具有增强的产缬氨酸能力的嗜氢菌属细菌基因重组体

摘要

一种嗜氢菌属(Hydrogenophilus)细菌，其中形成突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，所述突变的乙酰乳酸合酶III小亚基包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有下述氨基酸替换(a)至(h)中的任一者的突变氨基酸序列：(a)作为第11位氨基酸的Asn被Asp、His或Ala替换；(b)作为第14位氨基酸的Gly被Asp或Ala替换；(c)作为第17位氨基酸的Ser被Phe替换；(d)作为第29位氨基酸的Asn被Lys、Tyr、Asp或His替换；(e)作为第34位氨基酸的Thr被Ile替换；(f)作为第36位氨基酸的Ala被Val替换；(g)作为第84位氨基酸的Arg和所有后续的氨基酸缺失；以及(h)作为第131位氨基酸的Leu被Arg替换，所述嗜氢菌属细菌能够利用二氧化碳作为唯一碳源有效生产缬氨酸。

说明书

技术领域

本发明涉及被遗传增强以产生提高量的缬氨酸的重组嗜氢菌属(Hydrogenophilus)细菌、使用所述重组体生产缬氨酸的方法以及产生所述重组体的方法。

背景技术

2015年通过的《巴黎协定》规定，应迅速减少全球温室气体排放量。根据该协定，日本设定了到2030年将其温室气体例如二氧化碳和甲烷的排放量与2013年水平相比减少26％的目标。

在世界范围内，大多数化学品的生产依赖于石油资源，加剧了温室气体排放量增加的问题。因此，摆脱对石油的依赖是生产化学品的理想策略，并且在各个国家中正认真地进行从生物质生产绿色化学品的生物炼制的研究和开发。然而，用作微生物发酵原材料的生物质的糖化除了成本高之外还需要复杂的过程。

作为致力于摆脱石油依赖的研究的一部分，诸如二氧化碳、甲烷和一氧化碳的气体作为更具可持续性的碳源已引起关注，并且使用利用这些气体的微生物生产有价值的化学品和生物燃料的技术已成为引起强烈兴趣的主题。具体来说，非常期待对全球变暖具有显著贡献的二氧化碳的碳固定和二氧化碳的高效利用。

作为必需氨基酸之一的缬氨酸是一种可用作药品、食品或化妆品的成分或用作家畜饲料添加剂的物质。迄今为止，缬氨酸通过发酵或蛋白质的化学水解来生产。

然而，与乳酸或乙醇的发酵生产相比，通过可再生资源的发酵生产缬氨酸涉及从充当原材料的糖开始的极其大量的代谢反应步骤。由于这个和其他原因例如代谢酶被缬氨酸产物的反馈抑制，所导致的低生产率一直是缬氨酸的工业规模生产的障碍。

在微生物细胞中，缬氨酸从作为活细胞中的重要中间代谢物的丙酮酸经4个步骤产生。核心过程如下进行：通过乙酰乳酸合酶的催化作用从丙酮酸产生乙酰乳酸；然后通过酮醇酸还原异构酶的催化作用从乙酰乳酸产生2,3-二羟基异戊酸；然后通过二羟基酸脱水酶的催化作用从2,3-二羟基异戊酸产生2-酮基异戊酸；最后通过支链氨基酸氨基转移酶的催化作用将氨基从谷氨酸转移到2-酮基异戊酸，以产生缬氨酸。

对于参与大肠杆菌(Escherichia coli)中缬氨酸的生物合成的乙酰乳酸合酶来说，存在三种已知的同工酶I、II和III。乙酰乳酸合酶II对缬氨酸的反馈抑制有抗性，而乙酰乳酸合酶I和乙酰乳酸合酶III对缬氨酸的反馈抑制敏感。因此，为了利用微生物生产缬氨酸，需要对以高水平产生的缬氨酸的反馈抑制有抗性的乙酰乳酸合酶。

所述乙酰乳酸合酶由大亚基和小亚基组成。所述大亚基具有催化功能，而小亚基保留调控功能。正是由于所述小亚基的功能，乙酰乳酸合酶的酶活性对缬氨酸的反馈抑制敏感。

在用于增强微生物中缬氨酸的生产率的技术中，专利文献1和2中描述的技术给出了涉及使用对缬氨酸的反馈抑制脱敏的突变的乙酰乳酸合酶的方法。

在专利文献1中公开了一种用于生产缬氨酸的技术，所述技术涉及使用以下大肠杆菌：其中编码乙酰乳酸合酶I的小亚基的基因(ilvN基因)被突变以便对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

在专利文献2中公开了一种用于生产缬氨酸的技术，所述技术涉及使用以下大肠杆菌：其中编码乙酰乳酸合酶III的小亚基的基因(ilvH基因)被突变以便对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

然而，每种上述方法均为利用糖作为碳原料生产缬氨酸的方法，并且不同于利用二氧化碳作为碳原料生产缬氨酸的方法。

例如，当编码乙酰乳酸合酶I或III的小亚基的基因经历重组，例如引起对缬氨酸的反馈抑制脱敏的突变时，利用标记基因充当选择已成功发生所述重组的细胞的指示物。抗生素抗性基因等被广泛用作标记基因。其中引入有所述抗生素抗性基因的细胞变得能够在抗生素存在下生长，因此所述抗生素抗性基因被用于其中引入有所述基因的细胞的选择，即正选择。

然而，所述标记基因的种类有限，因此，当在基因组上的多个位点(基因座)处进行基因的修饰例如缺失、插入或替换时，需要循环利用所述标记基因。在已利用正选择标记例如药物抗性基因作为指示物选择出其中感兴趣的基因座被修饰的每个重组体后，当可以从所述重组体中选出所述正选择标记已被移除的细胞时，所述正选择标记可以再次用于另一个基因座处。为此目的，需要一种高效选择所述正选择标记已被移除的细胞的方法。

在基因组上的基因的修饰中，当将正选择标记基因例如药物抗性基因插入到基因组中以便选择修饰的细胞时，所述插入的正选择标记基因的表达通常影响在其附近的基因的表达。在这种情况下，为了消除所述插入的正选择标记基因的表达的影响，出现了对高效选择只有所述正选择标记基因被缺失而同时维持修饰的基因型的细胞的需求。

对于如上所述正选择标记已被移除的细胞的选择、即反选择来说，使用在表达时杀死细胞的遗传标记、即反选择标记是适合的。根据这种方法，通过使用彼此相连的所述正选择标记和反选择标记，选择出由于所述反选择标记的移除而未被杀死的细胞，并因此可以选择性获得所述正选择标记以及反选择标记已被移除的细胞。

在包括大肠杆菌在内的许多细菌中，源自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶基因(sacB)被广泛用作反选择标记。其中引入有sacB基因的大肠杆菌变得不能在蔗糖存在下生长。利用这种特性，通过选择在增补有蔗糖的培养基中生长的大肠杆菌，可以选择性获得不带有sacB基因的大肠杆菌。

在大肠杆菌等中，还存在涉及利用链霉素敏感基因的已知的反选择方法。

已知链霉素抗性菌株以一定频率出现，即使是对于最初对充当抗生素的链霉素敏感的细菌来说。这种链霉素抗性菌株具有在编码核糖体蛋白S12的基因(rpsL基因)中引起的突变，并且由所述突变引起的核糖体蛋白S12中的氨基酸替换充当链霉素抗性的原因。在这种情况下，所述充当链霉素抗性的原因的突变的rpsL基因(在后文中有时被称为“rpsL

当将野生型(天然存在的)rpsL基因引入到这种链霉素抗性菌株中时，所述宿主细菌变得对链霉素敏感。也就是说，所述野生型rpsL基因相对于作为突变的rpsL基因的rpsL

也就是说，存在涉及使用链霉素抗性菌株作为宿主并使用野生型rpsL基因(链霉素敏感基因)作为反选择标记，来获取大肠杆菌等的链霉素抗性菌株的已知的反选择方法(非专利文献1)。

引文表

专利文献

[专利文献1]JP2001-231584A

[专利文献2]JP2008-099668A

非专利文献

[非专利文献1]“可反选择的标记：用于细菌遗传学和病理发生的尚未使用过的工具”(Counterselectable markers:untapped tools for bacterial genetics andpathogenesis)，Reyrat JM,Pelicic V,Gicquel B,Rappuoli R.Infect.Immun.(1998)66:4011-4017

