一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记为a1、a2或a3，所述a1为序列1所示的DNA分子；所述a2是苹果基因组中MdLBD3转录起始位点上游339bp处11pb的Deletion多态；所述a3是来源于苹果的与序列1的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用包括：鉴定苹果砧木的矮化性状；预测苹果砧木的矮化性状；选育具有不同矮化性状的苹果砧木。本发明通过开发与矮化性状相关的分子标记，应用，分子标记辅助育种，有利于定向选择育种，缩短育种年限，提高筛选效率。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标 记及其应用。

背景技术

目前，苹果是我国第一大水果，2019年我国苹果经济产量近4300万t，占 世界总产量的一半以上，其营养丰富、产量高、耐储藏，是满足人们生活消费 水平的促进农业与农村经济发展的支柱性产业。当前，随着我国城市化进程的 加快和农村人口结构的老龄化加剧，水果产业逐渐暴露出劳动力不足的生产现 状。所以机械作业、省力栽培成为果业发展的必由之路，而矮化栽培具有密植 作业、整齐一致、标准化管理等优点，是推广机械化、省力化的前提；并且矮 化栽培早果、丰产、优质，是世界乃至我国水果产业发展的趋势。适宜的矮化 砧木是推广现代化果园的基础，而砧木矮化机理复杂，其鉴定与筛选周期较长， 制约了砧木进程的发展。因此，研究苹果砧木矮化基因变异，对探索砧木矮化 机制、提早辅助筛选鉴定、加速育种进程，促进丰产优质栽培意义重大。

苹果因其遗传背景复杂、童期长、自交不亲和等特点严重制约了苹果砧木 遗传改良及种质创新。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有苹果砧木矮化机理复 杂，其鉴定与筛选周期较长，制约了砧木进程的发展。

解决以上问题及缺陷的难度为：苹果(Malus domestica Mill)风味好、营养 丰富，是我国及世界范围内栽培较广、产量较多的树种之一。其栽植模式由传 统的乔化希植向矮化密植转变，矮化密植具有经济利用土地、早果丰产、品质 优良、适于机械、轻简省力等优点，是我国苹果产业发展的必由之路。矮化砧 木是实现矮化密植栽培的基础，砧木矮化性的遗传改良是当前的产业发展的需 求。

而苹果属植物共17对(34条)染色体，基因组测序表明其包含约4万个基 因，其遗传结构高度杂合，聚合了众多农艺性状的杂交优势。砧矮化性状的选 择与鉴定是国内外的研究热点和难点，通常情况下科研人员需要培育数万株杂 交实生苗，经历多年的选择与鉴定，才能筛选出1～2株有希望优良砧木新品系。 例如：英国的M系砧木育种年限为25～38年，加拿大的O系砧木育种年限为 23～28年，美国的CG系砧木也经历了25～30年的筛选；我国自育苹果砧木GM 系砧木用时24～27年，SH系砧木育种年限近30年，辽砧系砧木的选育也历经 20～30年，而苹果砧木矮化性调控机理复杂，需借助砧穗组合试验完成鉴定，是 制约苹果砧木选育及水果矮化栽培的技术瓶颈。

解决以上问题及缺陷的意义为：传统的田间调查、组织解剖、生理生化等 矮化性鉴定方法，筛选周期长、可靠性差、准确度低；如果能在基因水平上鉴 定苹果砧木的矮化性，设计开发出矮化基因的分子标记，不但能丰富果树矮化 机理的研究，而且能缩短育种周期，提高育种效率，促进水果产业的现代化发 展。该专利技术在大量前期工作的基础上，通过遗传分析、基因定位、组学分 析等前瞻性研究方法，在主效基因MdLBD3启动子区域发现一个连续11bp(5′ -TCAACAACATA-3′)的Deletion特征序列，且该序列与矮化性状完全连锁。 以该序列为靶点，开发设计了矮化基因的分子标记，能精准、有效的对实生苗 及资源的矮化性状进行提早鉴定及预测；仅需要提取1年生幼苗的1个叶片， 通过对PCR扩增产物的电泳检测，即可鉴定出该株系的矮化性状；将常规方法 需要8～10年的矮化性鉴定时间，缩短至1～2年时间，相当于缩短了7～8年的鉴 定周期，不仅极大的提高了筛选效率，可靠性与稳定性好，还节约了苗期的管 理成本和土地的利用效率。在砧木育种学科上，丰富了技术手段，在砧木育种 实践上，优化了选择工具，缩短了育种周期；为优良砧木的培育提供了理论指 导与技术创新，对促进我国苹果矮化栽培发展和水果产业结构升级意义重大。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种苹果砧木矮化性辅助筛选分 子标记及其应用。

