在脑内出血和蛛网膜下腔出血中的血浆和脑脊液miRNA生物标志物

摘要

在对象中检测、治疗和/或预防蛛网膜下腔出血(SAH)和脑内出血(ICH)或相关炎症应答的方法。用于在对象中检测、治疗和/或预防蛛网膜下腔出血(SAH)和脑内出血(ICH)或相关炎症应答的组合物。

说明书

技术领域

本申请要求于2018年10月17日提交的美国临时申请No.62/747,041的在先申请的优先权权益，其特别地通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及用于检测、诊断和治疗脑出血，例如蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)和脑内出血(intracerebral hemorrhage，ICH)的方法和组合物，以预防、预测和更好地治疗脑出血，包括出血性脑卒中。特别地，描述了新发现的生物标志物以及使用其的新方法。

背景技术

脑卒中发生在当流向部分大脑的血液被切断或显著降低时。没有通过血液携带的氧气，脑细胞可快速死亡，其可导致永久性脑损伤。脑卒中可大可小，并且后果可从完全康复到死亡。有两种类型的脑卒中：缺血性和出血性的。缺血性脑卒中是由于缺乏流向脑组织的血液引起的。这可能发生在当大脑中的动脉因病症例如动脉粥样硬化而变窄时。与缺血性脑卒中相反，出血性脑卒中发生在当大脑中的动脉破裂并导致在周围组织中局部出血时。这种血液排出可扰乱大脑的正常循环，导致脑卒中。出血对大脑造成的损害由出血的大小、颅骨肿胀的程度以及多快控制出血来确定。出血性脑卒中占脑卒中的约13％。需要方法用于检测出血性脑卒中以及区分出血性脑卒中的类型。本公开内容满足了这些需要。

核酸序列

本文公开的核酸序列使用针对核苷酸碱基的标准字母缩写示出。仅示出每个核酸序列的一条链，但互补链被理解为包含在对展示的链的任何引用中。

PC-5p-5858337：GCACCACGTTCCCGTGG(SEQ ID NO：1)

PC-5p-21826568：CGTTCCCGTGGTTCCCGTGG(SEQ ID NO：2)

PC-5p-11153460：TCCACCCGTTCCCGTGG(SEQ ID NO：3)

PC-5p-44512007：CCCGTGGCGGTTCCCGTGG(SEQ ID NO：4)

PC-3P-7630279：TTAGTATATAGGACTAACA(SEQ ID NO：5)

PC-5P-17311950：GAGGATTGGAGAGGTAGC(SEQ ID NO：6)

PC-3p-4244570：TTGGAATCCCAGGTGTTGTTCTC(SEQ ID NO：7)

PC-3p-3144857：GTAGGTAATCTTCAGGCT(SEQ ID NO：8)

PC-5p-6497338：AGGCTAATTGATTTTGAC(SEQ ID NO：9)

PC-5p-3305806：TCTTAGGAAGCGAAGCAAT(SEQ ID NO：10)

附图说明

通过以下详细描述结合附图和所附权利要求，将容易理解实施方案。在附图的图中通过示例而非限制的方式举例说明了实施方案。

图1是两个热图(heat map)，分别示出了在脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和血浆中微RNA(miRNA)的差异表达。

具体实施方式

术语

在以下详细描述中，参考了构成本发明一部分的附图，并且在其中通过可实践的举例说明性实施方案示出。应当理解，在不脱离范围的情况下，可利用另一些实施方案并且可进行结构或逻辑变化。因此，不应将以下详细描述理解为限制性的，并且实施方案的范围由所附权利要求及其等同物限定。

可以以有助于理解实施方案的方式将多种操作描述为多个依次离散操作；然而，描述的顺序不应被解释为暗示这些操作是依赖于顺序的。

出于描述的目的，“A/B”形式或“A和/或B”形式的短语意指(A)、(B)或(A和B)。出于描述的目的，“A、B和C中的至少一个/种”形式的短语意指(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)，或(A、B和C)。出于描述的目的，“(A)B”形式的短语意指(B)或(AB)，即，A是可选要素。

描述可使用术语“实施方案(embodiment或embodiments)”，其可各自指代一个或更多个相同或不同的实施方案。此外，关于实施方案所使用的术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等是同义词，并且通常被认为是“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(include)”应解释为“包括但不限于”等)。

关于本文中任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可如同适合于上下文和/或本申请那样从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，本文可明确地列出多种单数/复数排列。

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可在Benjamin Lewin，Genes IX，由Jones and Bartlet出版，2008(ISBN 0763752223)；Kendrew et al.(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由BlackwellScience Ltd.出版，1994(ISBN0632021829)；以及Robert A.Meyers(编辑)，MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 9780471185710)；以及另一些相似的参考文献中找到。

用于实践或测试本公开内容的合适方法和材料如下所述。这样的方法和材料仅是举例说明的而不认为是限制性的。可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等效的另一些方法和材料。例如，本公开内容所属领域公知的常规方法在多种一般性和更具体的参考文献中进行了描述，包括例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，1992(和2000年的补充)；Ausubel et al.，Short Protocols in MolecularBiology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，第四版，Wiley&Sons，1999；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1990；以及Harlow and Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999。此外，材料、方法和实例仅是举例说明的而不认为是限制性的。

为了便于审查本公开内容的多种实施方案，提供了以下对特定术语的解释：

施用：通过任何有效途径向对象提供或给予药剂，例如治疗剂。示例性施用途径包括但不限于注射(例如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、经口、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内和吸入途径。

药剂：任何蛋白质、核酸分子(包括化学修饰的核酸)、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或另一些感兴趣的分子。药剂可包括治疗剂、诊断剂或药物制剂(pharmaceutical agent)。治疗剂或药物制剂是单独或与另外的化合物一起诱导期望的响应(例如当向对象施用时诱导治疗或预防作用，包括抑制或治疗缺血性事件，例如脑卒中)的药剂。在一些实例中，治疗剂包括在具有脑出血例如蛛网膜下腔出血(SAH)或脑内出血(ICH)的患者中下调的分离的微RNA(miRNA)。

表达的改变：miRNA基因产物的表达的改变是指miRNA基因产物水平的变化或差异，例如提高或降低，例如相对于对照(例如未患脑出血的对象)其在生物样品(例如来自对象的样品，如血清样品)上可检出。表达的“改变”包括表达的提高(上调)或表达的降低(下调)。在一些实例中，表达的改变包括在miRNA基因中编码的信息向miRNA基因产物的转化中的变化或差异，例如提高或降低。在一些实例中，差异与对照或参考值(例如来自健康对照对象的样品中的miRNA表达量)有关。

反义化合物：与和其杂交的靶核酸分子(例如miRNA)的区域至少部分互补的寡聚化合物。如本文所用，对靶核酸分子“具有特异性”的反义化合物是与靶核酸分子特异性杂交并调节靶核酸分子表达的一种反义化合物。如本文所用，“靶”核酸是反义化合物被设计用于特异性杂交并调节表达的核酸分子。在一些实例中，靶核酸分子是miRNA基因产物。

反义化合物的非限制性实例包括引物、探针、反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、shRNA和核酶。因此，这些化合物可作为单链、双链、环状、支链或发夹化合物引入，并且可包含结构元件，例如内部或末端凸起或环。双链反义化合物可以是杂交形成双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性以允许杂交并形成完全或部分双链化合物的单链。在本文的具体实例中，反义化合物是反义寡核苷酸、siRNA或核酶。

在一些实例中，反义化合物是“反义寡核苷酸”。反义寡核苷酸是单链反义化合物，其是基于核酸的寡聚体。反义寡核苷酸可包含对糖、碱基和/或核苷间键联的一种或更多种化学修饰。通常，反义寡核苷酸是“DNA样”的，如此当反义寡核苷酸与靶RNA分子杂交时，该双链体被RNA酶H(识别DNA：RNA双链体的酶)识别，导致RNA的切割。

在一些实施方案中，反义化合物是miRNA模拟物，例如以补充这样的miRNA的丧失以重建对基因调节的控制。还考虑了miRNA的抑制剂。

阵列：在底物上或底物中的可寻址位置中的分子，例如生物大分子(这样的核酸分子，例如探针)的排列。“微阵列”是微型化以便需要显微镜检查或由显微镜检查辅助用于评价或分析的阵列。阵列有时被称为DNA芯片或生物芯片。

分子阵列(“特征”)使得一次对样品实施非常大量的分析成为可能。在某些实例阵列中，一种或更多种分子(例如寡核苷酸探针)将在阵列上出现多次(例如两次)，例如以提供内部对照。阵列上可寻址位置的数目可变化，例如至少2、至少5、至少10、至少14、至少15、至少20、至少30、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少500、至少550、至少600、至少800、至少1000、至少10,000或更多个。在一个特定实例中，阵列包括5至1000个可寻址位置，例如10至100个可寻址位置。在一些特定实例中，阵列基本上由针对本文讨论的miRNA基因产物具有特异性的探针或引物(例如允许扩增的那些)组成。