发明内容

技术问题

本发明的第一目的是提供能够利用二氧化碳作为唯一碳源高效生产缬氨酸的嗜氢菌属细菌重组体，以及使用所述重组体高效生产缬氨酸的方法。

本发明的第二目的是提供在嗜氢菌属细菌中高效产生重组体的方法。

为了实现上述目的，本发明的发明人进行了研究，并得到了下述发现。

嗜氢菌属细菌是一种通过利用氢能从二氧化碳产生有机物质而生长的氢氧化细菌。通常，氢氧化细菌具有极低的生长速率。然而，嗜氢菌属细菌具有高生长速率，并且具有比植物和光合细菌高得多的对二氧化碳的碳固定能力。嗜氢菌属细菌产生缬氨酸，但由于代谢酶受到缬氨酸的反馈抑制而生产率低。为了提供以工业规模生产缬氨酸的能力，催化用于生产缬氨酸的反应的酶的编码基因需要在其中引入对反馈抑制脱敏的突变。然而，尚无用于对嗜氢菌属细菌的基因组上的基因进行修饰(例如缺失、替换或添加(包括插入))的技术。

就此而言，本发明的发明人深入研究了用于在嗜氢菌属细菌中进行遗传修饰的技术，并成功地进行了嗜氢菌属细菌的重组，其中通过将嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株与野生型rpsL基因(链霉素敏感基因)相结合，可以循环利用正选择标记。

也就是说，本发明的发明人发现可以分离到嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株，并且嗜氢菌属细菌的rpsL基因可以充当用于所述链霉素抗性菌株的链霉素敏感基因，并因此rpsL基因可以用作反选择标记。

迄今为止，尚不知道可用于嗜氢菌属细菌的正选择标记。本发明的发明人发现，将潮霉素磷酸转移酶基因引入到嗜氢菌属细菌中为其提供了潮霉素抗性，因此所述基因可用作正选择标记。本发明人还已发现，将新霉素/卡那霉素磷酸转移酶基因或卡那霉素核苷酸基转移酶基因引入到嗜氢菌属细菌中为其提供了卡那霉素抗性，因此所述基因可用作正选择标记。

潮霉素磷酸转移酶基因的已知实例是编码大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶的基因(hph)(质粒编码的潮霉素B抗性：潮霉素B磷酸转移酶基因的序列及其在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达(Plasmid-encoded hygromycin B resistance:the sequence of hygromycinB phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli andSaccharomyces cerevisiae)，Gritz L,Davies J.Gene(1983)25:179-188)。

用于提供卡那霉素抗性的基因的已知实例是编码大肠杆菌转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶的基因(nptII)和编码金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的卡那霉素核苷酸基转移酶的基因(knt)(源自于大肠杆菌质粒pK18和pK19的小型可移动多用途克隆载体：谷氨酸棒杆菌染色体中确定缺失的选择(Small mobilizable multi-purpose cloningvectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection ofdefined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum)，Schafer A,Tauch A,Jager W,Kalinowski J,Thierbach G,Puhler A.Gene(1994)145:69-73；由来自于嗜热杆菌的质粒和由质粒pUB110编码的卡那霉素失活酶的酶和核苷酸序列的比较研究(Enzymatic and nucleotide sequence studies of a kanamycin-inactivating enzymeencoded by a plasmid from thermophilic bacilli in comparison with thatencoded by plasmid pUB110)，Matsumura M,Katakura Y,Imanaka T,AibaS.J.Bacteriol.(1984)160:413-420)。

根据本发明的发明人所做的研究，发现尽管在许多情况下将异源基因引入到嗜氢菌属细菌中不引起它的表达，但潮霉素磷酸转移酶基因确实表达了在嗜氢菌属细菌中有功能的蛋白质，并因此为其提供潮霉素抗性。还观察到新霉素/卡那霉素磷酸转移酶基因和卡那霉素核苷酸基转移酶基因各自表达在嗜氢菌属细菌中有功能的蛋白质，并因此为其提供卡那霉素抗性。

在嗜氢菌属细菌的基因组上存在编码乙酰乳酸合酶III小亚基的ilvH基因。乙酰乳酸合酶III受到缬氨酸的反馈抑制，因此在本发明中做出了尝试，以将预期导致对缬氨酸的反馈抑制脱敏的突变引入到嗜氢菌属细菌的基因组上编码乙酰乳酸合酶的基因中。

作为结果，已发现一种突变的乙酰乳酸合酶III对缬氨酸的反馈抑制脱敏，在所述突变的乙酰乳酸合酶III中，在用作嗜氢菌属细菌的乙酰乳酸合酶III小亚基的氨基酸序列的SEQ ID NO：1中，第11位氨基酸处的Asn被Asp、His或Ala替换，第14位氨基酸处的Gly被Asp或Ala替换，第17位氨基酸处的Ser被Phe替换，第29位氨基酸处的Asn被Lys、Tyr、Asp或His替换，第34位氨基酸处的Thr被Ile替换，第36位氨基酸处的Ala被Val替换，第84位氨基酸处的Arg和所有后续的氨基酸缺失，或第131位氨基酸处的Leu被Arg替换。也就是说，在1mM缬氨酸存在下野生型嗜氢菌属细菌的生长被抑制，但在编码乙酰乳酸合酶III的基因中引入有上述突变的嗜氢菌属细菌的生长即使在高浓度缬氨酸存在下也不被抑制，而在培养液中积累缬氨酸。这种嗜氢菌属细菌重组体利用二氧化碳作为唯一碳源更高效地生产缬氨酸。

本发明在上述发现的基础上完成，并提供了下述嗜氢菌属细菌重组体、生产缬氨酸的方法、产生重组体的方法等。

项1.下述(1)至(3)中的任一者的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基：

(1)一种突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，其由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中具有下述(a)至(h)中的任一突变的突变氨基酸序列形成：

(a)第11位氨基酸处的Asn被Asp、His或Ala替换；

(b)第14位氨基酸处的Gly被Asp或Ala替换；

(c)第17位氨基酸处的Ser被Phe替换；

(d)第29位氨基酸处的Asn被Lys、Tyr、Asp或His替换；

(e)第34位氨基酸处的Thr被Ile替换；

(f)第36位氨基酸处的Ala被Val替换；

(g)第84位氨基酸处的Arg和所有后续的氨基酸缺失；和

(h)第131位氨基酸处的Leu被Arg替换；

(2)一种突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，其由与(1)中描述的突变氨基酸序列具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成，所述突变的乙酰乳酸合酶III小亚基具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并且压抑了缬氨酸的反馈抑制，

前提条件是

当所述突变氨基酸序列具有(a)的突变时，第11位氨基酸处的氨基酸是Asp、His或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(b)的突变时，第14位氨基酸处的氨基酸是Asp或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(c)的突变时，第17位氨基酸处的氨基酸是Phe，

当所述突变氨基酸序列具有(d)的突变时，第29位氨基酸处的氨基酸是Lys、Tyr、Asp或His，

当所述突变氨基酸序列具有(e)的突变时，第34位氨基酸处的氨基酸是Ile，

当所述突变氨基酸序列具有(f)的突变时，第36位氨基酸处的氨基酸是Val，

当所述突变氨基酸序列具有(g)的突变时，第84位氨基酸处的氨基酸和所有后续的氨基酸缺失；并且

当所述突变氨基酸序列具有(h)的突变时，第131位氨基酸处的氨基酸是Arg；以及

(3)一种突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，其由在(1)中描述的突变氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列形成，所述突变的乙酰乳酸合酶III小亚基具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并且压抑了缬氨酸的反馈抑制，

前提条件是

当所述突变氨基酸序列具有(a)的突变时，第11位氨基酸处的氨基酸是Asp、His或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(b)的突变时，第14位氨基酸处的氨基酸是Asp或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(c)的突变时，第17位氨基酸处的氨基酸是Phe，

当所述突变氨基酸序列具有(d)的突变时，第29位氨基酸处的氨基酸是Lys、Tyr、Asp或His，

当所述突变氨基酸序列具有(e)的突变时，第34位氨基酸处的氨基酸是Ile，

当所述突变氨基酸序列具有(f)的突变时，第36位氨基酸处的氨基酸是Val，

当所述突变氨基酸序列具有(g)的突变时，第84位氨基酸处的氨基酸和所有后续的氨基酸缺失；并且

当所述突变氨基酸序列具有(h)的突变时，第131位氨基酸处的氨基酸是Arg。

项2.下述(4)至(6)中的任一者的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基基因：

(4)一种基因，其由在SEQ ID NO：2所示的碱基序列中具有下述(i)至(p)中的任一突变的突变碱基序列形成：

(i)第31至33位碱基处的AAC被GAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA或GCG替换；

(j)第40至42位碱基处的GGC被GAT、GAC、GCT、GCC、GCA或GCG替换；

(k)第49至51位碱基处的TCG被TTT或TTC替换；

(l)第85至87位碱基处的AAC被AAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT或CAC替换；

