与基孔肯雅热病毒E2特异性结合的DNA适体及其用途

摘要

本发明涉及一种特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白结构域2(CHIKV E2)的DNA适体，包含所述DNA适体的用于诊断基孔肯雅热的组合物、用于诊断基孔肯雅热的试剂盒、用于诊断基孔肯雅热的生物传感器，以及提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法。本发明人对开发用于诊断基孔肯雅热的新型生物标志物进行了深入而彻底的研究，结果发现能够特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)的DNA适配体具有对CHIKV E2的很强的结合亲和力以及优异特异性。DNA适配体预期比使用抗体的常规ELISA方法具有更高的稳定性，因此可有利地用于开发用于诊断基孔肯雅热的组合物、用于诊断基孔肯雅热的生物传感器和提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白结构域2(CHIKV E2)的DNA适体，包含所述DNA适体的用于诊断基孔肯雅热的组合物、用于诊断基孔肯雅热的试剂盒和用于诊断基孔肯雅热的生物传感器，以及提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法。

背景技术

基孔肯雅热是一种传染病，伴有发烧、肌肉和关节疼痛、头痛、疲劳、皮疹等。有些患者在某些情况下可能需要几个月或更长时间才能从关节疼痛中恢复过来，据报道，基孔肯雅热还伴有眼、神经和心脏并发症。该病没有专门的治疗方法，通过对症治疗缓解疼痛。据估计，每年发生300万或更多的感染。基孔肯雅热由埃及森林蚊子和白纹伊蚊作为媒介传播。

同时，基孔肯雅热具有三种类型的结构蛋白：嵌入病毒包膜的糖基化E1和E2、以及E3(其是非糖基化衣壳蛋白)。在这种情况下，已知E2和E3参与了病毒粒子的形成和出芽过程。单个线性表位位于E2糖蛋白的N端，并且表现出强烈的抗原-抗体反应。出于这个原因，基孔肯雅热病毒E2已被研究作为开发基于现有IgM和IgG的诊断方法和重组亚单位疫苗的主要靶蛋白(韩国专利No.10-1792684)。

目前，诸如基孔肯雅热之类的地方性热带病通过基于症状的诊断、使用聚合酶链反应(PCR)的传染原检测和使用抗原-抗体反应的免疫诊断来诊断。然而，现有的方法由于成本问题不能在医疗设施较差的发展中国家广泛使用，或者在诸如灵敏度和选择性之类的方面没有达到合适的水平。需要克服现有诊断方法的局限性，并开发可在发展中国家实际应用的检测被忽视疾病的平台。

同时，适体对特定物质具有非常高的亲和力并且是稳定的，因此近年来得到了广泛的开发，并且正在积极地将它们应用于治疗剂和使用它们的诊断传感器。因为适体可通过相对简单的方法合成，并且细胞、蛋白质、甚至小的有机物质都可以为靶向物质，因此有可能开发出使用所述适体的新的检测方法，并且其特异性和稳定性远高于已经开发出来的抗体的特异性和稳定性，从而适体可应用于治疗剂开发、药物输送系统和诊断生物传感器。

因此，为了开发检测被忽视疾病的平台，利用新型生物标志物诊断基孔肯雅热一直是研究的主题，并且就这一点而言已经进行了研究，但研究仍然不充分。

发明内容

[技术问题]

因为本发明是为解决上述问题而作出的，证实了本发明制备的DNA适体与基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)的特异性结合能力，并且基于此完成本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)的DNA适体，其中该DNA适体包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于诊断基孔肯雅热的组合物或用于诊断基孔肯雅热的试剂盒，其包含所述DNA适配体。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于诊断基孔肯雅热的生物传感器，该生物传感器包括：基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)特异性DNA适体；以及其上固定所述DNA适体的基底，其中所述DNA适体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

此外，本发明的另一目的是提供一种提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法，该方法包括：(a)将受试者样品注入生物传感器中；(b)向在步骤(a)中注入受试者样品的生物传感器中注入包含量子点的检测探针；(c)向在步骤(b)中注入检测探针的生物传感器中注入酸；(d)获得溶液，其中在步骤(c)中的量子点与酸彼此反应；以及(e)测量步骤(d)中溶液的电流(安培(A))。