在阵列内，每个阵列样品都是可寻址的，因为它的位置可在阵列的至少两个维度内可靠且一致地确定。阵列上的特征应用位置可假定不同的形状。例如，阵列可以是规则的(例如以统一的行和列排列)或不规则的。因此，在有序阵列中，每个样本的位置在其应用于阵列时被分配给该样本，并且可提供密钥以便将每个位置与适当的目标或特征位置相关联。通常，有序阵列以对称网格模式排列，但样本可以以另一些模式(例如以径向分布的线、螺旋线或有序簇)排列。可寻址阵列通常是计算机可读的，因为计算机可被编程以将阵列上的特定地址与关于该位置上的样品的信息(例如杂交或结合数据，包含例如信号强度)相关联。在计算机可读格式的一些实例中，可通过计算机与地址信息相关联的阵列中的个体特征有规律地排列，例如以笛卡尔(Cartesian)网格模式排列。

生物样品：从对象中获得的包含基因组DNA、RNA(包括mRNA和微RNA)、蛋白质或其组合的生物样品。实例包括但不限于唾液、外周血、尿液、组织活检、手术样品和尸检材料。在一些实施方案中，生物样品是血液或其组分，例如血浆或血清。在一些实施方案中，生物样品是脑脊液(CSF)。

cDNA(互补DNA)：一段缺乏内部非编码区段(内含子)和确定转录的调节序列的DNA。可通过从细胞中提取的RNA逆转录合成cDNA。

接触：直接物理结合的放置，包括固体和液体形式二者。药剂与细胞的接触可通过将药剂添加至分离的细胞而在体外发生，或者通过将药剂施用于对象而在体内发生。

对照：“对照”是指用于与测试样品，例如从对象或患者(或多个患者)中获得的样品进行比较的样品或标准。在一些实施方案中，对照是从健康患者(或多个患者)中获得的样品(本文也称为“正常”对照)。在一些实施方案中，对照是历史对照或标准值(例如先前测试的对照样品或代表基线或正常值的样品组，例如正常对象或无脑出血的对象的基线或正常值)。在一些实例中，对照是代表从多个患者样品中获得的平均值(或值的平均范围)(例如来自正常患者的miRNA表达的平均值或值的范围)的标准值。

降低或下调：降低某物的质量、数量或强度。在一些实例中，当用于指核酸分子(例如rniRNA)的表达时，降低或下调是指导致基因产物的产生降低的任何过程。基因下调包括在基因产物的产生中任何可检出的降低。在某些实例中，与对照相比，miRNA产生或降低了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍。

诊断：通过疾病的体征、症状和/或多种测试的结果来识别疾病的过程。通过该过程得出的结论也被称为“诊断”。通常进行的测试形式包括血液测试、医学成像、基因分析、尿分析、活检和本文公开的方法。

诊断显著量：如本文所用，“诊断显著量”是指在生物样品中miRNA基因产物的水平或其比率的提高或降低足以允许将一个患者群体与另一个患者群体(例如患有脑出血的对象与未患有脑出血的对象)区分开来。在一些实施方案中，诊断上显著的提高或降低是相对于对照至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍。在一些实施方案中，诊断上显著的提高或降低是相对于对照两种或更多种生物标志物的比率变化至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍。

有效量：足以产生期望响应，例如降低或抑制与病症或疾病相关的一种或更多种体征或症状的药剂的量。当向对象施用时，通常使用将达到目标组织浓度的剂量。在一些实例中，“有效量”是治疗任何病症或疾病的一种或更多种症状和/或根本原因的量。

测量表达水平：如本文所用，测量特定miRNA的表达水平是指量化在样品中存在的miRNA的量。量化可以是数字的或者相对的。可使用本领域已知的或本文所述的任何方法，例如通过RT-PCR，来完成miRNA的表达的检测。检测miRNA的表达包括检测miRNA的成熟形式或与miRNA表达相关的前体形式(即pri-miRNA或pre-miR)的表达。通常来说，miRNA检测方法涉及序列特异性检测，例如通过RT-PCR。可使用本领域已知和本文公开的前体和成熟miRNA核酸序列设计miRNA特异性引物和探针。

在一些实施方案中，检测到的变化是与对照，例如参考值或健康对照对象相比表达的提高或降低。在一些实例中，检测到的提高或降低是与对照或标准相比至少两倍的提高或降低。用于与样品进行比较以确定差异表达的对照或标准，包括被认为是正常的样品以及实验室值(例如，值的范围)，即使可能是任意设置的，仍记住这样的值在实验室与实验室之间可不同。

标记：能够例如通过ELISA、分光光度法、流式细胞术或显微镜术进行检测的药剂。例如，标记可连接到核酸分子或蛋白质(间接地或直接地)，从而允许检测核酸分子或蛋白质。标记的实例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。例如在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，New York，1989)和Ausubel等(In Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York，1998)中讨论了标记的方法以及选择适合于多种目的的标记的指导。

引物：短核酸分子，例如长度为10至100个核苷酸(例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸)的DNA寡核苷酸。引物可通过核酸杂交退火至互补的靶核酸链，以在引物和靶核酸链之间形成杂交体(hybrid)。引物可用于核酸序列的扩增，例如通过PCR或本领域已知的另一些核酸扩增方法。

探针：核苷酸的短序列，例如长度为至少8、至少10、至少15、至少20或至少21个核苷酸，其用于通过分子杂交检测互补序列的存在。在一些特定实例中，寡核苷酸探针包括允许检测寡核苷酸探针：靶序列杂交复合物的标记。实验室标准和值可基于已知或确定的群体值来设置，并且可以以允许比较经测量的、实验确定的值的图表或表格的形式提供。

微RNA(miRNA或miR)：调节在植物、动物和病毒中基因表达的单链RNA分子。编码微RNA的基因被转录以形成初级转录物微RNA(pri-miR)，其被加工形成短茎环分子，称为前体微RNA(pre-miR)，随后通过内切核苷酸的切割以形成成熟微RNA。成熟微RNA长度为约21至23个核苷酸，并且与一种或更多种靶信使RNA(mRNA)的3′UTR部分互补。术语“微RNA基因产物”包括pri-miR、pre-miR和成熟微RNA(包括被称为miR*的小成熟miRNA种类)。微RNA通过促进靶mRNA的切割或通过阻断细胞转录物的翻译来调节基因表达。

患者或对象：包括人和非人动物，例如具有动脉斑块的那些的术语。在一个实例中，患者或对象是哺乳动物，例如人。“患者”和“对象”在本文中可互换使用。

可药用载体：可用于本公开内容的可药用载体(载剂)是常规的。E.WMartin的Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版(1995)描述了适用于药物递送的一种或更多种治疗化合物、分子或药剂的组合物和制剂。

一般而言，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为载剂。针对固体组合物(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇月桂酸酯。

小干扰RNA(siRNA)：通过RNAi途径调节基因表达的双链核酸分子(参见，例如，Bass，Nature 411：428-9，2001；Elbashir et al.，Nature 411：494-8，2001；以及PCT出版物NO.WO 00/44895；WO 01/36646；WO 99/32619；WO 00/01846；WO 01/29058；WO 99/07409；以及WO 00/44914)。siRNA分子的长度通常为20至25个核苷酸，在每个3′末端具有2个核苷酸的突出端。然而，siRNA也可以是平末端的。通常来说，siRNA分子的一条链与靶核酸，例如靶miRNA至少部分互补。siRNA也被称为“小抑制性RNA”、“小干扰RNA”或“短抑制性RNA”。如本文所用，siRNA分子不必限于仅包含RNA的那些分子，而是还包含化学修饰的核苷酸和具有RNAi能力或活性的非核苷酸。在一个实例中，siRNA分子是降低或抑制miRNA基因产物的生物活性或表达的一种分子。

治疗疾病：指在疾病或病理的病症开始发生之后改善其体征或症状的治疗干预的短语。

上调或激活：当用于指代核酸分子(例如miRNA)的表达时，是指导致基因产物的产生提高的任何过程。在本公开内容的上下文中，基因产物可以是初级转录物ncRNA、前体ncRNA或成熟ncRNA，例如miRNA。基因上调或激活包括任何这些分子的任何可检测的提高。在某些实例中，与对照相比，ncRNA例如miRNA的产生提高了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍。