(m)第100至102位碱基处的ACC被ATT、ATC或ATA替换；

(n)第106至108位碱基处的GCA被GTT、GTC、GTA或GTG替换；

(o)第250至252位碱基处的CGC被TAA、TAG或TGA替换；和

(p)第391至393位碱基处的CTC被CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG替换；

(5)一种基因，其由与(4)中描述的突变碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成，所述基因编码具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并压抑了缬氨酸的反馈抑制的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，

前提条件是

当所述突变碱基序列具有(i)的突变时，第31至33位碱基处的碱基是GAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(j)的突变时，第40至42位碱基处的碱基是GAT、GAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(k)的突变时，第49至51位碱基处的碱基是TTT或TTC，

当所述突变碱基序列具有(l)的突变时，第85至87位碱基处的碱基是AAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT或CAC，

当所述突变碱基序列具有(m)的突变时，第100至102位碱基处的碱基是ATT、ATC或ATA，

当所述突变碱基序列具有(n)的突变时，第106至108位碱基处的碱基是GTT、GTC、GTA或GTG，

当所述突变碱基序列具有(o)的突变时，第250至252位碱基处的碱基是TAA、TAG或TGA，并且

当所述突变碱基序列具有(p)的突变时，第391至393位碱基处的碱基是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG；以及

(6)一种基因，其在严紧条件下与由互补于(4)中描述的突变碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交，并且编码具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并压抑了缬氨酸的反馈抑制的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，

前提条件是

当所述突变碱基序列具有(i)的突变时，第31至33位碱基处的碱基是GAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(j)的突变时，第40至42位碱基处的碱基是GAT、GAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(k)的突变时，第49至51位碱基处的碱基是TTT或TTC，

当所述突变碱基序列具有(l)的突变时，第85至87位碱基处的碱基是AAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT或CAC，

当所述突变碱基序列具有(m)的突变时，第100至102位碱基处的碱基是ATT、ATC或ATA，

当所述突变碱基序列具有(n)的突变时，第106至108位碱基处的碱基是GTT、GTC、GTA或GTG，

当所述突变碱基序列具有(o)的突变时，第250至252位碱基处的碱基是TAA、TAG或TGA，并且

当所述突变碱基序列具有(p)的突变时，第391至393位碱基处的碱基是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。

项3.一种嗜氢菌属细菌，其产生项1所述的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基。

项4.一种嗜氢菌属细菌，其包含项2所述的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基基因。

项5.一种生产缬氨酸的方法，所述方法包括利用二氧化碳作为基本上唯一的碳源培养项3或4所述的嗜氢菌属细菌的步骤。

项6.一种用于嗜氢菌属细菌的反选择标记，其包含下述(7)、(8)或(9)的链霉素敏感基因：

(7)由SEQ ID NO：3所示的碱基序列形成的链霉素敏感基因；

(8)由与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽；或

(9)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：3所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽。

项7.一种产生嗜氢菌属细菌的重组体的方法，所述方法包括使用项6所述的反选择标记和嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株。

项8.一种产生嗜氢菌属细菌的重组体的方法，所述方法包括下述步骤：

(A)产生具有标记盒的标记DNA片段，在所述标记盒中将含有链霉素敏感基因的DNA片段与含有用于正选择标记的基因的DNA片段彼此相连，所述标记盒插入在由嗜氢菌属细菌的突变的靶基因形成的DNA片段的5’末端侧区域与3’末端侧区域之间；

(B)进行将所述标记DNA片段引入到所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株中的操作，然后利用所述正选择标记的特性的存在作为指示物，选择其中所述链霉素抗性菌株的靶基因已被所述标记DNA片段替换的每个重组体；以及

(C)进行将所述由嗜氢菌属细菌的突变的靶基因形成的DNA片段引入到每个所述重组体中的操作，然后利用链霉素抗性作为指示物，选择其中基因组上所述标记DNA的区域已被所述突变的靶基因替换的重组体。

项9.根据项8所述的方法，其中所述链霉素敏感基因是下述(7)、(8)或(9)的基因：

(7)由SEQ ID NO：3所示的碱基序列形成的链霉素敏感基因；

(8)由与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽；或

(9)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：3所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽。

项10.一种产生嗜氢菌属细菌的重组体的方法，所述方法包括下述步骤：

(D)产生标记环状DNA，其含有嗜氢菌属细菌的突变的靶基因的DNA片段以及标记盒，所述标记盒中中含有链霉素敏感基因的DNA片段与含有用于正选择标记的基因的DNA片段彼此相连；

(E)进行将所述标记环状DNA引入到所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株中的操作，然后利用所述正选择标记的特性的存在作为指示物，选择所述标记环状DNA被线性化并插入到所述链霉素抗性菌株的靶基因中的每个重组体；

(F)利用链霉素抗性作为指示物，从所述重组体中选择基因组上插入标记DNA的区域已被消除的每个重组体；以及

(G)从步骤(F)中选出的重组体中选择在所述靶基因中引入有突变的重组体。

项11.根据项10所述的方法，其中所述链霉素敏感基因是下述(7)、(8)或(9)的基因：

(7)由SEQ ID NO：3所示的碱基序列形成的链霉素敏感基因；

(8)由与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽；或

(9)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：3所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽。

项12.一种用于嗜氢菌属细菌的正选择标记，其包括下述(10)、(11)或(12)的潮霉素抗性基因：

(10)由SEQ ID NO：4所示的碱基序列形成的潮霉素抗性基因；

(11)由与SEQ ID NO：4所示的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供潮霉素抗性的活性的多肽；或

(12)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：4所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供潮霉素抗性的活性的多肽。

项13.一种用于嗜氢菌属细菌的正选择标记，其包括下述(13)、(14)或(15)的卡那霉素抗性基因：

(13)由SEQ ID NO：5或6所示的碱基序列形成的卡那霉素抗性基因；

(14)由与SEQ ID NO：5或6所示的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供卡那霉素抗性的活性的多肽；或

(15)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：5或6所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供卡那霉素抗性的活性的多肽。

有利效果

应对大气二氧化碳增加的措施需要减少二氧化碳排放量并固定排放的二氧化碳。为了减少二氧化碳排放量，利用太阳能、风能、地热能和类似能源代替化石能源。然而，此类能量的利用还不够广泛，无法抑制大气二氧化碳的积累。因此，需要增强大气中的碳的固定或排放的二氧化碳的循环利用。

二氧化碳的碳固定可以通过物理或化学方式进行，但是利用活细胞进行固定可获得有机物质，由此获得的有机物质可用作食品、饲料和燃料。这样一来，二氧化碳本身就变成一种可直接转化成有价值的化学产品的资源。因此，可以解决由大气二氧化碳增加造成的全球变暖以及食品、饲料和燃料缺乏的双重问题。

氢氧化细菌可以利用由氢与氧的反应产生的化学能并使用二氧化碳作为唯一碳源来生长。由于氢氧化细菌可以从作为原材料的氧气、氢气和二氧化碳气体的混合物生产化学产品，因此所述细胞可以高效地从二氧化碳同化碳并在简单培养基中培养。典型的氢氧化细菌的生长通常是缓慢的，但嗜氢菌属细菌的生长速率格外高。The Journal ofMitsubishi Research Institute第34期1999如下描述嗜氢菌属细菌：“它们的增殖能力如此之高，以至于它们对二氧化碳的碳固定能力不能与植物相比，这真正表明了所述微生物的高二氧化碳固定能力”。

嗜氢菌属细菌以生存所需的量产生缬氨酸，但不以工业上可应用的量产生缬氨酸。本发明的重组体具有引入到嗜氢菌属细菌基因组上的缬氨酸生产相关基因中的突变，并因此可以高效生产缬氨酸。

如上所述，在具有二氧化碳的碳固定能力的生物体中，嗜氢菌属细菌对二氧化碳具有特别出色的碳固定能力。因此，使用本发明的重组体能够以工业规模通过从二氧化碳固定碳来生产缬氨酸。

根据本发明，提供了各自可在嗜氢菌属细菌中用作正选择标记的潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。还提供了可以通过与嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株一起使用而用作反选择标记的链霉素敏感基因。因此，已为嗜氢菌属细菌的重组和基因组修饰铺平了道路。具体来说，可以用作反选择标记的链霉素敏感基因的发现使得能够重复进行嗜氢菌属细菌的重组，从而允许其基因组被大规模修饰。所述标记不保留在基因组中，并且因此，在嗜氢菌属细菌的重组菌株与其野生型菌株的比较中，可以通过将它们的表型、即它们的特性之间的差异与它们的基因型之间的差异直接相关联，来进行讨论。