然而，本发明旨在解决的技术问题不限于上文已提及的技术问题，并且本发明所属领域的普通技术人员将由以下描述清楚地理解其他未提及的技术问题。

[技术方案]

为实现上述本发明的目的，本发明提供了一种特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)的DNA适体，其中该DNA适体包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

作为本发明的示例性实施方案，基孔肯雅热病毒E2可以为包括基孔肯雅热病毒抗原表面上的结构域蛋白的蛋白质。

此外，本发明提供了一种用于诊断基孔肯雅热的组合物，该组合物包含DNA适体。

此外，本发明提供了一种用于诊断基孔肯雅热的试剂盒，该试剂盒包含DNA适体。

此外，本发明提供了一种用于诊断基孔肯雅热的生物传感器，该生物传感器包括：基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)特异性DNA适体；以及其上固定所述DNA适体的基底，其中所述DNA适体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

作为本发明的一个示例性实施方案，基底可包括金属电极层和金属纳米颗粒层，并且所述金属可以为金(Au)。

作为本发明的另一示例性实施方案，DNA适体可与待以双链方式固定在基底上的固定序列杂交。

此外，本发明提供了一种提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法，该方法包括：(a)将受试者样品注入生物传感器中；(b)向在步骤(a)中注入受试者样品的生物传感器中注入包含量子点的检测探针；(c)向在步骤(b)中注入检测探针的生物传感器中注入酸；(d)获得溶液，其中步骤(c)中的量子点与酸彼此反应；以及(e)测量步骤(d)中溶液的电流(安培(A))。

作为本发明的一个示例性实施方案，量子点可以为硫化镉(CdS)。

此外，本发明提供了一种基孔肯雅热的诊断方法，该方法包括向个体施用特异性结合CHIKV E2的DNA适体。

此外，本发明提供了一种特异性结合CHIKV E2的用于诊断基孔肯雅热的DNA适体。

[有益效果]

本发明人对开发用于诊断基孔肯雅热的新型生物标志物进行了深入而彻底的研究，结果发现能够特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)的DNA适配体具有对CHIKV E2的很强的结合亲和力以及优异特异性。DNA适配体预期比使用抗体的常规ELISA方法具有更高的稳定性，因此可有利地用于开发用于诊断基孔肯雅热的组合物、用于诊断基孔肯雅热的生物传感器和提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法等。

附图说明

图1是示出确认单链DNA(ssDNA)与CHIKV E2之间的结合度(％)并进行选择处理的结果的图。

图2示出了通过荧光测量确认CV2适体序列的Kd值的结果。

图3是使用DNA适体检测CHIKV E2的生物传感器的示意图。

图4A是确认当CHIKV E2的浓度变化时使用YF1适体的CHIKV E2检测结果的图。

图4B是确认当将转化为Log的CHIKV E2浓度值作为x轴时定量获得的使用CV2适体的CHIKV E2检测结果的图。

图5是说明显示在CHIKV E2蛋白的结合特异性实验中由于与每种蛋白的反应引起的电流值的相对变化的的结果的图。

具体实施方式

作为对开发用于诊断基孔肯雅热的新型生物标志物的深入而彻底的研究的结果，本发明人确认了能够特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)的DNA适体具有对CHIKV E2的强结合亲和力和优异的特异性，从而完成了本发明。

下文中，将详细描述本发明。

本发明提供特异性结合CHIKV E2的DNA适体。

如本文所用，术语“基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)”是指嵌入病毒包膜中的糖基化E2，是糖基化E1和E2以及E3三种结构蛋白中的一者，其为一种非糖基化的衣壳蛋白。在这种情况下，已知E2和E3参与了长成的病毒粒子的形成和出芽过程。单个线性表位位于E2糖蛋白的N端，表现出强烈的抗原-抗体反应。因此，CHIKV E2对应于现有IgM和IgG诊断方法和重组亚单位疫苗开发中的主要靶蛋白，通过检测CHIKV E2可以有效诊断基孔肯雅热，而CHIKV E2可能是包含在基孔肯雅热病毒抗原的表面上的结构域蛋白，但不限于此。