脑卒中：一种流向大脑的血液不足导致细胞死亡的医学病症。脑卒中有两种主要类型：由于缺乏血流的缺血性脑卒中，以及由于出血的出血性脑卒中。出血性脑卒中的两种类型是脑内(在脑内)出血或蛛网膜下腔出血。蛛网膜下腔出血(SAH)是出血进入蛛网膜下腔——蛛网膜和脑周围软脑膜之间的区域。SAH可由于头部受伤或自发发生，通常来自脑动脉瘤破裂。每年自发性SAH在约10,000分之1的人中发生，并且占所有脑卒中的约5％。脑内出血(ICH)：是在脑组织自身内部的出血。ICH占脑卒中的约5％。

数个实施方案的概述

蛛网膜下腔出血(SAH)和脑内出血(ICH)与不同的临床结局以及脑脊液(CSF)和血浆(PL)中可能不同的miRNA谱相关。微RNA(miRNA)是基因表达的关键转录后调节因子。miRNA调节基因表达和蛋白质翻译，并且因此可为治疗靶标提供新的场所。miRNA是非编码RNA(ncRNA)，是通过其靶转录物(mRNA)的降解或翻译抑制来负调节基因表达的一类新的内源性小RNA。

近期评价miRNA在脑损伤病理生理学中的作用的调查表明，miRNA谱与脑血管疾病，例如缺血性和出血性脑卒中相关而变化。与ICH患者中的血液相比，一些miRNA在CSF中显示出差异表达。在自发性ICH中循环miRNA与SAH之间的关系尚不清楚。如本文所公开的，本发明人已确定了具有急性自发性ICH和SAH的患者的CSF和血液(血浆)中miRNA表达谱的差异。

在CSF中，鉴定了在对照中高表达但在SAH和ICH中降低的21种已知的和4种新的miRNA(表1；图1)。在血浆中，与对照相比，SAH和ICH中的11种miRNA下调。在SAH与ICH的CSF中，发现5种miRNA在SAH中的水平高于在ICH中的水平。在血浆中，仅鉴定出1种显著的miRNA。通路富集分析发现在SAH和ICH的CSF中针对上调的miRNA的轴突导向以及针对下调的miRNA的细胞黏附。在血浆中，发现了针对Ras信号、轴突导向、血小板激活和血友病细胞黏附的富集。

临床上，在表现出脑卒中症状或与脑卒中相关的风险因素，例如高血压的对象中测量这些miRNA，具有确定患者是否患有脑出血，例如SAH和ICH，和/或区分SAH和ICH的优势。做出这些确定的能力可极大地改善患者结局并促进正确的治疗。例如，明确区分出血性脑卒中和缺血性脑卒中的能力可确定是否给予重组组织纤溶酶原激活剂(tPA)或用于修复受损血管的手术干预是否是优选的治疗过程。迅速诊断方法，例如本文公开的，将具有最小化诊断延迟和改善结局的潜力。它还为卫生系统节省了极大的成本，因为它将在昂贵的临床检查(包括头部的计算机断层扫描(CT)、颈部和脑的核磁共振成像(MRI)、CT血管造影等)之前鉴定脑卒中的来源。与发明人的发现一致，发明人开发了用于识别和测量生物标志物以预测和/或检测出血性脑卒中，例如SAH和ICH，和/或区分SAH和ICH的新方法。此外，基于发明人的发现开发了治疗方法、测定、试剂盒等。

检测脑出血的方法

如本文所公开，如下表1、2、3和/或4中公开的miRNA的表达水平差异可用于诊断脑出血，例如ICH和SAH中的一种或更多种。因此，本文提供了包括测量对象获得的脑脊液样品和/或血浆液样品中在表1、2、3和/或4中所列的至少一种miRNA的方法，其中所述至少一种miRNA包含PC-5P-585_8337、PC-5P-218_26568、PC-5P-1115_3460或PC-5P-445_12007中的至少一种。在一些实施方案中，所述方法还包括选择患有或被认为患有脑卒中的对象。在一些实施方案中，所述方法用于诊断患有脑卒中的对象或对其进行预后。在一些实施方案中，所述方法是诊断患有蛛网膜下腔出血(SAH)和脑内出血(ICH)的对象的方法。

在一些实施方案中，至少一种miRNA还包含hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2m hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p和hsa-miR-92b-3p中的一种或更多种，并且测量包括测量在脑脊液样品中hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、hsa-miR-191-5p的表达的提高，和/或在脑脊液样品中hsa-miR-21-5p、PC-5p-585_8337、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460或PC-5p-445_12007hsa-miR-204-5p、hsa-miR-126-3p_R-1的降低。

在一个实施方案中，至少一种miRNA还包含hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2m hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p和hsa-miR-92b-3p中的一种或更多种，并且测量包括测量在血浆液样品中hsa-miR-423-5p、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-5858337、hsa-miR-92b-3p、和PC-5p-445_12007、或hsa-let-7b-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2的表达的提高，和/或在血浆液样品中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、PC-5p-218_26568、和PC-5p-1115_3460、hsa-miR-486-5p的降低。

在一些实施方案中，所述方法包括将hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3D、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中的一种或更多种的表达与对照相比较。

在一些实施方案中，miR-hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007的表达用分别与hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-5858337、hSa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007或其扩增产物特异性结合的探针和/或引物进行检测。在一些实施方案中，探针和/或引物用可检测标记进行标记。在一些实施方案中，测量PC-3P-7630_279、PC-5P-1731_1950、PC-3P-4244_570、PC-3p-3144_857、PC-5p-6497_338、PC-5p-3305_806中的一个或更多个的表达。

在一些实施方案中，在脑脊液(CSF)中hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-92b-3p或PC-5p-218_26568中的一种或更多种的表达相对于对照提高，表明对象具有SAH或者处于发生SAH的风险中。在一些实施方案中，在CSF中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-126-3p_R-1、PC-5p-585_8337、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460或PC-5p-445_12007中的一种或更多种的表达相对于对照降低，表明对象具有SAH或者处于发生SAH的风险中。在一些实施方案中，在CSF中ICH hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-15la-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-92b-3p和PC-5p-218_26568中的一种或更多种的表达相对于对照提高，表明对象具有ICH或者处于发生ICH的风险中。在一些实施方案中，在CSF中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-126-3p_R-1、PC-5p-585_8337、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460或PC-5p-445_12007中的一种或更多种相对于对照降低，表明对象具有ICH或者处于发生ICH的风险中。

在一些实施方案中，所述方法还包括区分SAH或ICH，其中在CFS中hsa-miR-204-5p的表达相对于对照提高表明是SAH，并且hsa-miR-204-5p的表达相对于对照降低表明是ICH；并且其中在血浆中hsa-miR-486-5p的表达相对于对照提高表明是SAH，并且hsa-miR-486-5p的表达相对于对照降低表明是ICH，并且hsa-let-7b-5p的表达相对于对照降低表明是SAH，并且hsa-let-7b-5p的表达相对于对照提高表明是ICH。在一些实施方案中，在血浆中hsa-miR-423-5p、hSa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p和PC-5p-445_12007中的一种或更多种的表达相对于对照提高，表明对象具有SAH或者处于发生SAH的风险中。在一些实施方案中，在血浆中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、PC-5p-218_26568和PC-5p-1115_3460中的一种或更多种的表达相对于对照降低，表明对象具有SAH或者处于发生SAH的风险中。在一些实施方案中，在血浆中ICH hsa-miR-423-5p、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p hsa-miR-191-5p、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p和PC-5p-445_12007中的一种或更多种的表达相对于对照提高，表明对象具有ICH或者处于发生ICH的风险中。在一些实施方案中，在CSF中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、PC-5p-218_26568和PC-5p-1115_3460中的一种或更多种的表达相对于对照降低，表明对象具有ICH或者处于发生ICH的风险中。在一些实施方案中，在ICH患者的血浆和CSF中检测到并且在SAH样品的血浆或CSF中未检测到的miRNA包含PC-3P-7630_279、PC-5P-1731_1950或PC-3P-4244_570中的一种或更多种。在血浆和/或CSF中这些miRNA的存在表明是ICH病理，且不是SAH病理。在一些实施方案中，在ICH患者的血浆或CSF中未检测到，但在SAH的血浆/CSF和对照的血浆/CSF样品中检测到的miRNA包含PC-3p-3144_857、PC-5p-6497_338或PC-5p-3305_806中的一种或更多种。在血浆和CSF中这些微RNA的缺失表明是ICH。