附图说明

图1是示意图，说明了利用链霉素敏感基因作为反选择标记产生嗜氢菌属细菌的重组体的方法的实例。

图2是示意图，说明了利用链霉素敏感基因作为反选择标记产生嗜氢菌属细菌的重组体的方法的另一个实例。

具体实施方式

下面详细描述本发明。

(

本发明的嗜氢菌属细菌重组体产生下述(1)至(3)中的任一者的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基。

(1)一种突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，其由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中具有下述(a)至(h)中的任一突变的突变氨基酸序列形成：

(a)第11位氨基酸处的Asn被Asp、His或Ala替换；

(b)第14位氨基酸处的Gly被Asp或Ala替换；

(c)第17位氨基酸处的Ser被Phe替换；

(d)第29位氨基酸处的Asn被Lys、Tyr、Asp或His替换；

(e)第34位氨基酸处的Thr被Ile替换；

(f)第36位氨基酸处的Ala被Val替换；

(g)第84位氨基酸处的Arg和所有后续的氨基酸缺失；和

(h)第131位氨基酸处的Leu被Arg替换。

SEQ ID NO：1示出了热淡黄嗜氢菌(Hydrogenophilus thermoluteolus)的天然存在的乙酰乳酸合酶III小亚基的氨基酸序列。

(2)一种突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，其由与(1)中描述的突变氨基酸序列具有90％或更高、优选地95％或更高、甚至更优选地98％或更高、更优选地99％或更高同一性的氨基酸序列形成，所述突变的乙酰乳酸合酶III小亚基具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并且压抑了缬氨酸的反馈抑制，

前提条件是

当所述突变氨基酸序列具有(a)的突变时，第11位氨基酸处的氨基酸是Asp、His或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(b)的突变时，第14位氨基酸处的氨基酸是Asp或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(c)的突变时，第17位氨基酸处的氨基酸是Phe，

当所述突变氨基酸序列具有(d)的突变时，第29位氨基酸处的氨基酸是Lys、Tyr、Asp或His，

当所述突变氨基酸序列具有(e)的突变时，第34位氨基酸处的氨基酸是Ile，

当所述突变氨基酸序列具有(f)的突变时，第36位氨基酸处的氨基酸是Val，

当所述突变氨基酸序列具有(g)的突变时，第84位氨基酸处的氨基酸和所有后续的氨基酸缺失；并且

当所述突变氨基酸序列具有(h)的突变时，第131位氨基酸处的氨基酸是Arg。

在本发明中，氨基酸序列的同一性是使用GENETYX第17版(由GenetyxCorporation制造)计算的值。

(3)一种突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，其由在(1)中描述的突变氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列形成，所述突变的乙酰乳酸合酶III小亚基具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并且压抑了缬氨酸的反馈抑制，

前提条件是

当所述突变氨基酸序列具有(a)的突变时，第11位氨基酸处的氨基酸是Asp、His或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(b)的突变时，第14位氨基酸处的氨基酸是Asp或Ala，

当所述突变氨基酸序列具有(c)的突变时，第17位氨基酸处的氨基酸是Phe，

当所述突变氨基酸序列具有(d)的突变时，第29位氨基酸处的氨基酸是Lys、Tyr、Asp或His，

当所述突变氨基酸序列具有(e)的突变时，第34位氨基酸处的氨基酸是Ile，

当所述突变氨基酸序列具有(f)的突变时，第36位氨基酸处的氨基酸是Val，

当所述突变氨基酸序列具有(g)的突变时，第84位氨基酸处的氨基酸和所有后续的氨基酸缺失；并且

当所述突变氨基酸序列具有(h)的突变时，第131位氨基酸处的氨基酸是Arg。

在本发明中，多个是例如1至5个，特别是1至3个，特别是1或2个，特别是1个。

乙酰乳酸合酶从丙酮酸产生乙酰乳酸。在本发明中，待测试的多肽具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性这一事实，通过在与乙酰乳酸合酶III大亚基共存下检测到乙酰乳酸合酶活性这一事实来确认。乙酰乳酸合酶活性通过以下方法测量：将100mM磷酸钾(pH 7.5)、50mM丙酮酸钠、10mM MgCl

在本发明中，待测试的多肽压抑了缬氨酸的反馈抑制这一事实，通过在缬氨酸存在下检测乙酰乳酸合酶活性来确认。当在一定浓度的缬氨酸存在下，在与乙酰乳酸合酶III大亚基共存下，所述待测试的多肽与野生型(天然存在的)乙酰乳酸合酶III相比乙酰乳酸合酶活性提高，即使只是轻微提高时，可以判断缬氨酸的反馈抑制被压抑。

本发明的嗜氢菌属细菌重组体的实例是在基因组上具有下述(4)至(6)中的任一者的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基基因的嗜氢菌属细菌重组体。

其具体实例是其中基因组上天然存在的乙酰乳酸合酶III小亚基基因已被下述(4)至(6)中的任一者的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基基因替换的嗜氢菌属细菌重组体。

(4)一种基因，其由在SEQ ID NO：2所示的碱基序列中具有下述(i)至(p)中的任一突变的突变碱基序列形成：

(i)第31至33位碱基处的AAC被GAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA或GCG替换；

(j)第40至42位碱基处的GGC被GAT、GAC、GCT、GCC、GCA或GCG替换；

(k)第49至51位碱基处的TCG被TTT或TTC替换；

(l)第85至87位碱基处的AAC被AAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT或CAC替换；

(m)第100至102位碱基处的ACC被ATT、ATC或ATA替换；

(n)第106至108位碱基处的GCA被GTT、GTC、GTA或GTG替换；

(o)第250至252位碱基处的CGC被TAA、TAG或TGA替换；和

(p)第391至393位碱基处的CTC被CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG替换。

SEQ ID NO：2示出了热淡黄嗜氢菌的天然存在的乙酰乳酸合酶III小亚基基因的碱基序列。

(5)一种基因，其由与(4)中描述的突变碱基序列具有90％或更高、优选地95％或更高、更优选地98％或更高、更优选地99％或更高同一性的碱基序列形成，所述基因编码具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并压抑了缬氨酸的反馈抑制的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，

前提条件是

当所述突变碱基序列具有(i)的突变时，第31至33位碱基处的碱基是GAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(j)的突变时，第40至42位碱基处的碱基是GAT、GAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(k)的突变时，第49至51位碱基处的碱基是TTT或TTC，

当所述突变碱基序列具有(l)的突变时，第85至87位碱基处的碱基是AAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT或CAC，

当所述突变碱基序列具有(m)的突变时，第100至102位碱基处的碱基是ATT、ATC或ATA，

当所述突变碱基序列具有(n)的突变时，第106至108位碱基处的碱基是GTT、GTC、GTA或GTG，

当所述突变碱基序列具有(o)的突变时，第250至252位碱基处的碱基是TAA、TAG或TGA，并且

当所述突变碱基序列具有(p)的突变时，第391至393位碱基处的碱基是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。

在本发明中，碱基序列同一性是使用GENETYX第17版由Genetyx Corporation制造)计算的值。

(6)一种基因，其在严紧条件下与由互补于(4)中描述的突变碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交，并且编码具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并压抑了缬氨酸的反馈抑制的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基，

前提条件是

当所述突变碱基序列具有(i)的突变时，第31至33位碱基处的碱基是GAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(j)的突变时，第40至42位碱基处的碱基是GAT、GAC、GCT、GCC、GCA或GCG，

当所述突变碱基序列具有(k)的突变时，第49至51位碱基处的碱基是TTT或TTC，

当所述突变碱基序列具有(l)的突变时，第85至87位碱基处的碱基是AAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT或CAC，

当所述突变碱基序列具有(m)的突变时，第100至102位碱基处的碱基是ATT、ATC或ATA，

当所述突变碱基序列具有(n)的突变时，第106至108位碱基处的碱基是GTT、GTC、GTA或GTG，

当所述突变碱基序列具有(o)的突变时，第250至252位碱基处的碱基是TAA、TAG或TGA，并且

当所述突变碱基序列具有(p)的突变时，第391至393位碱基处的碱基是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。

在本发明中，“严紧条件”意味着使用6xSSC溶液在50至60℃的温度下杂交16小时，然后用0.1xSSC溶液清洗。

嗜氢菌属细菌的实例包括热淡黄嗜氢菌、Hydrogenophilus halorhabdus、脱氮嗜氢菌(Hydrogenophilus denitrificans)、Hydrogenophilus hirschii、Hydrogenophilusislandicus和嗜氢菌属菌株Mar3(Hydrogenophilus sp.Mar3)。具体来说，热淡黄嗜氢菌是优选的，因为它的优越生长速率使其在固定二氧化碳的微生物中能够对二氧化碳实现最高水平的碳固定。