本发明是这样实现的，一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记，所述苹果 砧木矮化性辅助筛选分子标记为a1、a2或a3；

a1苹果砧木基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”转录起始位点上 游存在的11bp的Deletion多态，所述Deletion多态与砧木矮化性紧密连锁；所 述a1的特征DNA分子序列为5′-TCAACAACATA-3′。

a2根据所述11bp的Deletion多态，设计一对引物：

(上游引物)MdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；

(下游引物)MdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′；

所述a2是苹果基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”自起始密码子 向前(5’端)开始计的第326-349位核苷酸。

以苹果砧木实生苗或种质资源的DNA为模板，20μLPCR扩增的反应体系， PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃50s，36个循 环；72℃7min，4℃保存；等反应程序下PCR产生经1.5％琼脂糖电泳检测后， 如在550bp处存在条带，则表明该材料为矮化型砧木；如果不存在PCR产物， 或在550bp处无条带，则表明该材料为乔化型砧木。

a311bp的插入多态及开发设计的引物序列的同源性大于95％、98％或99％ 的DNA分子。

进一步，所述PCR扩增的反应体系组成如下(20μL)：2×PCR Mix 10μL， MdLBD3-d-F溶液1.0μL，MdLBD3-d-R溶液1.0μL，模板溶液2.0μL，ddH

本发明的了另一目的在于提供一种所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记 的应用，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用包括：

鉴定苹果砧木的矮化性状；预测苹果砧木的矮化性状；以及选育具有不同 矮化性状的苹果砧木。

进一步，所述预测苹果砧木的矮化性状的方法，包括：

检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮 化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性；

如果待测苹果砧木的两条染色体中有两条存在所述Deletion分子标记，则 待测苹果砧木的基因型为LdLd基因型；如果待测苹果的一条染色体存在所述 Deletion分子标记，则待测苹果的基因型为LdLi基因型；如果待测苹果的两条 染色体均不存在所述Deletion分子标记，则待测苹果的基因型为LiLi基因型。

进一步，所述选育具有不同矮化性状的苹果砧木的方法，包括：

检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮 化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性；

如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为 LdLd基因型；如果待测苹果的一条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基 因型为LdLi基因型。

所述矮化性为苹果砧木的矮化性，即对嫁接于砧木上的接穗的生长势具有 致其矮化的能力，表现为植株的矮化、主干直径较细、植株冠较小等特征。

本发明的了另一目的在于提供一种应用所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子 标记的特异引物对，所述特异引物对是基于所述分子标记设计的，由引物F和 引物R组成；

所述引物F为b1或b2：

(上游引物)MdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；

所述b1是序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述b2是将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与 序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物R为b3或b4：

(下游引物)MdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′；

所述b3是序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述b4是将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与 序列3具有相同功能的DNA分子。

本发明的了另一目的在于提供一种所述特异引物对的应用，所述特异引物 对的应用包括：

鉴定苹果砧木的矮化性状；预测苹果砧木的矮化性状；以及选育具有不同 矮化性状的苹果砧木。

进一步，所述预测苹果砧木的矮化性状的方法，包括：

以待测苹果砧木的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩 增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为550bp，则该植株为LdLi 基因型；如果PCR扩增无产物，则该植株为LiLi基因型；

LdLi基因型为苹果矮化砧木，其树体矮化性>LiLi基因型的苹果砧木。

进一步，所述选育具有不同矮化性状的苹果砧木的方法，包括：

以待测苹果的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增； 如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为550bp，则该植株为LdLi基因 型；如果PCR扩增无产物，则该植株为LiLi基因型；