除了能够检测或确定对象是否处于发生脑出血(例如ICH和SAH)的风险中之外，如下表1和2中公开的miRNA的表达水平差异还可用于区分ICH和SAH。在一些实施方案中，所述方法还包括区分SAH或ICH。在一些实施方案中，在CFS中hsa-miR-204-5p相对于对照的表达可用于区分SAH与ICH，例如，在SAH中hsa-miR-204-5p的表达相对于对照提高，并且相反地，在ICH中其相对于对照降低。在一些实施方案中，在血浆中hsa-miR-486-5p相对于对照的表达可用于区分SAH与ICH，例如，在SAH中hsa-miR-486-5p的表达相对于对照提高，并且相反地，在ICH中其相对于对照降低。在一些实施方案中，在血浆中hsa-miR-320a_R-2和/或hsa-miR-320a_R-2相对于对照的表达可用于区分SAH与ICH，例如，在SAH中hsa-miR-320a_R-2和/或hsa-miR-320a_R-2的表达相对于对照降低，并且相反地，在ICH中其相对于对照提高。

在所述方法的一些实施方案中，miRNA基因产物表达的诊断上显著的提高或降低是例如相对于对照的水平至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍的提高或降低。在一些实例中，一种miRNA与另一种miRNA的比率为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、60、70、80、100或者甚至更大。因此，在一些实施方案中，一种miRNA与另一种miRNA的比率为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、60、70、80、100或者甚至更大，其被用作对照阈值，高于该阈值就诊断或检测到脑出血，例如SAH和ICH。

此外，本文公开的方法可用于寻找另一些生物标志物以预测和/或检测脑出血，例如SAH和ICH。由于在对象中的不同血容量，比较血清中miRNA的绝对或相对浓度是复杂的。为了克服这个问题，可使用归一化策略来确定一种感兴趣的miRNA与另一种的相对浓度(比率)。在该方法中，归一化循环阈值(ΔC

其中：

C

C

归一化的比率可使用以下等式确定：ΔC

其中：

C

C

C

C

受试ΔC

检测和测量miRNA表达的方法是本领域已知的并且在下面详细描述。在一些实例中，RT-PCR用于测量miRNA的水平，例如在分析单个miRNA时。在另一些情况下，当要测量多个miRNA基因产物时，可能期望使用微阵列分析。

测量的miRNA基因产物可以是初级miRNA(pti-miR)、前体miRNA(pre-miR)或成熟miRNA(包括表示为miR*的小成熟miRNA产物)。在一些实例中，核酸序列或者其或测量或确定的子序列如上SEQ ID NO；1至4所示。

在所述方法的一些实施方案中，生物样品是血液或其组分，例如血浆或血清。在一些实例中，生物样品是脑脊液。因此，一些实例中的方法包括从用本文提供的方法诊断或治疗的患者中获得合适的样品。

在一些实施方案中，所述方法还包括针对被诊断为具有脑出血，例如SAH和ICH的对象提供合适的治疗。在一些实例中，治疗包括施用分离的miRNA基因产物，例如已被鉴定为在脑出血，例如SAH和ICH中相对于对照下调的miRNA基因产物。在一些实例中，治疗包括施用抑制miRNA基因产物表达的药剂，例如抑制鉴定为在脑出血，例如SAH和ICH中相对于对照上调的miRNA基因产物的药剂。在另一些实例中，治疗包括向对象施用降低血压的药剂。在一些实施方案中，治疗包括手术干预或推荐的本领域已知的这样的干预。

在一些实施方案中，所述方法包括选择患有或被认为患有脑卒中的对象。在一些实施方案中，所述方法用于诊断或预测具有脑卒中的对象。在一些实施方案中，所述方法包括选择患有或被认为患有脑出血，或处于这样的脑卒中的风险中的对象。

在一些实施方案中，一旦确定了患者的诊断，就可向临床医生或其他护理员展示和/或传达该诊断的指示。例如，测试结果以提供关于测试结果的信息的可感知的输出提供给用户(例如临床医生或另一些健康护理工作者、实验室人员或患者)。在一些实例中，输出是纸质输出(例如，书面或打印输出)、屏幕上的显示、图形输出(例如，图形、图表、伏安曲线或另一些图表)或可听的输出。在另一些实例中，输出是数值，例如样品中miRNA表达的量或者与对照相比样品中miRNA的相对量。在一些实例中，数值是一种或更多种miRNA与一种或更多种另一些miRNA的表达的比率。在另一些实例中，输出是图形表示，例如在标准曲线或ROC上的表达和/或表达的比率的图。在一个特定实例中，输出(例如图形输出)显示或提供表明存在脑出血(例如SAH或ICH)的截止值或水平。在一些实例中，输出传达给用户，例如通过经由物理、可听或电子方式(例如通过邮件、电话、传真传输、电子邮件或与电子病历的通信)提供输出。输出可提供定量的信息。在一些实例中，输出伴随有用于解释数据的指南，例如表明存在或不存在脑出血的数字或另一些限制。指南不需要详细说明脑出血的存在与否，尽管其可包含这样的诊断。例如，输出可包含正常或异常范围或截止值，然后输出的接收者可使用其来解释结果，例如，以得出诊断、预后或治疗计划。在另一些实例中，输出可提供推荐的治疗方案。在一些实例中，测试可包括确定另一些临床信息。

在一些实施方案中，根据患者的诊断，所公开的诊断方法包括以下一种或更多种：a)如果患者的确定诊断被认为是针对脑出血(例如SAH或ICH)阳性的，则为患者开出治疗方案；b)如果患者的确定诊断被认为是针对脑出血(例如SAH或ICH)阴性的，则不为患者开出治疗方案；c)如果患者的确定诊断被认为是针对脑出血(例如SAH或ICH)阳性的，则向患者施用治疗；以及d)如果患者的确定诊断被认为是针对脑出血(例如SAH或ICH)阴性的，则不向患者施用治疗方案。在一个替代实施方案中，所述方法可包括推荐a)至d)中的一个或更多个。因此，公开了在对象中治疗脑出血(例如SAH或ICH)的方法。

试剂盒及测定

还提供了包含对miRNA基因产物(例如本文所述的那些)具有特异性的至少两种寡核苷酸探针和/或引物的试剂盒和测定。在一些实施方案中，探针和/或引物用可检测标记进行标记。在一些实施方案中，试剂盒和测定包含对hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-44512007具有特异性的至少两种寡核苷酸探针。在一些实例中，试剂盒和测定包含对照(例如阳性和阴性对照)。在一些实例中，探针和/或引物存在于阵列中。在一些实施方案中，试剂盒和测定包含用于其使用的说明。在一些实施方案中，探针存在于阵列中。在一些实施方案中，阵列包含含有核酸序列的核酸，所述核酸序列具有如SEQ ID NO：1、2、3或4之一所示的核酸序列或与其互补的核酸序列。

检测miRNA表达

如下所述，与脑出血(例如SAH或ICH)相关的一种或更多种miRNA的表达可使用本领域中公知的多种方法中的任一种来检测。在本文提供的方法的一些实施方案中，miRNA表达谱用于诊断脑出血(例如SAH或ICH)，并且预测预后并开发针对具有脑出血(例如SAH或ICH)的患者的潜在治疗。因此，所公开的方法可包括评价miRNA，例如hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007。

前体miRNA的序列是公开可用的，例如通过miRBase数据库，其由曼彻斯特大学(University of Manchester)可在线获得，并且以前由Sanger Institute(参见Griffiths-Jones et al.，NucleicAcids Res.36：D154-D158，2008；Griffiths-Jones etal.，Nucleic Acids Res.34：D140-D144，2006；以及Griffiths-Jones，Nucleic AcidsRes.32：D109-D111，2004)和

本领域已知的用于检测感兴趣的基因(包括miRNA)表达的多种方法中的任一种可用于检测miRNA的表达。这些方法中的多种，包括qRT-PCR、阵列、微阵列、SAGE，在下面进一步详细描述。miRNA表达的检测和量化可通过本领域已知的多种方法中的任一种，包括本文所述的那些来实现。美国专利申请公开No.2006/0211000和2007/0299030描述了miRNA检测和量化的方法。此外，RNA提取的一般方法是本领域中公知的并且在包括Ausubel et al.，Current Protocols of Molecular Biology，John Wiley and Sons(1997)的分子生物学的标准教科书中公开。使用感兴趣的miRNA的已知序列，可设计特异性探针和引物以在适当时用于本文所述的检测方法中。