嗜氢菌属细菌已从世界各地多种多样的区域容易地分离。热淡黄嗜氢菌的优选菌株是菌株TH-1(NBRC 14978)。在固定二氧化碳的微生物中，热淡黄嗜氢菌菌株TH-1(NBRC14978)表现出相对快的生长速率(Agricultural and Biological Chemistry,41,685-690(1977))。在国际上，热淡黄嗜氢菌菌株NBRC 14978在布达佩斯公约下保藏，因此可以被普通公众获得。

(

为了使用上述嗜氢菌属细菌重组体生产缬氨酸，可以将所述重组体用无机限定或有机复合培养基培养，同时供应含有氢气、氧气和二氧化碳的混合气体。

所述供应的气体优选为氢气、氧气和二氧化碳的混合物。然而，不同种类的气体可以以能够高效生产乳酸的程度混合在其中。

嗜氢菌属细菌可以使用氢气作为能源并使用二氧化碳作为唯一碳源生长，因此，通过基本上只使用二氧化碳(特别是通过只使用二氧化碳)作为碳源生产上述化合物，可以高效地同化二氧化碳中的碳。因此，使用不含碳源例如有机物质和碳酸盐的无机培养基，即基本上只使用二氧化碳(特别是只使用二氧化碳)作为碳源进行培养，是优选的。“基本上只使用二氧化碳作为碳源”涵盖了不可避免量的其他碳源被混合在其中的情况。此外，也可以使用含有有机物质例如糖、有机酸和氨基酸以及碳酸盐的培养基，而不供应二氧化碳。

所述培养基的pH优选为6.2至8，更优选为6.4至7.4，甚至更优选为6.6至7。当pH在这一范围内时，细菌生长良好并且混合气体良好地溶解在所述培养基中，缬氨酸可以更高效地生产。

当使用分批培养时，可以将混合气体截留在气密培养容器中，并且可以进行静态培养或振摇培养。当使用连续培养时，可以将混合气体连续供应到气密培养容器中并且可以进行振摇培养，或者可以使用气密培养容器并同时通过鼓泡将混合气体引入到培养基中来培养所述转化体。振摇培养是优选的，因为可以获得混合气体在培养基中更好的溶解。

所述供应的气体混合物中氢气、氧气和二氧化碳(氢气：氧气：二氧化碳)的体积比优选为1.75至7.5:1:0.25至3，更优选为5至7.5:1:1至2，甚至更优选为6.25至7.5:1:1.5。当体积比在这一范围内时，细菌生长良好，并且可以高效地生产目标化合物。

混合气体或原料气体的供应速率可以是每1L培养基10.5至60L/小时，特别是10.5至40L/小时，特别是10.5至21L/小时。当供应速率在这一范围内时，转化体生长良好，缬氨酸可以被高效地生产，并且可以将未利用的混合气体的体积降至最低。

培养温度优选为35至55℃，更优选为37至52℃，更优选为50至52℃。当温度在这一范围内时，转化体生长良好，并且可以高效地生产缬氨酸。

通过以上述方式培养，在反应溶液中产生目标化合物缬氨酸。收集所述反应溶液允许回收缬氨酸。然而，也可以通过使用公知的方法从所述反应溶液分离缬氨酸。此类公知的方法包括离子交换树脂、浓缩、结晶以及使用活性炭吸附和洗脱。

(

染色体上的基因可以通过下述方法用突变基因替换：通过PCR等产生所述突变基因，用含有所述突变基因的DNA转化细菌，并在所述突变基因与基因组上的基因之间产生同源重组。也就是说，可以将突变引入到染色体上的基因中。由所述突变基因编码的酶蛋白具有与野生型酶蛋白不同的三维结构，引起功能改变。

如上所述利用同源重组修饰基因组上的基因在嗜氢菌属细菌中是前所未有的。在本发明中，开发了在嗜氢菌属细菌中涉及使用链霉素抗性菌株和链霉素敏感基因的反选择方法，并在通过同源重组定点并入标记和通过第二次同源重组消除所述标记的原理的基础上进行了遗传修饰。

在这种方法中，使用下述(7)、(8)或(9)的链霉素敏感基因作为反选择标记。那些链霉素敏感基因在嗜氢菌属细菌中有功能。

(7)由SEQ ID NO：3所示的碱基序列形成的链霉素敏感基因；

(8)由与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有90％或更高、优选地95％或更高、甚至更优选地98％或更高、更优选地99％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽；或

(9)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：3所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽。

(8)和(9)的链霉素敏感基因的实例包括下述(r)、(s)和(t)的基因：

(r)由其中在SEQ ID NO：3中，第127至129位碱基处的AAA被CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG、AAT、AAC、ACT、ACC、ACA、ACG、ATT、ATC或ATA替换的碱基序列形成的链霉素敏感基因；

(s)由其中在SEQ ID NO：3中，第262至264位碱基处的AAA被CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG、GAA或GAG替换的碱基序列形成的链霉素敏感基因；和

(t)由其中在SEQ ID NO：3中，第271至273位碱基处的CCG被TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、CAA或CAG替换的碱基序列形成的链霉素敏感基因。

作为引起标记基因在嗜氢菌属细菌中表达的优选启动子，提供的实例是tac启动子、lac启动子、trc启动子和来自于Oxford Genetics Ltd的启动子OXB1和OXB11至OXB20中的每一者。作为优选的终止子，提供的实例是大肠杆菌rRNA操纵子rrnB的T1T2终止子和噬菌体λ的t0转录终止子。

待测试的基因是编码具有为嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株提供链霉素敏感性的活性的多肽的基因这一事实，通过在链霉素(50μg/mL或更高)存在下其中引入有所述待测试的基因的链霉素抗性菌株与野生型嗜氢菌属细菌的生长受到相同程度抑制这一事实来确认。

利用上述反选择标记产生嗜氢菌属细菌重组体的方法的实例是包括下述步骤(A)至(C)的方法(第一种方法，图1)：

(A)产生具有标记盒的标记DNA片段，在所述标记盒中将含有链霉素敏感基因的DNA片段与含有用于正选择标记的基因的DNA片段彼此相连，所述标记盒插入在由嗜氢菌属细菌的突变的靶基因形成的DNA片段的5’末端侧区域与3’末端侧区域之间；

(B)进行将所述标记DNA片段引入到所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株中的操作，然后利用所述正选择标记的特性的存在作为指示物，选择其中所述链霉素抗性菌株的靶基因已被所述标记DNA片段替换的每个重组体；以及

(C)进行将所述由嗜氢菌属细菌的突变的靶基因形成的DNA片段引入到每个所述重组体中的操作，然后利用链霉素抗性作为指示物，选择其中基因组上所述标记DNA的区域已被所述突变的靶基因替换的重组体。

(

用于将感兴趣的突变(例如替换、缺失或添加(包括插入))引入到靶基因中的定点突变方法是公知的。例如，嗜氢菌属细菌的其中引入有突变的靶基因，可以通过使用其中一个引物在其中引入有所述感兴趣的突变的引物组，并使用所述嗜氢菌属细菌的基因组DNA作为模板进行PCR来获得。

在这种情况下，下述策略是适合的：将所述靶基因分成两个部分，即5’末端侧区域和3’末端侧区域；通过PCR分别扩增所述区域；以及将一个或多个突变引入到所述区域中的任一者或两者中。

在适合情况下，将所述扩增的5’末端侧区域和3’末端侧区域连接到可以在宿主例如大肠杆菌中使用的载体上。

接下来，产生将要插入到所述载体上的5’末端侧区域与3’末端侧区域之间的标记盒。所述标记盒被制造成使得在所述嗜氢菌属细菌中有功能的链霉素敏感基因和在所述嗜氢菌属细菌中有功能的正选择标记基因彼此相邻连接，或在其间插入有约10,000碱基对或更小的DNA。

接下来，在适合情况下，将所述标记盒插入到已在其中插入有由所述嗜氢菌属细菌的突变的靶基因形成的DNA片段的载体上所述突变的靶基因的5’末端侧区域与3’末端侧区域之间。此外，在适合情况下，按照常规方法用所述得到的载体转化宿主，并从转化体提取所述载体。

接下来，在适合情况下，通过用限制性酶在所述突变的靶基因的5’末端侧区域与3’末端侧区域之间切割，将所述载体线性化，由此提供标记DNA片段。所述切割的进行使得所述标记盒处于被插入到所述突变的靶基因的5’末端侧区域与3’末端侧区域之间的状态下。

上述(7)、(8)或(9)的基因可以用作在嗜氢菌属细菌中有功能的链霉素敏感基因。

迄今为止，完全不知道任何在嗜氢菌属细菌中有功能的正选择标记基因。在本发明中，已发现下述(10)、(11)或(12)的潮霉素抗性基因在嗜氢菌属细菌中有功能，并且可以用作正选择标记。