如本文所用的，术语“适体”是指对特定材料具有高特异性和亲和力的单链DNA(ssDNA)或RNA。因为使用先前开发的抗体的方法是通过使用生物体的免疫系统来制备抗体的，因此存在的问题在于该方法需要相对大量的时间和金钱，并且稳定性由于抗体是蛋白质而成为一个问题，然而因为适体可通过相对简单的方法合成。此外，适体可靶向细胞、蛋白质、甚至是小的有机物质。基于能够开发使用所述适体的新的检测方法，并且与已经开发的抗体相比，其特异性和稳定性非常高的事实，因此将DNA适体用于CHIKV E2的特异性检测。任何能够特异性检测CHIKV E2的DNA(ssDNA)或RNA都可属于本发明的适体，并且可优选地包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列，但不限于此。

此外，本发明提供一种用于诊断基孔肯雅热的组合物，该组合物包含DNA适体。

除了DNA适体之外，本发明的组合物还可包括药理学和生理学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。此外，药物组合物可通过根据典型的方法被配制成气雾剂、外用剂、栓剂、无菌注射液和口服制剂诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳液、糖浆的形式来使用。

可包含在组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。当配制组合物时，使用常用的稀释剂或赋形剂例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂来制备组合物。

此外，本发明提供了一种用于诊断基孔肯雅热的试剂盒，该试剂盒包含DNA适配体。

该试剂盒包含特异性结合CHIKV E2的本发明的适体，以及本领域中广泛使用的检测标记，例如生物素残基，可附接至适体。将标记材料引入生物素所附接的适体之后，其分析可用于CHIKV E2的检测、定量和诊断。各种已知的分析标记材料可用作用于生物素的标记材料，并且可以使用例如链霉亲和素、亲和素、Cy3、Cy5、Alexa、BODIPY、罗丹明、Q-dot等进行荧光分析。此外，除了生物素残基之外，用于检测CHIKV E2的适体还可通过诸如其他荧光材料、磁性体、染色材料、酶、放射性同位素等典型的标记材料进行标记，并且可以通过例如荧光显微镜、放射免疫检测(RAID)等的典型检测方式进行检测。

此外，该试剂盒包括多种工具或试剂，其可用于定性或定量地测量是否存在适体与样品中CHIKV E2的结合，并且还可包括载体(基底)、缓冲溶液、反应终止剂、增溶剂、去污剂、稳定剂等。

作为在本发明中固定适体的基底，例如，可使用选自聚合物、玻璃、金、纸和生物膜的基底作为固体基底。更具体地讲，可使用聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、葡聚糖、Sephadex、Sepharose、脂质体、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、辉长岩、滤纸、离子交换树脂、塑料膜、塑料管、聚胺-甲基乙烯基-醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、金属、玻璃、玻璃珠、磁粉等。作为其他固体基底，可使用细胞培养板、ELISA板、管、聚合物膜等。基底可以具有任何可能的形式，例如球形(珠)、圆柱形(试管或内孔表面)和平面形(片材、测试条)，更优选地，可使用多孔板(例如、24孔、96孔、192孔、384孔、576孔等)。

此外，本发明提供了一种用于诊断基孔肯雅热的生物传感器，该生物传感器包括：基孔肯雅热病毒包膜蛋白结构域2(CHIKV E2)特异性DNA适体；以及其上固定DNA适体的基底。

其上固定DNA适体的基底包括表面印刷电极芯片(丝网印刷金电极)的金属电极层和金属纳米粒子层，并且作为电极和纳米粒子的材料，可使用可以被电场或磁场吸引并且可改变电场的特性的任何材料，并且可优选地包括金(Au)，但不限于此。

固定在基底上的DNA适体可与待以双链方式固定在基底上的固定序列杂交，并且特异性结合CHIKV E2的任何DNA适体不限于任一种，并且优选地，DNA适体可以为CV2适体，但不限于此。