在一些情况下，miRNA检测方法需要从样品，例如血液或CSF样品，例如血清样品中分离核酸。可使用本领域已知的任何合适的技术来分离核酸，包括RNA，并且特别是miRNA。

miRNA的微阵列分析可根据本领域已知的任何方法完成(参见，例如，PCT公开No.WO 2008/054828；Ye et a1.，Nat.Med.9(4)：416-423，2003；Calin et al.，N.Engl.J.Med.353(17)：1793-1801，2005)。在一个实例中，从样品中提取RNA，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA中按大小选择小RNA(18至26个核苷酸的RNA)。寡核苷酸接头连接到小RNA的5′和3′末端，并且所得连接产物用作用于进行10个扩增循环的RT-PCR反应的模板。有义链PCR引物具有连接到其5′末端的荧光团，从而对PCR产物的有义链进行荧光标记。PCR产物变性，并且然后与微阵列杂交。PCR产物，被称为与阵列上相应的miRNA捕获探针序列互补的靶核酸，将通过碱基配对与捕获探针所固定的点杂交。当使用微阵列激光扫描仪激发时，该点将随后发荧光。然后根据特定miRNA的拷贝数使用多种阳性和阴性对照以及阵列数据归一化方法来评价每个点的荧光强度，这将导致对特定miRNA的表达水平的评估。

在一个替代方法中，从细胞、生物流体或组织样品中提取的含有miRNA的总RNA被直接使用而无需对小RNA进行大小选择，并且使用T4 RNA连接酶和荧光标记的短RNA接头进行3′末端标记。通过在30℃下孵育2小时，随后在80℃下加热灭活T4 RNA连接酶5分钟来标记RNA样品。与阵列上相应的miRNA捕获探针序列互补的荧光团标记的miRNA将通过碱基配对与捕获探针所固定的点杂交。实施微阵列扫描和数据处理。

量化RNA(包括miRNA)的方法是本领域中公知的。在一些实施方案中，所述方法利用RT-PCR。通常来说，通过RT-PCR进行基因表达谱分析的第一步是将RNA模板逆转录为cDNA，随后在PCR反应中进行其指数扩增。两种常用的逆转录酶是禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。然而，本领域已知的任何合适的逆转录酶均可用于RT-PCR。逆转录步骤通常使用特定引物、随机六聚体或寡dT引物来启动，这取决于环境和表达谱分析的目标。例如，可按照制造商的说明，使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer，CA)对提取的RNA进行逆转录。然后，得到的cDNA可用作后续PCR反应中的模板。

尽管PCR步骤可使用多种热稳定DNA依赖性DNA聚合酶，但它通常使用具有5′-3′核酸酶活性但缺乏3′-5′校对核酸内切酶活性的Taq DNA聚合酶。

为了使错误和样品间变化的影响最小化，可使用内标进行RT-PCR。理想的内标在不同组织间以恒定水平表达，并且不受实验处理的影响。通常用于归一化基因表达模式的RNA是管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白和18S核糖体RNA的mRNA。

可用于扩增特定miRNA的引物可根据公知的方法使用公开可用的miRNA序列以及本文提供的序列来设计和合成。

SAGE是另一种允许同时并量化分析大量基因转录物，而不需要为每个转录物提供单独的杂交探针的方法。首先，生成包含足够的信息来唯一地识别转录物的一个短序列标签(大约10至14个碱基对)，前提是该标签是从每个转录物中的唯一位置获得的。然后，许多转录物连接在一起形成长序列分子，可对其进行测序，同时暴露多个标签的身份。可通过确定单个标签的丰度并鉴定与每个标签对应的基因来量化地评价任何转录物群体的表达模式(参见，例如，Velculescu et al.，Science 270：484-7，1995；以及Velculescu et al.，Cell 88：243-51，1997)。

在本文提供的特定实施方案中，阵列可用于评价miRNA表达，例如检测脑出血，例如SAH或ICH。当描述包含对特定miRNA集具有特异性的探针或引物的阵列时，这样的阵列包含对所述miRNA(例如hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007)具有特异性的探针或引物，并且还可包含对照探针(例如以确认孵育条件足够)。在一个实例中，阵列是多孔板(例如，98或364孔板)。在一些实施方案中，探针和/或引物用可检测标记，例如荧光团、同位素、酶或任何其他可检测的部分进行标记。

调节miRNA表达用于治疗或预防脑出血

本文公开了许多miRNA在具有脑出血(例如SAH或ICH)或者遭受这种脑出血(例如SAH或ICH)的患者中差异表达。因此，具有脑出血(例如SAH或ICH)的患者中下调的一种或更多种miRNA水平的提高，或者具有脑出血(例如SAH或ICH)或者遭受这种脑出血(例如SAH或ICH)的患者中上调的一种或更多种miRNA水平的降低，可有益于抑制脑出血的发生或进展和/或有益于缓解与脑出血相关的一种或更多种体征或症状。

不希望被理论束缚，认为一种或更多种miRNA基因产物水平的改变可导致这些miRNA的一种或更多种预定靶标的失调，这可导致不良影响，例如炎症反应。因此，改变miRNA基因产物的水平(例如，通过提高上调的miRNA的水平或通过降低下调的miRNA的水平)可成功地治疗或改善疾病的一种或更多种体征或症状，例如治疗或改善与脑出血相关的一种或更多种体征或症状。

本文提供了通过向患者施用治疗有效量的抑制miRNA基因产物表达的药剂来治疗具有脑出血或遭受这样的脑出血的患者的方法，所述miRNA基因产物与对照(例如健康对照对象)相比，在具有脑出血(例如SAH或ICH)或遭受这样的脑出血的患者中上调。公开了在对象中治疗和/或预防脑出血(例如SAH或ICH)或相关炎症应答的方法，其包括向对象施用有效量的改变hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中的一种或更多种的表达的药剂，从而治疗脑出血(例如SAH或ICH)；和/或施用提高hsa-miR-21-5p、hsa-miR-126-3p_R-1、PC-5p-218_26568和PC-5p-1115_3460中至少一种的表达的药剂。在一些实例中，抑制miRNA基因产物表达的药剂是对hsa-miR-423-5p、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-92b-3p具有特异性的反义化合物，例如反义寡核苷酸、siRNA或核酶。

在一些实施方案中，在对象中治疗和/或预防蛛网膜下腔出血(SAH)和脑内出血(ICH)或相关炎症应答的方法包括向对象施用有效量的改变hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中的一种或更多种的表达的药剂，从而治疗动脉斑块脑出血。在一些实施方案中，药剂降低hsa-miR-423-5p、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-92b-3p的表达。在一些实施方案中，药剂是对hsa-miR-423-5p、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-92b-3p中的一种具有特异性的反义化合物。在一些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸、siRNA或核酶。在一些实施方案中，所述方法包括施用提高hsa-miR-21-5p、hsa-miR-126-3p_R-1、PC-5p-218_26568和PC-5p-1115_3460中至少一种的表达的药剂。在一些实施方案中，药剂包含hsa-miR-21-5p、hsa-miR-126-3p_R-1、PC-5p-218_26568和PC-5p-1115_3460中的一种或更多种，例如如SEQ ID NO：1、2、3或4之一所示的核酸。

如本文所用，“抑制miRNA基因产物的表达”意指处理后miRNA基因产物的前体和/或活性成熟形式的产生小于处理前产生的量。表达可通过降低产生的水平或降低存在的量以降低水平来改变。本领域技术人员可使用本领域已知和本文所述的技术容易地确定在对象中是否miRNA表达被抑制。抑制可发生在基因表达水平上(即，通过抑制编码miRNA基因产物的miRNA基因的转录)或者加工水平上(例如，通过抑制miRNA前体加工为成熟miRNA)。

如本文所用，抑制miRNA表达的化合物的治疗有效量是足以导致生物学作用的量(例如缓解脑的一种或更多种体征或症状。例如，药剂可将靶miRNA的表达水平降低或提高期望的量，例如相对于对照或参考值降低或提高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍。

本领域技术人员可通过考虑数种因素，例如对象的大小和体重；疾病进展的程度；对象的年龄、健康状况和性别；施用途径；以及施用是否是局部的或全身性的，来容易地确定待向给定对象施用的药剂的治疗有效量。本领域技术人员还可容易地确定用于向对象施用抑制miRNA基因产物表达的药剂的合适的剂量方案。

在一些实施方案中，向需要治疗的对象施用抑制miRNA基因产物表达的单一药剂。在另一些实施方案中，向对象施用抑制miRNA基因产物表达的两种或更多种药剂(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多种)。当向对象施用两种或更多种药剂时，药剂可同时施用(或快速连续施用，例如彼此相隔几分钟内)，或者其可在不同时间施用。例如，可间隔一小时、十二小时、一天、两天、五天、一周、两周或一个月施用两种或更多种药剂。

抑制miRNA基因产物表达的药剂可以是任何类型的化合物，例如但不限于核酸分子、多肽、抗体或小分子，其能够抑制一种或更多种miRNA基因产物的表达。在一些实施方案中，药剂是反义化合物。