(10)由SEQ ID NO：4所示的碱基序列形成的潮霉素抗性基因；

(11)由与SEQ ID NO：4所示的碱基序列具有90％或更高、优选地95％或更高、更优选地98％或更高、更优选地99％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供潮霉素抗性的活性的多肽；或

(12)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：4所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供潮霉素抗性的活性的多肽。

待测试的基因是编码具有为嗜氢菌属细菌提供潮霉素抗性的活性的多肽的基因这一事实，通过在潮霉素(100μg/mL)存在下其中插入有所述待测试基因的嗜氢菌属细菌与引入所述待测试基因之前的野生型嗜氢菌属细菌相比生长提高这一事实(即不像引入所述待测试基因之前的野生型嗜氢菌属细菌，能够在潮霉素(100μg/mL)存在下生长这一事实)来确认。

在本发明中，还已发现下述(13)、(14)或(15)的卡那霉素抗性基因在嗜氢菌属细菌中有功能，并且可以用作正选择标记。

(13)由SEQ ID NO：5或6所示的碱基序列形成的卡那霉素抗性基因；

(14)由与SEQ ID NO：5或6所示的碱基序列具有90％或更高、优选地95％或更高、更优选地98％或更高、更优选地99％或更高同一性的碱基序列形成的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供卡那霉素抗性的活性的多肽；或

(15)在严紧条件下与由互补于SEQ ID NO：5或6所示的碱基序列的碱基序列形成的DNA杂交的基因，所述基因编码具有为嗜氢菌属细菌提供卡那霉素抗性的活性的多肽。

待测试的基因是编码具有为嗜氢菌属细菌提供卡那霉素抗性的活性的多肽的基因这一事实，通过在卡那霉素(50μg/mL)存在下其中插入有所述待测试基因的嗜氢菌属细菌与引入所述待测试基因之前的野生型嗜氢菌属细菌相比生长提高这一事实(例如不像引入所述待测试基因之前的野生型嗜氢菌属细菌，能够在卡那霉素(50μg/mL)存在下生长这一事实)来确认。

(

在选择其中通过与标记DNA片段的同源重组已将嗜氢菌属细菌的基因组上的靶基因用所述标记DNA片段替换的每个重组体中，适合的是选择已获得所述正选择标记的特性的每个重组体，例如已变成潮霉素抗性或卡那霉素抗性的每个重组体。

为了在下一步中利用链霉素敏感基因作为反选择标记进行反选择，将嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株用作宿主。当将嗜氢菌属细菌的细菌悬液施加到含有约50μg/mL至约500μg/mL的链霉素的固体培养基并进行培养时，链霉素抗性菌株通常以一定比率出现。

进行将所述标记DNA片段引入到所述链霉素抗性菌株中的操作，并利用所述正选择标记的特性作为指示物，选择其中所述链霉素抗性菌株的基因组上的靶基因已被所述标记DNA片段替换的每个重组体。所述待引入的标记DNA片段还可以具有添加到其两个末端(突变的靶基因的5’末端侧区域的5’末端和突变的靶基因的3’末端侧区域的3’末端)额外核苷酸。所述待获得的重组体是链霉素敏感的。

DNA在嗜氢菌属细菌细胞中的引入可以通过已知方法来进行，例如氯化钙法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染方法或电脉冲法。

(

接下来，为了缺失所述插入到突变的靶基因中的标记盒，使用由所述突变的靶基因形成的DNA片段进行同源重组。

通过以不将所述突变的靶基因分开的方式进行切割，将其中插入有嗜氢菌属细菌的突变的靶基因的载体线性化。在适合情况下，进行将所述线性DNA片段引入到所述链霉素敏感菌株(所述靶基因已被所述标记DNA片段替换的每个重组体)中的操作，并选择已变成链霉素抗性的菌株。选择具有链霉素抗性并且已失去所述正选择标记的特性的菌株，也是优选的。因此，获得了所述插入到突变的靶基因中的标记盒已被消除的重组体，即在所述靶基因中引入有感兴趣的突变的重组体。

利用上述反选择标记产生嗜氢菌属细菌重组体的方法的另一个实例是包括下述步骤(D)至(G)的方法(第二种方法，图2)：

(D)产生标记环状DNA，其含有嗜氢菌属细菌的突变的靶基因的DNA片段以及标记盒，所述标记盒中含有链霉素敏感基因的DNA片段与含有用于正选择标记的基因的DNA片段彼此相连；

(E)进行将所述标记环状DNA引入到所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株中的操作，然后利用所述正选择标记的特性的存在作为指示物，选择所述标记环状DNA被线性化并插入到所述链霉素抗性菌株的靶基因中的每个重组体；

(F)利用链霉素抗性作为指示物，从所述重组体中选择所述插入到基因组上的标记DNA的区域已被消除的每个重组体；以及

(G)从步骤(F)中选出的重组体中选择在所述靶基因中引入有突变的重组体。

(

产生含有嗜氢菌属细菌的其中引入有突变的靶基因和所述标记盒的环状DNA。所述标记盒如第一种方法的步骤(A)所述。在适合情况下，所述环状DNA的整体尺寸约为15,000碱基对或更小。

(

在适合情况下，进行将所述得到的标记环状DNA引入到所述嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株中的操作，并选择已获得所述正选择标记的特性的每个重组体，例如已变成潮霉素抗性或卡那霉素抗性的每个重组体。因此，选择所述标记环状DNA已被线性化并作为与靶基因的5’末端侧区域或3’末端侧区域同源重组的结果而插入到嗜氢菌属细菌的基因组上的靶基因中的每个重组体。也就是说，在每个这些重组体的基因组上，含有所述标记盒的DNA被插入到所述突变的靶基因与天然存在的靶基因之间。因此，所述待获得的重组体是链霉素敏感的。

(

从所述得到的重组体中选择已变成链霉素抗性的每个菌株，优选为链霉素抗性并且已失去所述正选择标记的特性的每个菌株，并因此获得了基因组上突变的靶基因与天然存在的靶基因之间的区域已通过在所述两个基因之间发生第二次同源重组而被消除的每个重组体。每个所述待获得的重组体的基因组上的靶基因在某些情况下是天然存在的靶基因，在其他情况下是突变的靶基因。当所述同源重组在与所述靶基因的5’末端侧区域或3’末端侧区域发生所述第一次同源重组的区域相同的区域中发生时，所述得到的靶基因是野生型的；当所述同源重组在与所述靶基因的5’末端侧区域或3’末端侧区域发生所述第一次同源重组的区域不同的区域中发生时，所述得到的靶基因在其中引入有所述突变。

(

从步骤(F)中获得的重组体中选择在靶基因中引入有感兴趣的突变的菌株。在适合情况下，确定所述得到的重组体的靶基因的碱基序列，以确认所述突变的引入。

当所述靶基因是乙酰乳酸合酶III小亚基基因并且所述感兴趣的突变的靶基因是编码具有乙酰乳酸合酶III小亚基活性并压抑了缬氨酸的反馈抑制的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基的基因时，选择与进行突变的嗜氢菌属细菌的野生菌株相比在缬氨酸存在下生长增强的菌株是适合的。

由其中SEQ ID NO：2的第40至42位碱基处的GGC被GAC替换的碱基序列形成的突变的乙酰乳酸合酶III小亚基基因，作为所述突变的结果含有限制性酶MluI的识别序列。因此，对于在步骤(F)中获得的重组体来说，通过菌落PCR扩增所述靶基因并确认所述扩增的DNA片段被限制性酶MluI切割，是适合的。

如上所述，所述各自在嗜氢菌属细菌中有功能的正选择标记和反选择标记的组合使得能够利用同源重组对基因组上的基因进行修饰。

本发明的具有增强的缬氨酸生产能力的嗜氢菌属细菌重组体也可以通过上述方法来产生。

可以在嗜氢菌属细菌中使用的正选择标记的数目有限，但通过将所述正选择标记与反选择标记组合，可以重复地进行任何次数的重组操作，因此可以对基因组上的多个基因进行修饰。

嗜氢菌属细菌在自养条件下生长。然而，由于它们也可以在异养条件下生长，因此用于培养宿主或嗜氢菌属细菌重组体的培养基可以是无机培养基或有机培养基。可以使用包含糖、有机酸、氨基酸等的有机培养基。所述培养基的pH可以被调整到大约6.2至8。

在任何情况下，培养可以在供应含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物、优选为由氢气、氧气和二氧化碳构成的气体混合物的同时进行。当使用有机培养基时，可以将含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物例如空气用于通气。当不供应二氧化碳气体时，可以使用含有碳酸盐作为碳源的培养基。可以将混合气体截留在或连续供应到气密培养容器中，并且可以利用振摇培养使所述气体溶解在培养基中。或者，所述培养容器可以是气密或开放类型的，并且可以通过鼓泡使混合气体溶解在所述培养基中。