此外，固定序列可以通过硫醇-金反应与待固定在基底上的CV2适体杂交，并且优选可以为5'-CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T-(CH

在本发明的示例性实施方案中，作为使用SELEX搜索CHIKV E2的适体的结果，对CV2适体的序列和结构进行了分析和确认(参见实施例1)，利用荧光测量法测定了CHIKV E2与适体之间的结合亲和力(参见实施例2)，并且基于实验结果，进一步制备了具有优异稳定性和结合能力的DNA适体和生物传感器(参见实施例3)，并确认了该生物传感器对CHIKV E2具有优异的特异性，从而确认了该生物传感器可用作提供诊断基孔肯雅热的方法的信息(参见实施例4)。

因此，本发明提供了一种提供用于诊断基孔肯雅热的信息的方法，该方法包括：(a)将受试者样品注入生物传感器中；(b)向在步骤(a)中注入受试者样品的生物传感器中注入包含量子点的检测探针；(c)向在步骤(b)中注入包括量子点的检测探针的生物传感器中注入酸；(d)获得溶液，其中步骤(c)中的量子点与酸彼此反应；以及(e)测量步骤(d)中溶液的电流(安培(A))

用于诊断基孔肯雅热的受试者样品可以为组织、细胞、全血、血液、唾液、痰、脑脊液、尿液等，但不限于此。

此外，随着CHIKV E2结合到生物传感器适体以远离生物传感器，检测探针用更多检测探针填充位置，优选地，检测探针序列为5'-GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGAGCT GC-(CH

此外，量子点还可包含在检测探针中，并且不限于任一种，只要量子点能够与酸反应即可，并且可以为例如硫化镉(CdS)、硫化铅(PbS))等，优选硫化镉，但不限于此。

此外，酸不限于任一种，只要酸能够与量子点反应即可，并且可以为例如硝酸、硫酸、盐酸等，可以优选为硝酸，但不限于此。

下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

1-1.单链DNA(ssDNA)文库的制备

设计了一个合成文库(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3'；SEQ ID NO:1)，其具有90个核苷酸序列，包括两端处用于PCR扩增和克隆的引物结合序列，以及中心的40个随机DNA核苷酸序列。此外，对于PCR扩增和ssDNA制备，使用正向引物(5'-CACCTAATACGACACT ACTAGGA-3'；SEQ ID NO:2)、反向引物(5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'；SEQ ID NO:3)和生物素结合的反向引物(5'-生物素-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3')。此处使用的所有寡核苷酸均由BIONICS Co.,Ltd.(韩国)合成和PAGE纯化。

1-2 CHIKV E2在Ni-NTA磁珠上的固定

使用Dynabeads(Invitrogen，Norway)将纯化的CHIKV E2固定到珠上，所述Dynabeads是磁珠，其表面涂覆有钴以结合蛋白质的His标记。

具体地讲，将溶于100uL蛋白质结合缓冲液(20mM Tris、50mM NaCl、5mM KCl、5mMMgCl

1-3.对CHIKV E2具有特异性的适体选择

为了选择对CHIKV E2具有特异性的适体，进行了使用磁性的特定分离方法。具体地讲，首先，为了形成最稳定的ssDNA结构，将溶于100uL结合缓冲液中的ssDNA文库(500pmol)在90℃培养3分钟，然后在4℃培养30分钟。此后，使文库与固定在磁珠上的CHIKVE2反应1小时，同时轻轻摇动。然后，将珠用结合缓冲液洗涤两次以去除未与结合到CHIKVE2的珠结合的ssDNA。此后，使用洗脱缓冲液(20mM Tris、50mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl

1-4.适体序列分析和结构分析

使用未修饰的正向引物和反向引物通过PCR过程扩增第13次重复选择的ssDNA，将其克隆到pENTR/TOPO载体(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen，USA)，然后转化到大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，USA)中。使用微量提取试剂盒(GeneAll，Korea)纯化其中插入了ssDNA的克隆体，然后分析核苷酸序列(COSMO Genetech，Korea)。结果，可分析下表1中所示的序列。