任何类型的特异性靶向miRNA基因产物的反义化合物都被计划用于抑制靶miRNA基因产物的表达。在一些实例中，药剂是选自反义寡核苷酸、siRNA或核酶的反义化合物。设计、制备和使用反义化合物的方法在本领域技术人员的能力内。此外，针对公开的miRNA基因产物的序列是公开可用的。通过设计与靶核苷酸序列，例如pri-miRNA、pre-miRNA或成熟miRNA序列互补的化合物，可制备特异性靶向差异表达的miRNA(或另一些靶核酸)的反义化合物。反义化合物不需要与靶核酸分子100％互补以与靶核酸分子特异性杂交。例如，反义化合物或化合物的反义链(如果是双链化合物的话)可与所选的靶核酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％互补。筛选反义化合物的特异性的方法是本领域中公知的(参见，例如，美国专利申请公开No.2003-0228689)。

通常来说，反义技术背后的原理是反义化合物与靶核酸杂交并且影响基因表达活性或功能的调节。基因表达的调节可通过例如靶RNA降解或基于占用的抑制来实现。通过降解来调节靶RNA功能的一个实例是靶RNA在与DNA样反义化合物，例如反义寡核苷酸杂交时基于RNA酶H的降解。

通过靶标降解调节基因表达的另一个实例是使用小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰(RNAi)。RNAi是反义介导的基因沉默形式，包含引入双链(ds)RNA样寡核苷酸，其导致靶向内源mRNA水平的序列特异性降低。通常归类为反义化合物的另一些化合物是核酶。核酶是催化性的RNA分子，可与另一些RNA分子上的特定位点结合并且催化RNA分子中磷酸二酯键的水解。核酶通过直接切割靶核酸，例如miRNA基因产物来调节基因表达。

上述反义化合物中的每一种都提供了序列特异性靶基因调节。这种序列特异性使反义化合物成为用于选择性调节感兴趣的靶核酸，例如miRNA基因产物的有效工具。

在一些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸。miRNA基因产物特异性反义寡核苷酸可以是任何合适的长度以允许用于基因表达的杂交和调节。反义寡核苷酸的长度可变化，但通常为约15至约40个核苷酸，包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为约20至约35个核苷酸。反义寡核苷酸可以是DNA、RNA或其类似物。此外，本文提供的寡核苷酸可以是未修饰的或可包含一种或更多种修饰，例如经修饰的核苷间键联、经修饰的糖部分、经修饰的碱基或其组合。下面详细描述寡核苷酸修饰。

在另一些实施方案中，反义化合物是siRNA分子。可用于所公开方法的siRNA包含来自于长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸，优选来自于长度为约19个至约25个核苷酸，例如长度为约21个至约23个核苷酸的短双链RNA。siRNA由通过标准沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对相互作用退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链构成。有义链包含与包含在靶miRNA基因产物内的核酸序列基本相同的核酸序列。如本文所用，与靶序列“基本相同”的siRNA核酸序列是与靶序列相同或与靶序列相差一个、两个或三个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义链和反义链可包含两个互补的单链RNA分子，或者可以是具有隔开单链“发夹”区域的两个互补部分(其是碱基配对的)的单个分子。

siRNA也可以是通过添加、缺失、置换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在RNA的改变RNA。这样的改变可包括添加非核苷酸物质，例如添加至siRNA的一个或两个末端或者添加至siRNA的一个或更多个内部核苷酸；使siRNA对核酸酶消化具有抗性的修饰；或者用脱氧核糖核苷酸置换在siRNA中的一个或更多个核苷酸。siRNA的一条或两条链也可包含3′突出端。如本文所用，“3′突出端”是指从双链RNA链的3′末端延伸的至少一个未配对核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含至少一个长度为1至约6个核苷酸(其包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为1至约5个核苷酸、长度为1至约4个核苷酸或长度为约2至约4个核苷酸的3′突出端。在一个特定的实施方案中，3′突出端存在于siRNA的两条链上并且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的每条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。

在另一些实施方案中，反义化合物是核酶。核酶是具有底物结合区的核酸分子，该底物结合区与miRNA基因产物的连续核酸序列互补，并且能够特异性切割miRNA基因产物。底物结合区不需要与靶miRNA基因产物100％互补。例如，底物结合区可与miRNA基因产物中的连续核酸序列例如至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约95％互补。酶促核酸还可包含在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。

反义化合物，例如反义寡核苷酸、siRNA和核酶，可以化学或生物学地产生，或者可从重组质粒或病毒载体中表达，如下文关于分离的miRNA基因产物的表达所进一步详细描述的。用于产生和测试反义化合物的示例性方法是本领域中公知的(参见，例如，美国专利No.5,849,902和4,987,071；美国专利申请公开No.2002/0173478和2004/0018176；Steinand Cheng，Science 261：1004，1993；Werner and Uhlenbeck，Nucl.Acids Res.23：2092-2096，1995；Hammann et al.，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9：25-31)。

在一些实例中，对miRNA基因产物具有特异性的反义化合物包含一种或更多种修饰以增强核酸酶抗性和/或提高化合物的活性。经修饰的反义化合物包括包含经修饰的骨架或非天然核苷间键联的那些。如本文所限定的，具有修饰骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。

经修饰的寡核苷酸骨架的一些实例包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包括3′-亚烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基-膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键联的硼酸磷酸酯、其2′-5′连接的类似物、以及其中核苷单元的相邻对连接在3′-5′到5′-3′或2′-5′到5′-2′的具有相反极性的那些。教导制备上述含磷键联的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519，126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050。

其中不包括磷原子的经修饰寡核苷酸骨架的一些实例具有由短链烷基或环烷基核苷间键联、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键联、或者一个或更多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成的骨架。这些包括具有吗啉键联(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰(formacetyl)和硫甲乙酰骨架；亚甲基甲乙酰和硫甲乙酰骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组分部分的另一些经修饰寡核苷酸骨架。教导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439。

在一些实施方案中，寡核苷酸或反义化合物的核苷酸单元的糖和核苷间键联二者被新的基团替代。一种这样的修饰化合物是被称为肽核酸(PNA)的寡核苷酸模拟物。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。碱基被保留并且直接或间接与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；5,714,331；以及5,719,262。可在Nielsen etal.(Science 254，1497-1500，1991)中找到对PNA化合物的进一步教导。

经修饰的寡核苷酸还可包含一个或更多个经取代的糖部分。在一些实例中，寡核苷酸可在2′位置包含以下中的一种：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。在另一些实施方案中，反义化合物在2′位置包含以下中的一种：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸药动学特性的基团，或用于改善寡核苷酸药效学特性的基团，以及具有类似特性的另一些取代基。在一个实例中，修饰包括2′-甲氧基乙氧基(也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin et al.，Helv.Chim.Acta.，78，486-504，1995)。在另一些实例中，修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基(也称为2′-DMAOE)或2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)。

也可在化合物的另一些位置进行类似的修饰。反义化合物也可具有糖模拟物例如环丁基部分来代替戊呋喃糖。教导制备经修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519，134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920。

寡核苷酸还可包含碱基修饰或置换。如本文所用，“未经修饰”或“天然”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰碱基包括另一些合成和天然碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和另一些烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和另一些烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和另一些8-置换的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和另一些5-置换的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。已经描述了进一步修饰的碱基(参见，例如，美国专利No.3,687,808；以及Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research andApplications，pages 289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，ed.，CRC Press，1993)。

这些经修饰碱基中的某些可用于提高反义化合物的结合亲和力。这些包括5-置换的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6置换的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶置换可将核酸双链体稳定性提高0.6至1.2℃。教导制备经修饰碱基的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；以及5,750,692。

还提供了通过向具有脑出血或遭受脑出血的患者施用治疗有效量的分离的miRNA基因产物来治疗所述患者的方法，分离的miRNA基因产物相对于对照(例如健康对象)在具有脑出血或遭受这样的脑出血的患者中下调。例如，具有脑出血或易于脑出血的对象通过施用治疗有效量的分离的hsa-miR-21-5p、hsa-miR-126-3p_R-1、PC-5p-218_26568和PC-5p-1115_3460基因产物进行治疗。如本文所述，miRNA基因产物可以是pri-miRNA、pre-miRNA或成熟miRNA。

在一些实施方案中，所公开的方法包括施用有效量的至少一种分离的miRNA基因产物，或其分离的变体或生物活性片段。向对象施用的分离的miRNA基因产物可与下调的内源性野生型miRNA基因产物(例如pri-miRNA、pre-miRNA或成熟miRNA)相同，也可以是其变体或生物活性片段。如本文所限定，miRNA基因产物的“变体”是指与相应野生型miRNA基因产物具有小于100％同一性并具有相应野生型miRNA基因产物的一种或更多种生物活性的miRNA。这样的生物活性的实例包括但不限于抑制靶RNA分子的表达(例如抑制靶RNA分子的翻译、调节靶RNA分子的稳定性或抑制靶RNA分子的加工)以及抑制与脑出血相关或遭受脑出血的细胞过程。这些变体包括物种变体和由miRNA基因中的一个或更多个突变(例如，置换、缺失、插入)引起的变体。在某些实施方案中，变体与相应的野生型miRNA基因产物具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约99％同一性。