所述供应的气体中氢气、氧气和二氧化碳(氢气：氧气：二氧化碳)的体积比优选为1.75至7.5:1:0.25至3，更优选为5至7.5:1:1至2，更优选为6.25至7.5:1:1.5。嗜氢菌属细菌是嗜热细菌，因此培养温度优选为35至55℃，更优选为37至52℃，甚至更优选为50至52℃。

实施例

(

使用铂环将热淡黄嗜氢菌TH-1菌株(NBRC 14978)(在后文中有时被称为“TH-1菌株”)接种在试管中，在所述试管中已放置5mL A-液体培养基[将3.0g(NH

作为结果，可以在所述含有500μg/mL链霉素的A-固体培养基上识别出3个菌落的形成。这些生长的菌株是TH-1菌株的链霉素抗性菌株，并将其中一个菌株命名为NOC269菌株。

(

(

按照常规方法从TH-1菌株的野生菌株(链霉素敏感菌株)提取基因组DNA。利用所述提取的基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增含有rpsL基因的DNA片段，所述rpsL基因是编码核糖体蛋白S12的链霉素敏感基因。所述PCR使用了下述引物。PCR通过常规方法，使用由Life Technologies Inc.制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂来进行。

用于扩增TH-1菌株的野生型rpsL基因的引物：

(a-1)5’-AT

(b-1)5’-ATA

引物(a-1)添加有MluI限制性酶位点，引物(b-1)添加有SalI限制性酶位点。

(

利用含有潮霉素抗性基因(在后文中有时被称为“hph”)序列的质粒pJR225(GenBank：K01193)[Gene,25,179-188(1983)]的DNA作为模板，通过PCR方法扩增含有所述hph基因的DNA片段。所述PCR使用了下述引物。PCR通过常规方法，使用由LifeTechnologies Inc.制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂来进行。

用于扩增hph基因的引物：

(a-2)5’-ATA

(b-2)5’-AT

引物(a-2)添加有XhoI限制性酶位点，引物(b-2)添加有MluI限制性酶位点。

使用1％琼脂糖凝胶对通过每个上述PCR产生的反应液进行电泳。作为结果，当使用TH-1菌株的基因组DNA作为模板时检测到对应于rpsL基因的约0.5-kb的DNA片段，并且当使用pJR225质粒DNA作为模板时检测到对应于hph基因的约1.0-kb的DNA片段。

将由此制备的含有rpsL基因的DNA片段和含有hph基因的DNA片段分别用限制性酶SalI和限制性酶XhoI切割，并与已用限制性酶SmaI切割的大肠杆菌质粒载体pUC19(GenBank：M77789.2)混合，然后使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)彼此相连。

通过氯化钙法用所述得到的连接溶液转化大肠杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL潮霉素的LB琼脂培养基。通过常规方法对在所述培养基上生长的菌株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，并将所述质粒用限制性酶MluI切割。由此鉴定所述插入的片段。作为结果，除了约2.7-kbp的pUC19载体的DNA片段之外，还发现了对应于彼此相连的rpsL基因和hph基因的序列的约1.5-kbp的DNA片段。

所述构建的含有其中rpsL基因和hph基因彼此相连的标记盒的质粒被命名为pUC-Sm

(

利用在(2-1)中提取的TH-1菌株的野生菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR方法各自扩增分别含有突变的ilvH基因[ilvH(G14D)]的5’-侧区域和3’-侧区域的DNA片段。所述PCR使用了下述引物。所述引物含有对应于G14D突变的序列，因此当使用这些引物扩增ilvH基因的区域时，可以扩增其中引入有G14D突变的突变的ilvH基因[ilvH(G14D)]的DNA区域。PCR通过常规方法，使用由Life Technologies Inc.制造的“DNA热循环仪”并使用KODFX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂来进行。

用于扩增ilvH(G14D)基因的5’-侧区域的引物：

(a-3)5’-AT

(b-3)5’-ACA

引物(a-3)添加有EcoRI限制性酶位点，引物(b-3)添加有MluI限制性酶位点。(b-3)的SEQ ID NO：12的从5’末端起第9个核苷酸是突变位点。

用于扩增ilvH(G14D)基因的3’-侧区域的引物：

(a-4)5’-CGG

(b-4)5’-TT

引物(a-4)添加有MluI限制性酶位点，引物(b-4)添加有PstI限制性酶位点。(a-4)的SEQ ID NO：13的从5’末端起第4个核苷酸是突变位点。

使用1％琼脂糖凝胶对通过每个上述PCR产生的反应液进行电泳。作为结果，分别检测到对应于ilvH(G14D)基因的5’-侧区域和3’-侧区域的约1.0-kb的DNA片段。

将由此制备的ilvH(G14D)基因的5’-侧区域的DNA片段用限制性酶EcoRI和MluI切割，并将由此制备的突变的ilvH(G14D)基因的3’-侧区域的DNA片段用限制性酶MluI和PstI切割。将所述切割产物与已用限制性酶EcoRI和PstI切割的pUC19载体混合，然后使用T4DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)彼此相连。

通过氯化钙法用所述得到的连接溶液转化大肠杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基。通过常规方法对在所述培养基上生长的菌株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，并将所述质粒用限制性酶EcoRI和PstI切割。由此鉴定所述插入的片段。作为结果，除了约2.7-kbp的pUC19载体的DNA片段之外，还发现了对应于彼此相连的ilvH(G14D)基因的5’-侧区域和3’-侧区域的序列的约2.0-kbp的DNA片段。

在这个质粒中，ilvH(G14D)基因的5’-侧区域和3’-侧区域彼此相连，并将ilvH(G14D)克隆成一个完整的基因。所述构建的含有ilvH(G14D)基因的质粒被命名为pUC-ilvH(G14D)。

(

将在上面(2)中制备的pUC-Sm

将所述回收的标记盒的DNA片段与已用限制性酶MluI切割的在(3)中产生的pUC-ilvH(G14D)混合，然后使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)彼此相连。

通过氯化钙法用所述得到的连接溶液转化大肠杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL潮霉素的LB琼脂培养基。通过常规方法对在所述培养基上生长的菌株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，并将所述质粒用限制性酶MluI切割。由此鉴定所述插入的片段。作为结果，除了约4.7-kbp的pUC-ilvH(G14D)质粒的DNA片段之外，还发现了对应于所述标记盒的序列的约1.5-kbp的DNA片段。

所述构建的用于标记ilvH的质粒被命名为pUC-ilvH(G14D)-Sm

(

(

通过用限制性酶EcoRI和PstI切割，将在(4)中制备的环状质粒pUC-ilvH(G14D)-Sm

将在所述A-固体培养基上生长的每个菌株在含有100μg/mL潮霉素或500μg/mL链霉素的A-固体培养基上重新划线，并在充满H

利用作为前述操作的结果而获得的潮霉素抗性和链霉素敏感的菌株作为模板，通过菌落PCR方法扩增含有ilvH基因的DNA区域。所述PCR使用了下述引物。所述引物是在(3)中使用的引物(a-3)和(b-4)的组合，并使用野生型TH-1菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增了含有ilvH基因的约2.0-kbp DNA区域。所述PCR通过常规方法，使用由LifeTechnologies Inc.制造的“DNA热循环仪”并使用TaKaRa Ex Taq(由Takara Bio Inc.制造)作为反应试剂来进行。

用于扩增含有ilvH基因的区域的引物：

(a-3)5’-AT

(b-4)5’-TT

使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应液进行电泳。作为结果，检测到对应于在ilvH中插入有标记盒的序列的约3.5-kbp DNA片段。其中标记盒被插入到ilvH基因中、即ilvH基因被所述标记物标记的菌株被命名为NOC278菌株。

(

通过用限制性酶EcoRI和PstI切割，将所述在(3)中制备的环状质粒pUC-ilvH(G14D)线性化。使用所述得到的线性pUC-ilvH(G14D)，通过电脉冲法(电穿孔法)转化NOC278菌株，其是在(5-1)中获得的ilvH基因被标记的菌株。将转化体施加到含有500μg/mL链霉素的A-固体培养基，并在充满H

将在所述A-固体培养基上生长的每个菌株在含有100μg/mL潮霉素或500μg/mL链霉素的A-固体培养基上重新划线，并在充满H

利用作为前述操作的结果而获得的潮霉素敏感和链霉素抗性菌株作为模板，通过菌落PCR方法扩增含有ilvH基因的DNA区域。所述菌落PCR通过与(5-1)中相同的方法来进行。

使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应液进行电泳。作为结果，检测到与在使用野生型TH-1菌株的基因组DNA作为模板进行PCR的情况下相同的约2.0-kbp的DNA片段。也就是说，这对应于标记盒已被移除的序列。

