鲌鲂杂交种先锋2号的性别特异分子标记及应用

摘要

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及鲌鲂杂交种先锋2号的性别特异分子标记及应用。本发明通过高通量测序的方法成功筛选到鲌鲂杂交鱼雄性性别特异性DNA片段，所述的特异性DNA片段为SEQ ID NO.1所示。针对该特异性序列，设计引物利用常规PCR扩增和普通琼脂糖电泳对能够准确快速鉴定出鲌鲂杂交鱼及其父本黑尾近红鲌的性别，且公开了其引物序列、PCR反应体系和条件。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，解决了鲌鲂杂交鱼及黑尾红鲌性别鉴定的难题，将有助于大规模培育鲌鲂杂交鱼全雌体系。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及鲌鲂杂交种先锋2号的性别特异分子标记及应用。

背景技术

在许多鱼类物种中，雌雄个体之间表现出明显的差异生物学性状，具有性别二态性，诸如生长率、成熟年龄、繁殖方式、体色、体型、个体大小等差异(Kobayashi et al.,2013；Mei and Gui.,2015)。因而开发这些鱼类的单性育种与养殖技术在鱼类养殖产业上具有很大的意义。鲌鲂杂交种“先锋2号”是由团头鲂(♀)和黑尾近红鲌(♂)远缘杂交后经过多代定向选育而成的中国特色经济鱼类新品种，具有生长速度快、抗病力强、易捕耐运输的优良性状。池塘养殖中，“先锋2号”的雌性比雄性具有更快的生长速度，即更高的市场经济价值。全雌鱼的持续繁育可在短时间内积累稳定物种的优良性状，也可避免对自然资源造成基因污染。但在性腺发育成熟之前，雌鱼和雄鱼却很难从外部形态上加以区分，胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上完全没有区别；不存在异形性染色体，也无法从细胞学角度鉴定其遗传性别。若能开发出能准确鉴别此鲌鲂杂交种的性别特异性标记，将大大提高规模化培育全雌群体的准确性和便捷性。

随着高通量测序技术的快速发展，基于酶切的简化基因组测序(RAD-Seq,Restriction-site Associated DNA Sequence)作为一种通过测序进行基因分型的方法，为开发还没有全基因组序列信息鱼类的性别特异性分子标记提供了可能(Gamble et al.,2014；Liu et al.,2018；Zhou et al.,2019；Han et al.,2020)。本发明是利用RAD简化基因组测序的方法，发明了该鲌鲂杂交鱼雄性特异性性别分子标记，并成功应用于鲌鲂杂交鱼及其父本黑尾红鲌雌雄性别的快速鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鲌鲂杂交鱼“先锋2号”性别鉴定的特异性DNA片段，所述的DNA片段为SEQ ID NO.1所示。

本发明的提供了针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物。

本发明提供了SEQ ID NO.1所示序列或针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物的应用。所述的片段或引物可以用于鲌鲂杂交鱼及黑尾近红鲌的性别鉴定，解决了其早期性别鉴定的难题，为其提供了一种基于PCR的快速、简便、准确鉴别遗传性别的方法，为顺利开展鲌鲂杂交鱼的性别控制育种工作、大规模培育单性养殖群体建立基础。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明的第一方面提供一种鲌鲂杂交鱼性别特异分子标记的筛选方法，利用已知性别的鲌鲂杂交鱼样品，取尾鳍提取基因组DNA，通过2b-RAD方法进行测序，文库构建，检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，使用UStacks进行性别特异序列鉴定，得到候选性别特异性分子标记。对候选的分子标记，做进一步筛选，获得普适应的，可用于鉴定鲌鲂杂交鱼及黑尾近红鲌的特异性性别分子标记，所述的分子标记为一段DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的保护内容还包括：

用于检测SEQ ID NO:1所示基因的试剂在鲌鲂杂交鱼或黑尾近红鲌的性别鉴定中的应用。

以上所述的应用中，优选的，所述的试剂为引物；

以上所述的应用中，优选的，所述的引物为：F:ATTCGCCAAAGGGCCGAATC和R:TTTCTGCTGCAGTCGGTTCA。

以上所述的应用中，结果判定为：利用上述引物可扩增出412bp片段的，为雄性鲌鲂杂交鱼或黑尾近红鲌雄性鱼。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

(1)本发明所提供的遗传性别鉴定方法能够以基因组DNA为模板，仅仅通过简单的P CR和电泳结果就能够进行性别的鉴定。该方法不受个体发育时期、环境的影响，稳定地鉴别出杂交鲌各个群体中不同个体的遗传性别，包括胚胎、幼体和成体，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，适合于对大样本进行快速鉴定。