公开了包括具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之一所示的核酸序列的miRNA寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中，组合物包含可药用载体。

如本文所用，miRNA基因产物的“生物活性片段”是指具有相应野生型miRNA基因产物的一种或更多种生物活性的miRNA基因产物的RNA片段。如上所述，这样的生物活性的实例包括但不限于抑制靶RNA分子的表达以及抑制与脑出血相关或遭受脑出血的细胞过程。在某些实施方案中，生物活性片段的长度为至少约9个、至少约11个、至少约13个、至少约15个、至少约17个或至少约19个核苷酸。

分离的基因产物的治疗有效量可以是，例如缓解具有脑出血或遭受这样的脑出血的一种或更多种体征或症状所需的量和/或延迟进展所需的量。本领域技术人员可确定用于治疗效力所需的分离的miRNA基因产物的量。

在一些实施方案中，向需要治疗的对象施用单个分离的miRNA基因产物。在另一些实施方案中，向对象施用两种或更多种miRNA基因产物(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多种)。当向对象施用两种或更多种miRNA基因产物时，miRNA基因产物可同时施用(或快速连续施用，例如彼此相隔几分钟内)，或者其可在不同时间施用。例如，可间隔一小时、十二小时、一天、两天、五天、一周、两周或一个月施用两种或更多种miRNA基因产物。

在一些实施方案中，分离的miRNA基因产物可与脑出血的一种或更多种另外的治疗组合施用于对象。

如本文所用，“分离的”miRNA基因产物是合成的，或与天然存在miRNA的细胞或组织的另一些生物组分纯化分离的miRNA基因产物。例如，合成的miRNA基因产物，或与其天然状态的另一些生物组分部分或完全分离的miRNA基因产物被认为是“分离的”。可使用多种标准技术获得分离的miRNA基因产物。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生miRNA基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成miRNA基因产物。合成RNA分子或合成试剂的商业供应商包括，例如Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO)、Pierce Chemical(Rockford，IL)、Glen Research(Sterling，VS)、ChemGenes(Ashland，MA)和Cruachem(Glasgow，UnitedKingdom)。

在一些实施方案中，所述方法包括施用编码miRNA基因产物的载体。载体可以是非病毒(例如质粒)或病毒(例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、牛痘病毒)来源的。合适的载体，例如基因治疗载体，是本领域中公知的。

在一些实例中，使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA质粒中表达miRNA基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括，例如U6或H1 RNA pol III启动子序列、或巨细胞病毒启动子。选择另一些合适的启动子在本领域技术人员的范围内。本发明的重组质粒还可包含用于表达miRNA基因产物的可诱导或可调节启动子。在一些实施方案中，miRNA基因产物包含含有核酸序列的核酸，所述核酸序列具有如SEQ ID NO：1、2、3或4之一所示或与其互补的核酸序列。

当要表达两种或更多种miRNA基因产物时，miRNA基因产物可分别由单独的重组质粒表达，或者其可由同一重组质粒表达。在一个实施方案中，miRNA基因产物从单个质粒中被表达为RNA前体分子，并且前体分子在靶细胞内被加工为功能性miRNA基因产物。适合于表达miRNA基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒中以表达基因产物的方法、以及将重组质粒递送至目的细胞的方法均在本领域技术人员的范围内(参见，例如，Zeng etal.，Mol.Cell 9：1327-1333，2002；Tuschl，Nat.Biotechnol.，20：446-448，2002；Brummelkarnp et al.，Science 296：550-553，2002；Miyagishi et al.，Nat.Biotechnol.20：497-500，2002；Paddison et al.，Genes Dev.16：948-958，2002；Leeet al.，Nat.Biotechnol.20：500-505，2002；以及Paul et al.，Nat.Biotechnol.20：505-508，2002)。在一个实施方案中，表达miRNA基因产物的质粒包含编码与CMV即早期启动子可操作连接的miRNA前体RNA的序列。

miRNA基因产物也可从重组病毒载体中表达。当施用两种或更多种miRNA基因产物时，考虑miRNA基因产物可从两个单独的重组病毒载体或从同一病毒载体中表达。从重组病毒载体中表达的RNA可通过标准技术从培养的细胞表达系统中分离出来，或者可直接在靶细胞或组织中表达。

与所公开的方法一起使用的重组病毒载体包括编码miRNA基因产物的序列以及用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或H1 RNA pol III启动子序列、或巨细胞病毒启动子。选择另一些合适的启动子在本领域技术人员的范围内。本发明的重组病毒载体还可包含用于表达miRNA基因产物的可诱导或可调节启动子。

合适的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体等。例如，腺病毒载体可以是第一代、第二代、第三代和/或第四代腺病毒载体或无肠腺病毒载体(gutless adenoviral vector)。腺病毒载体可产生非常高滴度的感染颗粒；感染多种细胞；有效地将基因转移至未分裂的细胞中；并且很少整合到宿主基因组中，这避免了通过插入突变形成进行细胞转化的风险(Zern and Kresinam，Hepatology 25(2)，484-491，1997)。可用于本文提供的方法的代表性腺病毒载体由Stratford-Perricaudet等人(J.Clin.Invest.90：626-630，1992)；Graham和Prevec(InMethods in Molecular Biology：Gene Transfer and Expression Protocols 7：109-128，1991)；以及Barr等人(Gene Therapy，2：151-155，1995)描述。

腺相关病毒(AAV)载体也适合于HCC相关基因的施用。产生AAV载体的方法、AAV载体的施用及其用途是本领域中公知的(参见，例如，美国专利No.6,951,753；美国授权前公开No.2007-036757、2006-205079、2005-163756、2005-002908；以及PCT公开No.WO 2005/116224和WO 2006/119458)。

逆转录病毒(包括慢病毒)载体也可与本文所述的方法一起使用。慢病毒包括但不限于人免疫缺陷病毒(例如HIV-1和HIV-2)、猫免疫缺陷病毒、马感染性贫血病毒和猿猴免疫缺陷病毒。另一些逆转录病毒包括但不限于人T淋巴细胞病毒、猿猴T淋巴细胞病毒、鼠白血病病毒、牛白血病病毒和猫白血病病毒。产生逆转录病毒和慢病毒载体的方法及其用途已在本领域中得到充分描述(参见，例如，美国专利No.7,211,247；6,979,568；7,198,784；6,783,977；以及4,980,289)。

合适的疱疹病毒载体可来源于多种不同类型的疱疹病毒中的任何一种，包括但不限于单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2和松鼠猴疱疹病毒(herpesvirus saimiri)。重组疱疹病毒载体、其构建和用途在本领域中得到充分描述(参见，例如，美国专利No.6,951,753；6,379,67416,613,892；6,692,955；6,344,445；6,319,703；以及6,261,552；以及美国专利申请公开No.2003-0083289)。

本领域技术人员可通过考虑数种因素，例如对象的大小和体重；疾病进展的程度；对象的年龄、健康状况和性别；施用途径；以及施用是否是局部的或全身性的，来容易地确定待向给定对象施用的miRNA基因产物的有效量。

例如，分离的miRNA基因产物的有效量可基于待治疗对象的近似体重。这样的有效量可通过任何合适的途径，例如如静脉内或动脉内途径施用。在一些实例中，向对象施用的分离的miRNA基因产物的有效量可为约5至约3000微克/千克体重、约700至约1000微克/千克体重、或大于约1000微克/千克体重。

本领域技术人员还可容易地确定用于向给定对象施用分离的miRNA基因产物的适当的给药方案。例如，可向对象施用miRNA基因产物一次(例如，作为单次注射或沉积)。作为替代，可在约三至约二十八天，更特别地约七至约十天的时间段内每天一次或两次向对象施用miRNA基因产物。在特定的给药方案中，miRNA基因产物每天施用一次持续7天。当给药方案包括多次施用时，应当理解，向对象施用的miRNA基因产物的有效量可包含在整个给药方案中施用的基因产物的总量。

可使用本领域已知的任何合适的方式向需要治疗的对象施用药剂。施用方法包括但不限于导管内、皮内、肌内、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、阴道、直肠、鼻内、吸入、经口或通过基因枪。鼻内施用是指通过一个或两个鼻孔将组合物递送至鼻和鼻腔通道中，并且可包括通过喷雾机制或液滴机制，或者通过核酸或病毒的雾化递送。通过吸入施用组合物可通过鼻或口经由喷雾或液滴机制递送。可通过插管直接递送至呼吸系统的任何区域。肠胃外施用通常通过注射来实现。注射剂可以以常规形式制备为液体溶液剂或混悬剂、适合在注射前将混悬剂溶解在液体中的固体形式，或者制备为乳液形式。注射剂和混悬剂可从无菌散剂、颗粒剂和片剂中制备。施用可以是全身性的或局部的。