将所述扩增的约2.0-kbp DNA片段用限制性酶MluI切割，并使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，作为结果，检测到在(3)中与G14D突变一起引入的MluI位点处切割的情况下将会产生的两个约1.0-kbp的DNA片段。所述在使用野生型TH-1菌株的基因组DNA作为模板的情况下将会扩增的约2.0-kbp DNA片段不含任何MluI位点，因此即使在与限制性酶MluI进行反应时也不被切割，并保持2.0-kbp的尺寸。因此，通过用MluI切割检测到两个约1.0-kbp的DNA片段的菌株，是其中ilvH基因已被ilvH(G14D)基因替换，即G14D突变已被引入到ilvH基因中的菌株。所述在ilvH基因中具有G14D突变的菌株被命名为NOC279菌株。

(

使用铂环将NOC279菌株、即嗜氢菌属细菌的在野生型ilvH基因中具有G14D突变的菌株接种到其中放置有5mL含有1mM或10mM缬氨酸的A-液体培养基的每个试管中，将所述试管充满H

所述野生型嗜氢菌属细菌在1mM缬氨酸存在下生长受到抑制，但所述在编码乙酰乳酸合酶III的基因中引入有G14D突变的NOC279菌株即使在10mM缬氨酸存在下生长也不被抑制。因此，所述NOC279菌株对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

(

使用铂环将NOC279菌株、即热淡黄嗜氢菌的在ilvH基因中具有G14D突变的菌株接种到A-液体培养基中，并在50℃下进行30小时的振摇培养，其中随着所述培养供应H

在培养后，对通过离心(4℃，15,000rpm，1分钟)获得的培养上清液中的缬氨酸进行定量，作为结果，发现在所述培养上清液中生产了9mM缬氨酸。当将野生型热淡黄嗜氢菌TH-1菌株进行同样培养并对培养上清液中的缬氨酸进行定量时，结果是0.1mM或更低。

(

热淡黄嗜氢菌NOC279菌株保藏于日本国立技术与评估研究院NITE专利微生物保藏所(日本千叶县木更津市Kazusakamatari2-5-8(邮政编码292-0818))。对于热淡黄嗜氢菌NOC279菌株来说，登记号为BP-02829，接收时期为2018年11月22日。因此，该菌株可供公众使用。

此外，在本说明书中描述的所有菌株均根据《布达佩斯公约》国际保藏，或由无任何条款或条件提供所述菌株的组织拥有，或者被销售，或者可以通过遵照一定的程序被任何人获取，因此，这些菌株均可供普通公众使用。

工业实用性

本发明的重组体使用二氧化碳作为唯一碳源有效地生产缬氨酸，因此，它能够高效生产可用于药品、食品、化妆品、动物饲料添加剂等的缬氨酸，同时解决由二氧化碳排放量增加引起的全球变暖。

序列表

<110> 株式会社CO2资源化研究所（Utilization of Carbon Dioxide InstituteCo.,Ltd.）

<120> 具有增强的产缬氨酸能力的嗜氢菌属细菌基因重组体

<130> FRP0014WO

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 163

<212> PRT

<213> 热淡黄嗜氢菌（Hydrogenophilus thermoluteolus）

<400> 1

Met Arg His Val Ile Ala Leu Leu Val Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ile Ala Gly Leu Phe Ser Ala Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser

20 25 30

Leu Thr Val Ala Pro Thr Glu Asp Glu Ser Leu Ser Arg Met Thr Ile

35 40 45

Val Thr Thr Gly Ser Asp Asp Val Ile Glu Gln Ile Thr Lys Gln Leu

50 55 60

Asn Lys Leu Ile Asp Thr Val Lys Val Val Asp Leu Ser Glu Ser Ala

65 70 75 80

His Ile Glu Arg Glu Leu Met Met Val Lys Val Arg Ala Val Gly Ser

85 90 95

Asp Arg Glu Glu Leu Lys Arg Leu Ala Asp Ile Phe Arg Ala Arg Ile

100 105 110

Ile Asp Val Thr Asp Thr Thr Tyr Val Ile Glu Leu Thr Gly Asn Gln

115 120 125

Gln Lys Leu Asn Ala Phe Leu Ala Ala Ile Ser Pro Ser Leu Ile Leu

130 135 140

Glu Thr Val Arg Ser Gly Val Cys Gly Ile Ala Arg Gly Glu Arg Met

145 150 155 160

Leu Lys Ala

<210> 2

<211> 492

<212> DNA

<213> 热淡黄嗜氢菌（Hydrogenophilus thermoluteolus）

<400> 2

atgagacacg tgattgcact gctggtggaa aacgaatcgg gcgcgttgtc gcgcatcgcc 60

gggctctttt cggcgcgtgg ctacaacatc gaatcgctca ccgtcgcacc gaccgaagac 120

gagagcctgt cgcggatgac gatcgtcacc accggttcgg acgacgtgat cgaacagatc 180

accaagcagc tcaacaaact gatcgatacg gtcaaagtgg tcgacctctc cgaatccgcg 240

cacatcgagc gcgaactgat gatggtgaag gtccgtgccg tgggatcaga ccgcgaagag 300

ctcaaacgcc tggccgacat cttccgcgcc cggatcatcg acgtcaccga caccacctac 360

gtgatcgaac tcaccggcaa ccagcagaag ctcaacgcgt ttctggcggc gatctcgccc 420

agtctcatct tggagacggt gcgtagcggc gtctgcggca ttgcccgtgg cgagcgtatg 480

ttgaaagcct ga 492

<210> 3

<211> 396

<212> DNA

<213> 热淡黄嗜氢菌（Hydrogenophilus thermoluteolus）

<400> 3

atgccaacca tcaaccagtt ggtgcgtcgt ccgcggaaaa cggcgcccga aaagagcaaa 60

gtgccggcgt tgcagggatg tccgcaaaaa cgaggcgtgt gtacgcgcgt ctataccacg 120

acgccgaaaa agccgaactc ggcccttcgt aaggtcgcga aagtgcgttt gaccaacggt 180

tacgaggtga tttcgtacat cggcggcgaa gggcacaatc tgcaagaaca ctcggtggtg 240

ctgattcgtg gcggccgggt gaaagacctg ccgggtgtgc gttaccacat cgtgcgcggt 300

tcgctcgact tgcaaggggt caaggaccgt aagcaagggc gttccaagta cggggcgaag 360

cgtccgaagc cgggcgccgc tgcgggcaag aaataa 396

<210> 4

<211> 1026

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 4

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacatct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

<210> 5

<211> 795

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 5

atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactc 180

caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg gatgcccgac 540

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720

ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780

gacgagttct tctga 795

<210> 6

<211> 762

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 6

atgaatggac caataataat gactagagaa gaaagaatga agattgttca tgaaattaag 60

gaacgaatat tggataaata tggggatgat gttaaggcta ttggtgttta tggctctctt 120

ggtcgtcaga ctgatgggcc ctattcggat attgagatga tgtgtgtcat gtcaacagag 180

gaagcagagt tcagccatga atggacaacc ggtgagtgga aggtggaagt gaattttgat 240

agcgaagaga ttctactaga ttatgcatct caggtggaat cagattggcc gcttacacat 300

ggtcaatttt tctctatttt gccgatttat gattcaggtg gatacttaga gaaagtgtat 360

caaactgcta aatcggtaga agcccaaacg ttccacgatg cgatttgtgc ccttatcgta 420

gaagagctgt ttgaatatgc aggcaaatgg cgtaatattc gtgtgcaagg accgacaaca 480

tttctaccat ccttgactgt acaggtagca atggcaggtg ccatgttgat tggtctgcat 540

catcgcatct gttatacgac gagcgcttcg gtcttaactg aagcagttaa gcaatcagat 600

cttccttcag gttatgacca tctgtgccag ttcgtaatgt ctggtcaact ttccgactct 660

gagaaacttc tggaatcgct agagaatttc tggaatggga ttcaggagtg gacagaacga 720

cacggatata tagtggatgt gtcaaaacgc ataccatttt ga 762

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 7

atacgcgtcc tccgatgcgt cgtaagggaa acgtc 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 8

atagtcgact tatttcttgc ccgcagcggc gcccg 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 9

atactcgagg agatgacgtt ggaggggcaa ggtcg 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 10

atacgcgtct attcctttgc cctcggacga gtgct 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 11

atgaattccc cggaagcgac aagcagttcc tgggg 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 12

acaacgcgtc cgattcgttt tccaccagca gtgca 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 13

cggacgcgtt gtcgcgcatc gccgggctct tttcg 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 14

ttctgcaggc gctttgccgc tttggtcctg atgca 35