LdLi基因型苹果砧木的矮化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性。

进一步，所述矮化性为砧木对接穗的致矮性；矮化性越强树体越矮小，矮 化性越弱树体越高大。

如果待测苹果的两条染色体中一条存在所述分子标记，待测苹果的基因型 为LdLi基因型，即其为矮化砧木；如果待测苹果的两条染色体均不具有所述分 子标记，待测苹果的基因型为LiLi基因型，其为乔化砧木。

进一步，所述苹果矮化砧木为该砧木嫁接品种后5年生以上成龄植株，树 体高度≦3.5m，主干近地面20cm处直径≦6.0cm，树冠直径≦2.5m。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提 供的苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用，通过精细定位获得与苹果砧 木矮化性相关的候选基因MdLBD3，开发了基于一个11bp的Deletion多态，可 作为分子标记；进一步本发明人在后代极端表型(乔化/矮化)及种质资源中进 行了验证，证实该分子标记可用于苹果砧木矮化性预选。

本发明仅通过PCR扩增有无条带能鉴定苹果砧木杂交后代及砧木资源的基 因型并通过基因型预判将来砧木的矮化性，简单快速、方便有效。本发明在幼 苗初期既能预判苹果砧木的矮化性，可以用于矮化苹果砧木的早期筛选，在杂 交育种初期就能筛选后代的矮化或乔化表型，达到各种需求(果树科研、生产 栽培)的要求，同时鉴于苹果砧木的童期长、遗传背景复杂等特点，本发明将 会在很大程度上提高苹果砧木育种的筛选效率，缩短砧木育种年限。

本发明通过开发与矮化性状相关的分子标记，应用分子标记辅助育种，弥 补常规杂交育种的缺陷，有利于定向选择育种，缩短育种年限，为苹果砧木育 种的提早筛选与鉴定，提供研究方法与选择工具。

附图说明

图1是本发明实施例提供的30株矮化群体进行步骤二得到的电泳图(在 550bp处，有特征条带)。

图2是本发明实施例提供的30株乔化群体进行步骤二得到的电泳图(在 550bp处，无该特征条带)。

图3是本发明实施例提供的不同MdLBD3基因型苹果砧木杂交群体树体高 度比较示意图(108株杂交后代)。

图4是本发明实施例提供的不同MdLBD3基因型苹果砧木种质资源树体高 度比较示意图(64份资源)。

图5是MdLBD3启动子单克隆Deletion序列差异在(乔化/矮化)砧木资源 及分离群体中的验证示意图。

图6是MdLBD3矮化基因标记在苹果砧木资源‘M9’与‘八棱海棠’中鉴 定矮化表型的应用实例；A：‘M9’与‘八棱海棠’田间矮化表型及对应基因型； B：‘M9’与‘八棱海棠’田间矮化表型数据调查统计与分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

针对苹果砧木矮化性鉴定难度大、周期长存在的技术问题，研究团队首次 以‘八棱海棠’Malus robusta(别名扁棱海棠、海红、扁红海棠，原产于中国的 苹果属野生种，主要分布于华北平原，具有较强的抗寒性与抗病性)、‘M9’ Maluspumila Mill(原名黄色梅兹乐园Yellow Metz，1908年在法国梅兹随机选 育的实生苗，1939年英国东茂林试验站发表，1958年引入中国，具有较好的矮 化性与早果性)等重要核心亲本为材料(上述2份植物材料保存于“省级公益 型科研单位”辽宁省果树科学研究所的苹果砧木资源圃中)，挖掘双亲基因组 重测序数据库经系列化逻辑筛选，在矮化基因启动子区域的特征序列差异，开 发设计了与矮化基因紧密连锁的分子标记应用于苹果砧木矮化性辅助筛选，并 且该分子标记具有鉴定精准度高、可操作性强、应用成本低等优点，具有开发 成专用试剂盒进行规模化、商品化推广应用等价值，具有原创性，在此之前国 内外均无相同或类似报道。