(2)本发明成本低、操作简单、快速、准确，并适合于推广应用，将该DNA分子标记应用于生产实践可以有效地识别与鉴定各种发育阶段遗传性别，有助于将正常雌鱼、伪雌鱼(生理性雄鱼)区分开来，从而大规模培育鲌鲂杂交鱼全雌养殖群体，进一步提高养殖效益，增加该鱼池塘养殖的经济收益。

(3)本发明的分子标记的检测准确度达到了100％。

附图说明

图1为鲌鲂杂交鱼“先锋2号”雄性特异性DNA片段在RAD送测样本群体中遗传性别鉴定的结果示意图；

图中雌性1-10个体的泳道都扩增不出条带，雄性1-10个体都能扩增出412bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

图2为鲌鲂杂交鱼“先锋2号”雄性特异性DNA片段在鲌鲂杂交鱼自然养殖群体中遗传性别鉴定的结果示意图；

图中雌性1-15个体泳道都扩增不出条带，雄性1-15个体都能扩增出412bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

图3为鲌鲂杂交鱼“先锋2号”雄性特异性DNA片段在黑尾近红鲌群体中遗传性别鉴定的结果示意图；

图中雌性1-15个体泳道都扩增不出条带，雄性1-15个体都能扩增出412bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

鲌鲂杂交鱼性别特异性DNA片段的获得：

(1)雄性特异性序列的筛选。通过解剖观察性腺确定的10雌10雄鲌鲂杂交鱼样品，取尾鳍提取基因组DNA，通过2b-RAD方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，一共得到5.49G的原始数据和过滤后得到312164个高质量标签，其标签的平均深度为38.73X。使用UStacks进行性别序列鉴定，最后获得9个标签在10尾雄性中均出现，但是在10尾雌性中均没出现，此序列为雄性特异短序列，即候选特异性性别分子标记；

(2)雄鱼参考基因组构建。步骤(1)中筛选到的短序列仅有27bp，无法进行普通PCR引物设计，需要获得更长的基因组序列。选取1尾雄鱼进行个性化分析，使用Soap Denov ov1.2.0软件进行从头组装，获得雄鱼的survey，作为参考基因组序列；

(3)将(1)中获得的雄性特异短序列在(2)中获得的雄性参考基因组序列中进行BLAST比对搜索，获得对应的较长的核苷酸序列，并设计相应的引物进行群体验证其有效性，最终获得了雄性特异性DNA片段(SEQ ID NO.1所示)，通过NCBI上GenBank数据库比对未发现同源序列。

实施例2：

鲌鲂杂交鱼性别特异性DNA片段使用方法：

(1)针对SEQ ID NO.1所示序列设计引物为：

F:ATTCGCCAAAGGGCCGAATC和R:TTTCTGCTGCAGTCGGTTCA。

(2)PCR扩增：

PCR反应体系为模板DNA模板0.5μl(100ng/μl)，5μl 2x Hieff PCR Master Mix(Yeasen),上游和下游引物(10μmol/μl)各0.25μl混合，补充ddH2O至10μl PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃下变性30s，52.2℃退火30s，72℃下延伸30s，共进行35个循环；最后在72℃下延伸7min，于4℃保存。

(3)PCR扩增结束后，经过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出雄性特异性DNA片段，扩增出特异性条带均在雄性个体中存在，雌性个体中不存在。

实施例3：

雄性特异性DNA片段在鲌鲂杂交鱼及黑尾近红鲌性别鉴定中的应用：

(1)已知性别的鲌鲂杂交鱼(雌雄各25尾)及黑尾近红鲌(雌雄各15尾)群体，采取鳍条组织样本保存于无水乙醇中，利用醋酸铵法提取其基因组DNA，稀释至100ng/μL保存于-20℃备用。

(2)利用实施例2的方法对上述样本群体进行PCR扩增；

(3)扩增结果如下：

图1显示鲌鲂杂交鱼雄性特异性DNA片段在RAD送测样本群体中的扩增结果；图中雌性1-10个体泳道都扩增不出条带，雄性1-10个体都能扩增出412bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

图2显示鲌鲂杂交鱼雄性特异性DNA片段在鲌鲂杂交鱼自然养殖群体中的扩增结果；图中雌性1-15个体泳道都扩增不出条带，雄性1-15个体都能扩增出412bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

图3显示鲌鲂杂交鱼雄性特异性DNA片段在黑尾近红鲌群体中的扩增结果；图中雌性1-15个体泳道都扩增不出条带，雄性1-15个体都能扩增出412bp特异条带，M表示DL2000DNA marker。

序列表

<110> 华中农业大学

武汉市农业科学院

武汉先锋水产科技有限公司

<120> 鲌鲂杂交种先锋2号的性别特异分子标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 412

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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