苹果砧木实生后代耐盐性鉴定的分子标记筛选及相关基因片段分析

摘要

本研究以两个苹果砧木的杂交组合实生后代为试验材料，利用SRAP和SSR标记技术，结合BSA法，对耐盐不同的材料进行了鉴定及耐盐性相关基因的差异表达分析。主要研究结果如下：
　　 1.确定了适于分子标记的苹果基因组DNA的提取方法（改良CTAB法），其提取液成分为：基本提取液（100mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl,2％CTAB）中添加1％PVP40、10mmol/L Na2S2O5和1％β-巯基乙醇等防酚抗氧化物质，提取中加入高盐可去除多糖。粗提后的DNA经Rnase酶除去RNA，氯仿/异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，得到了RNA去除彻底、纯度高、质量好的苹果基因组DNA。
　　 2．确立了苹果砧木SRAP反应体系：15μL体系中，包括基因组DNA60ng，10×PCR Buffer(with Mg2+)1.5μL，dNTP 0.3mmol·L-1，引物50ng，Taq聚合酶0.75U。
　　 3.确立了苹果砧木SSR反应体系：15μL体系中，包括基因组DNA 60ng，10×PCR Buffer(with Mg2+)1.5μL，dNTP 0.25mmol·L-1，引物0.33μmol·L-1，Taq聚合酶1.0U。
　　 4.128对SRAP引物57对引物在亲本间表现出多态性，其中有4对引物（Me1Em2、Me1Em8、Me1Em12和Me1Em14）在DNA池中表现出多态性，共产生多态性带4条。此4种标记在低耐盐组和高耐盐组间表现多态性，对所有杂交后代单株进行验证，结果显示：144个杂交后代中，表现低耐盐的96个单株中分别有15株、18株、16株和11株发生了交换；表现高耐盐的48个单株中分别有4株、8株、5株和0株发生了交换，在多态性位点未出现特异性片段。结果表明，所筛选到的标记可用于砧木耐盐性鉴定。
　　 5.79对SSR引物中有3对引物（P61、P63和P64）在亲本和DNA池中表现出多态性，共产生多态性带10条。此3种标记在低耐盐组和高耐盐组间表现多态性，对所有杂交后代单株进行验证，结果显示：144个杂交后代中，表现低耐盐的96个单株中分别有13株、15株和8株发生了交换；表现高耐盐的48个单株中分别有2株、5株和8株发生了交换。结果表明，所筛选到的标记可用于砧木耐盐性鉴定。
　　 6.对得到的差异片段进行回收、测序，通过BLAST和其它植物比对，发现Ⅰ号序列与一条编码ATP合酶β亚基（ATP-B）基因和一条水分亏缺胁迫cDNA克隆基因EST的同源性非常高，该序列编码涉及到了抗性表达、离子转运基因，可能参与了植物抗性表达，说明获得的基因序列应是与苹果砧木抗性相关的基因；Ⅱ序列与一条serine/threonine kinase（丝氨酸/苏氨酸激酶）蛋白激酶的蛋白序列同源性比较高，核酸比对较低，可能是具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的新基因。A1、A2序列与一条编码ATP合酶β亚基（ATP-B）基因的同源性较高。

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文摘

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论文说明：缩略词目录

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1引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

附 录

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致 谢