药剂可以以任何合适的方式，优选与可药用载体一起施用。可药用载体部分通过所施用的特定组合物，以及通过用于施用组合物的特定方法来确定。因此，本公开内容的药物组合物有广泛多种合适的制剂。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水溶液剂、混悬剂和乳液剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液剂或混悬剂，包括盐和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer′s)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液(lactated Ringer′s)或固定油。静脉内载剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和另一些添加剂，例如如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于表面施用的制剂可包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂和散剂。常规的药物载体，水性、散剂或油性基质，增稠剂等可能是必要的或期望的。

用于经口施用的组合物包括散剂或颗粒剂、混悬剂或在水或非水介质中的溶液剂、胶囊剂、囊剂(sachet)或片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是期望的。

一些组合物可潜在地作为可药用酸或碱加成盐施用，该盐通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸一起反应，或者通过与无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，以及有机碱例如单-、二-、三烷基和芳基胺和经取代的乙醇胺一起反应来形成。

施用可通过单一剂量或多剂量完成。所需剂量因对象而异，其取决于对象的物种、年龄、重量和一般状况、所使用的特定治疗剂及其施用方式。适当的剂量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。

在一些实施方案中，治疗剂是核酸分子，例如miRNA基因产物、编码miRNA基因产物的载体、反义化合物或编码反义化合物的载体。可通过任何合适的途径向对象施用基于核酸的治疗剂。在一些实例中，使用肠内或肠胃外施用途径施用药剂。合适的肠内施用途径包括，例如经口、直肠或鼻内递送。合适的肠胃外施用途径包括例如：血管内施用(例如静脉内浓注、静脉内输注、动脉内浓注、动脉内输注和导管滴注至脉管系统中)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；直接应用于目的组织，例如通过导管或另一些放置装置(例如栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射至靶组织中。

在本公开内容的背景下，miRNA基因产物或反义化合物可作为裸RNA或DNA与递送试剂的组合施用至对象，或者可由重组质粒或病毒载体编码。包含表达miRNA基因产物或反义化合物的序列的重组质粒和病毒载体，以及用于将这样的质粒和载体递送至靶细胞的技术，是本领域中公知的。

在一些实施方案中，脂质体用于将miRNA基因产物或反义化合物(或包含编码其的序列的核酸)递送至对象。脂质体还可提高基因产物或核酸的血液半衰期。应用于本发明的合适的脂质体可由标准的囊泡形成脂质形成，其通常包含中性或带负电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。脂质的选择通常是通过考虑多个因素，例如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来指导的。用于制备脂质体的多种方法是本领域已知的(参见，例如，Szokaet al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467，1980；以及美国专利No.4,235,871；4,501,728；4,837,028；以及5,019,369)。在一些实施方案中，聚合物可用于向对象递送miRNA基因产物或反义化合物。已经描述了可用于递送治疗性RNA分子的阳离子脂质和聚合物(参见，例如，Zhang et al.，J Control Release.123(1)：1-10，2007；Vorhies et al.，Methods MolBiol.480：11-29，2009；以及美国专利申请公开No.2009/0306194)。多肽载体也可用于向对象施用miRNA基因产物(参见，例如，Rahbek et al.，J.Gene Med.10：81-93，2008)。

小分子药剂的适当剂量取决于本领域技术人员或普通技术人员(例如医师)已知的多个因素。小分子的一个或更多个剂量将变化，例如，取决于所治疗对象或样品的身份、大小和状况，还取决于待施用组合物的途径，如果适用的话，以及执业医生期望小分子对本发明的核酸或多肽产生的作用。示例性剂量包括每千克对象或样品重量的小分子的毫克或微克量(例如每千克约1微克至每千克约500毫克、每千克约100微克至每千克约5毫克、或每千克约1微克至每千克约50微克)。

还公开了确定用于在对象中治疗和/或预防脑出血或相关炎症应答的药剂的有效性的方法。所述方法包括检测从用药剂治疗后的对象中获得的样品中的hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5D、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5D、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中至少一种的表达，并且将从治疗后的对象中获得的样品中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中至少一种的表达与参考值比较，其中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中至少一个的表达在治疗后的改变表明该药剂用于在对象中治疗和/或预防脑出血或相关炎症应答的药剂是有效的。在一些实施方案中，参考值表示在来自用药剂治疗前的对象的样品中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451a_R-1、hsa-miR-338-5p_R-1、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-100-5p_R-1、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-144-3p_R-1、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-320a_R-2、hsa-miR-125a-5p_R-2、hsa-miR-126-3p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-125b-5p_R-2、hsa-miR-26a-5p、PC-5p-585_8337、hsa-miR-92b-3p、PC-5p-218_26568、PC-5p-1115_3460和PC-5p-445_12007中至少一种的表达值。

实施例

本实施例描述了特定微RNA(miRNA)充当蛛网膜下腔出血(SAH)和脑内出血(ICH)的诊断生物标志物的能力，以及区分SAH和ICH的能力的确定。

方法

用48小时从ICH和SAH患者(每组n＝3)中收集全血和CSF。还处理了非ICH/SAH的血浆和CSF对照(Cont，每组n＝3)。从200μl样品中分离出包含小RNA的总RNA，并且用于小型文库构建和测序，并且使用Ballgown Rpackage针对差异表达(p＜0.05)进行分析。在miRWalk中进行了KEGG通路和基因本体论(GO)的基因集富集分析(p＜0.01)。

结果

在CSF中，鉴定了在对照中高表达但在SAH和ICH中降低的21种已知的和4种新的miRNA(表1；图1)。在血浆中，与对照相比，SAH和ICH中的11种miRNA下调。在SAH与ICH的CSF中，发现5种miRNA在SAH中的水平高于在ICH中的水平。在血浆中，仅鉴定出1种显著的miRNA。通路富集分析发现在SAH和ICH的CSF中，针对上调miRNA的轴突导向以及针对下调miRNA的细胞黏附。在血浆中，发现了针对Ras信号、轴突导向、血小板激活和血友病细胞黏附的富集。

表1

读段(read)被映射到miRbase中的物种特异性基因组。未映射到miRbase中选定miRNA的读段经过mRNA、Rfam和repbase处理。然后将未映射的读段映射到物种特异性基因组，针对发夹形成进行分析，可能形成发夹的序列是潜在的新miRNA。与正常对照的CSF和血浆对比，发明人在SAH和ICH的CSF和血浆中鉴定了四种新miRNA(表2)。在SAH和ICH的CSF中所有4种miRNA均降低，并且发现在SAH和ICH的血浆中的1种miRNA高于对照血浆。

表2

除了以上鉴定的4种新miRNA，还鉴定了另外的统计学显著的miRNA生物标志物组，其将ICH与SAH病理状况和ICH-、SAH特异性miRNA区分。

表3

在ICH患者的血浆和CSF中检测到并且在SAH样品的血浆/CSF中检测不到的新miRNA。血浆和/或CSF中这些rniRNA的存在表明是ICH病理状况并且不是SAH病理状况。

表4

在ICH患者的血浆或CSF中未检测到但在SAH的血浆/CSF和对照血浆/CSF样品中检测到的新miRNA。在血浆和CSF中不存在这些微RNA暗示ICH病理变化。

结论

本文公开的结果证明这些miRNA的表达或其缺乏发挥针对ICH和SAH发病机制的生物标志物的作用。

尽管本文已经举例说明和描述了某些实施方案，但是本领域普通技术人员应理解，在不脱离范围的情况下，适合于实现相同目的的广泛多种替代和/或等效实施方案或实施可替代已示出和描述的实施方案。本领域技术人员将容易理解，可以以非常广泛的多种方式实施实施方案。本申请旨在涵盖本文讨论的实施方案的任何修改或变化。因此，明确地旨在仅由权利要求及其等同物来限制实施方案。

序列表

<110> Oschner Health Systems

Iwuchukwu, Ifeanyi

Nguyen, Doan

<120> 在脑内出血和蛛网膜下腔出血中的血浆和脑脊液miRNA生物标志物

<130> 131734-250482

<150> US 62/747,041

<151> 2018-10-17

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 1

gcaccacgtt cccgtgg 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

cgttcccgtg gttcccgtgg 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

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<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

cccgtggcgg ttcccgtgg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

ttagtatata ggactaaca 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

gaggattgga gaggtagc 18

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

ttggaatccc aggtgttgtt ctc 23

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

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<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

aggctaattg attttgac 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

tcttaggaag cgaagcaat 19