本发明针对下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明首先保护一种分子标记，为如下a1、a2或a3：

a1特征DNA分子序列SEQ ID NO：1为5′-TCAACAACATA-3′；

表1‘八棱海棠’(Malus robusta)、‘M9’(Maluspumila Mill)亲本及 砧木资源测序数据库差异位点分析

如表1所示，亲本重测序显示在第5连锁群4.851Mb物理位置，距离转录起 始位置上游339bp处，矮化型砧木资源‘M9’(Maluspumila Mill M9)、‘B9’(Malus pumila MillB9)存在11bp的缺失多态(5′-TCAACAACATA-3′)，而乔化型砧木 资源‘八棱海棠’(Malusrobusta)、‘山定子’(Malus baccata)均不存在该11bp 的缺失多态，该缺失多态为矮化型砧木资源的特征序列。

a2苹果基因组中“MdLBD3侧向生长组织发育基因”自起始密码子向前(5’ 端)开始计的第326-349位核苷酸；

a3来源于苹果基因组中同源性大于95％、98％或99％的DNA分子。

本发明还保护所述分子标记的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鉴定苹果砧木的矮化性状；

(c2)预测苹果砧木的矮化性状；

(c3)选育具有不同矮化性状的苹果砧木。

本发明还保护一种预测苹果砧木矮化性的方法，包括如下步骤：检测待测 苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮化性>LiLi基因 型苹果砧木的矮化性；

如果待测苹果砧木的两条染色体中有二条存在该Deletion分子标记，待测苹 果砧木的基因型为LdLd基因型；如果待测苹果的一条染色体存在该Deletion分子 标记，待测苹果的基因型为LdLi基因型(图5)，应用实例表明：矮化砧木资源 ‘M9’、‘B9’，分离群体中的矮化型4-54、5-38，均存在该Deletion序列多 态(图5)；如果待测苹果的二条染色体均不存在该Deletion分子标记，待测苹 果的基因型为LiLi基因型，如：乔化砧木资源‘八棱海棠’、‘山定子’，分离 群体中的乔化型8-43、8-36、7-57、6-125、9-35、11-43、2-135、9-55、3-67等 均不存在该该Deletion序列多态(图5)，进一步表明该Deletion序列及其分子标 记对应的基因型与砧木的矮化表型完全符合。

本发明还保护一种选育具有不同矮化性状的苹果砧木的方法，包括如下步 骤：检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮 化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性；

所述矮化性为苹果砧木的矮化性，即对嫁接于砧木上的接穗的生长势具有 致其矮化的能力，表现为植株的矮化、主干直径较细、植株冠较小等特征。

本发明还保护一个特异引物对，是基于所述分子标记设计的，由引物F和引 物R组成；

所述引物F为如下b1或b2：

SEQ ID NO：2：

(上游引物)MdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；

b1序列表的序列2所示的单链DNA分子；

b2将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具 有相同功能的DNA分子；

所述引物R为如下b3或b4：

SEQ ID NO：2：

(下游引物)MdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′。

b3序列表的序列3所示的单链DNA分子；

b4将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具 有相同功能的DNA分子。

本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鉴定苹果砧木的矮化性状；

(c2)预测苹果砧木的矮化性状；

(c3)选育具有不同矮化性状的苹果。

本发明还保护一种预测苹果砧木矮化性状的方法，包括如下步骤：

以待测苹果砧木的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增； 如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为550bp，该植株为LdLi基因型；如 果PCR扩增无产物，该植株为LiLi基因型；

LdLi基因型为苹果矮化砧木，其树体矮化性>LiLi基因型的苹果砧木。

本发明还保护一种选育具有不同矮化性状的苹果砧木的方法，包括：

以待测苹果的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；如 果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为550bp，该植株为LdLi基因型；如果 PCR扩增无产物，该植株为LiLi基因型；

LdLi基因型苹果砧木的矮化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性。

所述矮化性为砧木对接穗的致矮性；矮化性越强树体越矮小，矮化性越弱 树体越高大。

如果待测苹果的两条染色体中一条存在所述分子标记，待测苹果的基因型 为LdLi基因型，即其为矮化砧木；如果待测苹果的两条染色体均不具有所述分 子标记，待测苹果的基因型为LiLi基因型，其为乔化砧木。

所述苹果矮化砧木：为该砧木嫁接品种后5年生以上成龄植株，树体高度≦ 3.5m，主干近地面20cm处直径≦6.0cm，树冠直径≦2.5m。

以上任一所述PCR扩增的反应体系组成如下(20μL)：2×PCR Mix 10μL， MdLBD3-d-F溶液1.0μL，MdLBD3-d-R溶液1.0μL，模板溶液2.0μL，ddH

