技术领域
本发明属于农药技术领域，具体涉及一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂及其制备方法。
背景技术
随着经济的发展，人们越来越注重食品的安全问题。近年来，关于我国农产品表面农药残留量超标的报道屡见不鲜，残留在农产品表面的农药严重的危害人体的健康，同时造成环境的污染和生态平衡的破坏。
宁南霉素是在四川省宁南县土壤分离而得，为首次发现的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，故将其发酵产物命名为宁南霉素。在烟草花叶病毒病、番茄病毒病、辣椒病毒病、水稻立枯病、大豆根腐病、水稻条纹叶枯病、苹果斑点落叶病、黄瓜白粉病上取得了登记，此外在防治油菜菌核病、荔枝霜疫霉病，其它作物病毒病、茎腐病、蔓枯病、白粉病等多种病害上也已大面积推广应用。该抗生素是一种低毒、低残留、无“三致”和蓄积问题，不污染环境的新农药。
宁南霉素绿色安全的新型微生物源杀菌剂，但是宁南霉素杀菌作用不持久，需要使用较高浓度才能达到和化学农药效果相当的效果，如何降低宁南霉素的使用量同时保证杀菌效果，是目前亟待解决的问题。
银杏酚酸是银杏中除了银杏内酯和银杏黄酮之外的另一类重要的生理活性化合物，具有杀菌、抑菌、抗炎、抗病毒及驱虫、杀虫作用，在医药、化妆品和生物农药等方面有很好的开发应用价值。其主要存在银杏外种皮中，我国银杏资源充足，在银杏果实采摘中，大量的外种皮被当作废弃物扔掉，既污染了环境，又浪费了资源。
目前有利用银杏酚酸制备杀虫杀菌剂的发明，例如CN201711376980.5、专利CN105145666A、专利CN105284955A等，但均存在着活性成分提取率不高、制备工艺复杂、成本高以及灭杀效果不理想等诸多不足之处。
发明内容
本发明将宁南霉素和银杏酚酸相结合，一方面降低宁南霉素使用量，提升药物持久度和稳定性，另一方面复配银杏酚酸，实现资源循环利用的同时，提升整体药剂的药具抑菌效果，植物源和微生物源杀菌剂结合的方式，实现本发明杀菌剂效果的最大化。
为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂，包括以下重量份的原料制备得到：银杏酚酸提取物10-15份、宁南霉素5-10份、增效剂1-3份、表面活性剂1-5份、防腐剂0.1-0.3份、抗氧化剂0.1-0.5份、抗冻剂0.15-0.25份；所述银杏酚酸提取物是由以下方法制备得到：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物。
进一步的，步骤(1)微波功率不小于500W。
进一步的，步骤(2)硅胶柱规格为φ3.0×60cm。
进一步的，步骤(3)酪蛋白磷酸肽和水的质量比为1:10，精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液的体积比为1:1。
进一步的，所述增效剂为竹醋液。
进一步的，所述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油40、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯、烷基多苷、葡萄糖酰胺中的一种或者几种。
进一步的，所述防腐剂为山梨酸盐、对羟基苯甲酸甲酯、双乙酸钠和乳酸钠中的一种。
进一步的，所述抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚。
进一步的，所述抗冻剂为乙二醇。
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物；
4)按重量比将银杏酚酸提取物10-15份、宁南霉素5-10份、增效剂1-3份、表面活性剂1-5份、防腐剂0.1-0.3份、抗氧化剂0.1-0.5份、抗冻剂0.15-0.25份溶于5倍重量50％的乙醇溶液中，混合均匀，得到宁南霉素和银杏酚酸的复合杀菌剂。
本发明各原料均市售可得。
有益效果
银杏酚酸作为植物源杀虫剂，安全环保无公害，但是制备工艺复杂，药效不持久，相同成本下，很难达到和化学农药相当的技术效果。同样的，作为微生物源杀菌剂同样存在成本高效率低的问题。
本发明人将植物源和微生物源农药相结合，两者复配后加入增效剂，实现高效的杀菌抑菌功效。
本发明将微波提取和树脂吸附相结合，高效提取银杏外种皮的酚酸物质，简化提取工艺，再和酪蛋白进行微射流均质，银杏酚酸和酪蛋白通过氢键紧密结合，通过均质，得到酪蛋白包裹的银杏酚酸纳米颗粒，显著提升了银杏酚酸的稳定性。同时大量纳米粒子的存在可以促进宁南霉素的均匀分散，两者的相互配合，使得药效实现最大化。
其次，本发明添加增效剂-竹醋液，竹醋中的有机成分能够帮助本发明银杏酚酸、宁南霉素抑菌物质在植物体表及内部深入渗透，从而增强防治效果。相互配合共促进本发明杀菌剂发挥杀菌功效，同时竹醋还具有促进农作物种子发芽、生根、生长的作用，提高作物产量。
本发明还添加表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗冻剂等成分，有效促进核心物质发挥作用。
本发明植物源-微生物源杀菌剂，制备工艺充分优化，用量少效果佳，且安全环保无污染，可替代普通商品农药进行使用，大幅降低化学农药在农业领域的应用，具有广泛的实际推广应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
