选择伤寒杆菌的目标区域(SEQ ID NO.5)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.6)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.7)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM具有伤寒杆菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及伤寒杆菌等六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA分别作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对伤寒杆菌DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于伤寒杆菌的检测

分别将上述得到的以六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA为模板制备的TSPE产品进行下列检测。

将20μL的TSPE产品与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针和预制的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对伤寒杆菌的特异性检测结果如图3所示。7种TSPE产品中只有以伤寒杆菌的cDNA为模板的扩增体系中含有TSPE，检测中荧光信号随时间显著增强，说明设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

实施例3

(1)铜绿假单胞菌TSPE的制备

通过MegAlign软件(DNASTAR)选择铜绿假单胞菌的目标区域(SEQ ID NO.8)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.9)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.10)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM具有铜绿假单胞菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及铜绿假单胞菌等六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA分别作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对铜绿假单胞菌DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于铜绿假单胞菌的检测

分别将上述得到的以六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA为模板制备的TSPE产品进行下列检测。

将20μL的TSPE产品与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针和预制的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置30分钟，制得混合液。

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对铜绿假单胞菌的特异性检测结果如图4所示。7种TSPE产品中只有以铜绿假单胞菌的cDNA为模板的扩增体系中含有TSPE，检测中荧光信号随时间显著增强，说明设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

实施例4

(1)酿脓链球菌TSPE的制备

通过MegAlign软件(DNASTAR)选择酿脓链球菌的目标区域(SEQ ID NO.11)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.12)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.13)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM酿脓链球菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及制备例中涉及的酿脓链球菌等六种细菌和SARS-CoV-2的cDNA分别作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于酿脓链球菌的检测

分别将上述得到的以六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA为模板制备的TSPE产品进行下列检测。

将20μL的TSPE产品与20μL链霉亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针和预制备的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对于酿脓链球菌的特异性检测结果如图5所示。7种TSPE产品中只有以酿脓链球菌的cDNA为模板的扩增体系中含有TSPE，检测中荧光信号随时间显著增强，说明设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

实施例5

(1)金黄色葡萄球菌TSPE的制备

通过MegAlign软件(DNASTAR)选择金黄色葡萄球菌的目标区域(SEQ ID NO.14)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.15)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.16)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM具有金黄色葡萄球菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及金黄色葡萄球菌等六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA分别作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对金黄色葡萄球菌DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于金黄色葡萄球菌的检测

分别将上述得到的以六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA为模板制备的TSPE产品进行下列检测。

将20μL的TSPE产品与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针和预制的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对金黄色葡萄球菌的特异性检测结果如图6所示。7种TSPE产品中只有以金黄色葡萄球菌的cDNA为模板的扩增体系中含有TSPE，检测中荧光信号随时间显著增强，说明设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

实施例6

(1)粪肠球菌TSPE的制备

通过MegAlign软件(DNASTAR)选择粪肠球菌的目标区域(SEQ ID NO.17)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.18)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.19)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM具有粪肠球菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及粪肠球菌等六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA分别作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对粪肠球菌DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于粪肠球菌的检测

分别将上述得到的以六种细菌以及SARS-CoV-2的cDNA为模板制备的TSPE产品进行下列检测。

将20μL的TSPE产品与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针和预制的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对粪肠球菌的特异性检测结果如图7所示。7种TSPE产品中只有以粪肠球菌的cDNA为模板的扩增体系中含有TSPE，检测中荧光信号随时间显著增强，说明设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

实施例7

(1)SARS-CoV-2N的TSPE的制备

重组质粒涉及SARS-CoV-2的全长N基因(Genbank Accession NO.MN908947.3)，由Tiandz Biotech构建，N基因的引物序列按照中国疾病预防控制中心(CDC)设计，其中正向引物(SEQ ID NO.21)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.22)结合了生物素标签。序列如表2所示。

将200nM具有SARS-CoV-2特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及SARS-CoV-2的cDNA作为模板，添加DreamTaq

PCR体系为：DreamTaq

操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对SARS-CoV-2DNA进行32个循环；最后，获得TSPE产品。