以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃5min；94℃30s、59℃ 30s、72℃50s，36个循环；72℃7min、4℃保存。

以上任一所述苹果为苹果砧木‘八棱海棠’(Malus robusta)和苹果砧木‘M9’(Maluspumila Mill)的杂交后代。

以上任一所述苹果为苹果砧木‘八棱海棠’(Malus robusta)的花粉对去雄 后的苹果砧木‘M9’(Maluspumila Mill)进行授粉得到的杂交后代。

以上任一所述苹果可为现有苹果砧木。

以上任一所述苹果为苹果植株。

以上任一所述分子标记、特异引物对或方法，均可用于苹果砧木育种。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中 的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试 验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：目标基因的筛选

通过‘八棱海棠’(Malus robusta)בM9’(Maluspumila Mill)杂交分 离群体1032系的株高、干径、冠径等矮化表型调查、统计，应用高密度遗传图 谱进行QTL定位，将矮化性状定位于第5号染色体0.86Mb区间内。根据重测序的 InDel标记，通过遗传学方法，缩短QTL区间，结合基因功能，最终克隆获得一 个与苹果矮化性状相关的基因，即MdLBD3基因。

进一步研究发现，MdLBD3基因启动子区域存在一个11bp (5′-TCAACAACATA-3′)的Deletion多态，位于该基因转录起始位点上游339bp 处。将具有该11bp Deletion核酸的单倍体定义为Ld，将不具有该11bp Deletion 核酸的单倍体定义为Li；苹果为2倍体，亲本测序显示该基因的Deletion为杂合位 点，基于该Deletion多态性，砧木实生苗及资源为LdLi基因型、或LiLi基因型。

基于该11bp的Deletion多态设计一对引物如下：

(上游引物)MdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；

(下游引物)MdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′。

实施例2：应用分子标记鉴定矮化亲本与乔化亲本的后代的矮化性状

一、创制杂交分离群体

1、取‘八棱海棠’(Malus robusta)苹果的花粉，对去雄后的‘M9’(Malus pumilaMill)苹果进行授粉，收获杂交种子；

2、培育杂交种子，得到苹果实生苗；

种植地点为辽宁省果树科学研究所砧木育种试验区，得到1032系苹果实生 苗，每系实生苗扦插繁殖培育营养系3株，次年假植于苗圃中培养；

3、春季采用硬枝接的方法，在砧木苗近地面20cm处嫁接‘富士’(Fuji) 品种接穗，生长季注意除萌、除草、浇水等常规管理，翌年春按株行距1m×3m 株行距定植，肥水、除草、病虫害防治等正常作业管理。

二、苹果砧木实生苗矮化性的测定

在砧穗嫁接分离群体定植第4～6年生开始调查株高、干径、冠径等矮化表型， 矮化型对照为‘M9’、乔化型对照为‘八棱海棠’。调查方法如下：

株高：用米尺从树体基部至梢部垂直测量，精确到cm。

干径：在砧段嫁接口向上10cm处用卡尺在交叉两个方向测定直径，精确到 0.1cm。

3、冠径：分东西、南北两个方向测量树冠的最大直径，精确到cm。

三、基因型鉴定

1、提取分离群体根系的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用MdLBD3-d-F和MdLBD3-d-R组 成的引物对进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系(20μL)：2×PCR Mix 10μL，MdARF6-i-F溶液1.0μL， MdARF6-i-R溶液1.0μL，模板溶液2.0μL，ddH

PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃50s，36个循 环；72℃7min，4℃保存。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

如果PCR扩增产物为一种DNA分子且大小为550bp，该植株为LdLi基因型； 如果PCR扩增产物在550bp处无条带，该植株为LiLi基因型。

四、矮化型植株与乔化型植株的基因型

如果某一成龄植株的苹果砧穗嫁接复合体的株高在3.5m左右，该苹果砧木 为矮化类型砧木；如果某一成龄植株的苹果砧穗嫁接复合体的株高在4.7m左右， 该苹果植株为乔化类型砧木。

从1032株系苹果砧木实生苗挑取连续三年均鉴定为极端矮化类型的30株植 株和均鉴定为极端乔化类型的30株植株。

30株极端矮化植株中，30株为LdLi基因型，0株为LiLi基因型；30株极端乔 化植株中，30株为LiLi基因型，0株为LdLi基因型。该60株分离群体中，LdLi基 因型只存在于极端矮化植株中，而LiLi基因型只存在于极端乔化植株中。