[表1]

实施例2.使用荧光测量法测量蛋白质和适体之间的结合亲和力

将400pmol CHIKV E2与10uL磁珠混合后，将所得混合物在100uL结合缓冲液(20mMTris、50mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl

[表2]

为了通过实施例1中发现的DNA适体检测CHIKV E2，使用溶出伏安法技术设计了具有优异检测灵敏度的生物传感器。图3是使用本发明的DNA适体检测CHIKV E2的生物传感器的示意图。

5'-GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC-3'

首先将金纳米粒子吸附到丝网印刷金电极(SPGE)芯片的金电极上，然后将其中固定序列(5'-CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T-(CH

CHIKV E2与生物传感器表面探针结合并脱离的越多，检测探针序列占据的位置就越多，并且与硝酸反应的硫化镉(量子点)在溶液中释放大量镉离子。这可在溶出伏安法技术图上作为峰值被观察到，该图以极高的特异性和灵敏度检测金属离子，从而实现信号开启型定量分析。

基于电化学，使用选定的CV2适体检测重组CHIKV E2。结果，如图4A和图4B所示，可确认随着CHIKV E2的浓度增加(1pM至100μM)，电流值增加(参见图4A)。得到y轴为电流值、x轴为换算成Log的CHIKV E2浓度值的图，因此确认上述制造的生物传感器对CHIKV E2进行了定量检测，检测极限为0.10pM(参见图4B)。

由于不与血液中除靶CHIKV E2以外的各种蛋白质反应的结合特异性对于为了将DNA适体用作生物传感器而言是重要的，因此确认了各种蛋白质样品的结合特异性，以便确认DNA适体是否选择性结合。在这种情况下，用PBS进行混合，使得待检测的每种蛋白质的浓度为10nM。

结果，如图5所示，证实对CHIKV E2的特异性是优异的。特别是在对照蛋白中，YFV是类似于CHIKV的传染性热带病毒的表面蛋白，虽然众所周知YFV在传染性热带病之间具有高交叉反应性，但证实了YFV不与本发明开发的DNA适体结合。这意指本发明的DNA适体以高结合特异性与CHIKV E2反应。此外，即使与作为血清蛋白质的HAS相比，本发明的DNA适体也具有高特异性。

综上所述，意味着本发明开发的DNA适体CV2不仅对CHIKV E2具有极高的结合特异性，而且即使在复杂的生物样品中也可用作生物传感器。

作为参考，本发明的序列表如下表3所示。

[表3]

提供本发明的上述描述是出于说明的目的，本发明所属领域的技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，本发明可容易地修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面仅是示例性的而不是限制性的。

[工业实用性]

因为本发明的特异性结合基孔肯雅热病毒包膜蛋白结构域2(CHIKV E2)的DNA适体对CHIKV E2具有强结合亲和力和优异的特异性，因此与使用现有抗体的诊断相比，可显著提高诊断基孔肯雅热病毒的准确度，因此，预期DNA适体可有效用于各种诊断产品，诸如诊断试剂盒和诊断组合物。

<110> MD保健株式会社

浦项工科大学校产学协力团

<120> 与基孔肯雅热病毒包膜蛋白2(CHIKV E2)特异性结合的DNA适体及其用途

<130> MPCT19-122

<150> KR 10-2018-0165203

<151> 2018-12-19

<160> 6

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ssDNA文库

<400> 1

cacctaatac gactcactat agcggatccg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnnn ctggctcgaa caagcttgc 89

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 2

cacctaatac gactcactat agcgga 26

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 3

gcaagcttgt tcgagccag 19

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CV2适体

<400> 4

gcggatccga aatgtgttgt ggttggagct gc 32

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CV2

<400> 5

cacctaatac gactcactat agcggatccg aaatgtgttg tggttggagc tgcataaacc 60

ctttcttccc gctggctcga acaagcttgc 90

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T

<400> 6

cacatttcgg atccgctgac at 22