(2)用于SARS-CoV-2的检测

将20μL的TSPE产品与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。

将1μM nM FQ探针(序列如表2所示)和预制的1μM Cas14a与1μM通用sgRNA置于1x酶活检测缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM DTT和10mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置30分钟，制得混合液。

将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，382孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟。每1分钟进行一次荧光测量(λex：492nm；λem：520nm)；通过执行空白对照获得背景信号。

基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测方法对SARS-CoV-2的特异性检测结果如图8所示。检测中荧光信号随时间显著增强，设计的引物有很强的特异性，且通用sgRNA能够正常发挥作用。

除上述试验外，本发明还进行了不同DNA模板浓度的延伸实验，荧光检测结果如图8所示。

上述检测中用到的与不同细菌和病毒匹配的目标DNA及引物序列如表2所示。

表2.与不同细菌和病毒匹配的扩增序列及引物序列

除上述酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌和SARS-CoV-2外，本发明检测系统还可应用于其他菌种的无PAM序列检测。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

<110> 海南微氪生物科技有限公司

<120> 基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 181

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 通用sgRNA

<400> 1

cuucacugau aaaguggaga accgcuucac caaaagcugu cccuuagggg auuagaacuu 60

gagugaaggu gggcugcuug caucagccua augucgagaa gugcuuucuu cggaaaguaa 120

cccucgaaac aaauucauuu gaaagaauga aggaaugcaa cucuucacua uggucgcgcu 180

a 181

<210> 2

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 扩增序列

<400> 2

ggaggaaggg agtaaagtta atacctttgc tcattgacgt tacccgcaga agaagcaccg 60

gctaactcc 69

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 正向引物

<400> 3

tagcgcgacc atagtgaaga aataggagga agggagtaaa gttaat 46

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 反向引物

<400> 4

aaaaaaggag ttagccggtg cttct 25

<210> 5

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 扩增序列

<400> 5

ggaggaaggt gttgtggtta ataaccgcag caattgacgt tacccgcaga agaagcaccg 60

gctaactc 68

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 正向引物

<400> 6

tagcgcgacc atagtgaaga aataggagga aggtgttgtg gtta 44

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 反向引物

<400> 7

aaaaaagagt tagccggtgc ttcttc 26

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 扩增序列

<400> 8

ggaggaaggg cagtaagtta ataccttgct gttttgacgt taccaacaga ataagcaccg 60

gctaacttcg t 71

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 正向引物

<400> 9

tagcgcgacc atagtgaaga aataggagga agggcagtaa gtt 43

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 反向引物

<400> 10

aaaaaaacga agttagccgg tgctta 26

<210> 11

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 扩增序列

<400> 11

gaagaatgat ggtgggagtg gaaaatccac caagtgacgg taactaacca gaaagggacg 60

gctaacta 68

　<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 正向引物

<400> 12

tagcgcgacc atagtgaaga aatagaagaa tgatggtggg agtg 44

　<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 反向引物

<400> 13

aaaaaatagt tagccgtccc tttctg 26

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 扩增序列

<400> 14

gggaagaaca tatgtgtaag taactgtgca catcttgacg gtacctaatc agaaagccac 60

ggctaactac 70

　<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 正向引物

<400> 15

tagcgcgacc atagtgaaga aatagggaag aacatatgtg taagta 46

　<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 反向引物

<400> 16

aaaaaagtagt tagccgtggc tttct 26

<210> 17

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 扩增序列

<400> 17

gaagaacaag gacgttagta actgaacgtc ccctgacggt atctaaccag aaagccacgg 60

ctaactac 68

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 正向引物

<400> 18

tagcgcgacc atagtgaaga aatagaagaa caaggacgtt agta 44

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> 反向引物

<400> 19

aaaaaagtag ttagccgtgg ctttct 26

<210> 20

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> SARS-CoV-2N-gene

<400> 20

ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc 60

tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctg 99

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> SARS-CoV-2N-正向引物

<400> 21

tagcgcgacc atagtgaaga aataggggaa cttctcctgc tagaat 46

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> SARS-CoV-2N-反向引物

<400> 22

aaaaaacaga cattttgctc tcaagctg 28