30株极端矮化植株中的部分植株进行步骤二得到的电泳图见图1，不同泳道 对应不同植株；30株极端乔化植株中的部分植株进行步骤二得到的电泳图见图 2，不同泳道对应不同植株。

五、不同基因型群体的树体矮化性平均值

从1032株苹果实生苗中随机取108株植株。

108株植株根据基因型分成二组，统计各组的果实苹果酸含量平均值，结 果如下：

LdLi基因型的植株，52株，平均株高为3.45±0.37m(见图3)；

LiLi基因型的植株，56株，平均株高为4.75±0.41m(见图3)。

在P<0.01水平显著相关，说明实施例1发现的11bp的Deletion多态的基因型 与砧木实生苗矮化性具有较好的显著性。

不同MdLBD3基因型苹果砧木种质资源树体高度比较(64份资源)如图4 所示。

综合以上结果，LdLi基因型与砧木矮化性状完全关联，而LiLi基因型与砧 木乔化性状完全关联；对于苹果砧穗组合树体高矮性状来说，LdLi基因型株高> LiLi基因型株高。实施例1发现的11bp的Deletion多态可用于苹果砧木杂交育种 中实生苗矮化性的早期筛选。

步骤四和步骤五的植株均进行了测序验证：LdLi基因型的植株的PCR扩增产 物仅为一种DNA分子且大小为550bp，LiLi基因型的植株不存在550bp的特征片 断，或无PCR扩增产物。

实施例3：应用分子标记鉴定苹果属砧木种质资源的矮化性

对64个现有苹果属砧木种质资源分别进行如下操作：

检测苹果砧木种质资源的矮化性，方法同实施例2的步骤二。

进行基因型鉴定，方法同实施例2的步骤三。

根据基因型将64个品种分成二组，统计各组的矮化性平均值，结果如下：

LdLi基因型的品种，25个，平均株高为3.50±0.41m；

LiLi基因型的品种，39个，平均株高为4.82±0.45m。

在P<0.01水平显著相关，说明实施例1发现的11bp的Deletion多态的基因型 与砧木资源矮化性具有较好的显著性。

部分结果见表1。

表1部分结果

64个砧木资源均进行了测序验证：LdLi基因型的植株的PCR扩增产物仅为 一种DNA分子且大小为550bp；LiLi基因型的植株的PCR扩增无产物；LdLi基因 型的植株的PCR扩增产物中具有特异分子标记，其550bp的特征条带可以作为鉴 定苹果砧木实生苗及资源具有矮化性的分子标记。

下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。

图6MdLBD3矮化基因标记在苹果砧木资源‘M9’(Maluspumila Mill.)与 ‘八棱海棠’(Malus robusta)中鉴定矮化表型的应用实例；A：‘M9’与‘八棱海 棠’田间矮化表型及对应基因型；B：‘M9’与‘八棱海棠’田间矮化表型数据 调查统计与分析。‘八棱海棠’和‘M9’是生产上常用的苹果砧木，其中‘八 棱海棠’为乔化砧，‘M9’为矮化砧，2016～2019连续三年对两种砧木资源嫁接‘富 士’(Malus domestica Fuji.)的田间矮化性在株高、干径、冠径共三个性状上进 行应用实例的鉴定，结果表明：‘M9’的矮化基因型LdLi，株高、干径、冠径分 别是2.78m、3.34cm、1.45m，‘八棱海棠’的矮化基因型为LiLi，株高、干 径、冠径的数值较大，分别为4.26m、5.64cm、2.26m(图.6)；‘M9’矮化表型 值(株高、干径、冠径)分别是‘八棱海棠’的65.2％、59.3％、64.2％(图 6)；年度间数据较为稳定，标准差在0.10～0.22之间，平均值为0.15。砧木资 源‘M9’、‘八棱海棠’矮化表型的田间调查值与各自的基因型完全符合，该应 用实例进一步证明了开发设计的矮化基因标记能够准确的鉴定砧木资源的田间 矮化表型值。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。

序列表

<110> 辽宁省果树科学研究所

<120> 一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcaacaacat a 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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