实施例1
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂，包括以下重量份的原料制备得到：银杏酚酸提取物10份、宁南霉素5份、增效剂1份、表面活性剂1份、防腐剂0.1份、抗氧化剂0.1份、抗冻剂0.15份；所述银杏酚酸提取物是由以下方法制备得到：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物。
进一步的，步骤(1)微波功率不小于500W。
进一步的，步骤(2)硅胶柱规格为φ3.0×60cm。
进一步的，步骤(3)酪蛋白磷酸肽和水的质量比为1:10，精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液的体积比为1:1。
进一步的，所述增效剂为竹醋液。
进一步的，所述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油40。
进一步的，所述防腐剂为山梨酸盐。
进一步的，所述抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚。
进一步的，所述抗冻剂为乙二醇。
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物；
4)按重量比将银杏酚酸提取物10份、宁南霉素5份、增效剂1份、表面活性剂1份、防腐剂0.1份、抗氧化剂0.1份、抗冻剂0.15份溶于5倍重量50％的乙醇溶液中，混合均匀，得到宁南霉素和银杏酚酸的复合杀菌剂。
实施例2
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂，包括以下重量份的原料制备得到：银杏酚酸提取物12份、宁南霉素8份、增效剂2份、表面活性剂3份、防腐剂0.2份、抗氧化剂0.3份、抗冻剂0.2份；所述银杏酚酸提取物是由以下方法制备得到：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物。
进一步的，步骤(1)微波功率不小于500W。
进一步的，步骤(2)硅胶柱规格为φ3.0×60cm。
进一步的，步骤(3)酪蛋白磷酸肽和水的质量比为1:10，精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液的体积比为1:1。
进一步的，所述增效剂为竹醋液。
进一步的，所述表面活性剂为脂肪酸山梨坦。
进一步的，所述防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯。
进一步的，所述抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚。
进一步的，所述抗冻剂为乙二醇。
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物；
4)按重量比将银杏酚酸提取物12份、宁南霉素8份、增效剂2份、表面活性剂3份、防腐剂0.2份、抗氧化剂0.3份、抗冻剂0.2份溶于5倍重量50％的乙醇溶液中，混合均匀，得到宁南霉素和银杏酚酸的复合杀菌剂。
实施例3
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂，包括以下重量份的原料制备得到：银杏酚酸提取物15份、宁南霉素10份、增效剂3份、表面活性剂5份、防腐剂0.3份、抗氧化剂0.5份、抗冻剂0.25份；所述银杏酚酸提取物是由以下方法制备得到：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物。
进一步的，步骤(1)微波功率不小于500W。
进一步的，步骤(2)硅胶柱规格为φ3.0×60cm。
进一步的，步骤(3)酪蛋白磷酸肽和水的质量比为1:10，精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液的体积比为1:1。
进一步的，所述增效剂为竹醋液。
进一步的，所述表面活性剂为葡萄糖酰胺。
进一步的，所述防腐剂为双乙酸钠。
进一步的，所述抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚。
进一步的，所述抗冻剂为乙二醇。
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；
3)将用水将酪蛋白磷酸肽配置成溶液，将精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液混均匀，用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物；
4)按重量比将银杏酚酸提取物15份、宁南霉素10份、增效剂3份、表面活性剂5份、防腐剂0.3份、抗氧化剂0.5份、抗冻剂0.25份溶于5倍重量50％的乙醇溶液中，混合均匀，得到宁南霉素和银杏酚酸的复合杀菌剂。
对比例1
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂，包括以下重量份的原料制备得到：银杏酚酸提取物15份、宁南霉素10份、增效剂3份、表面活性剂5份、防腐剂0.3份、抗氧化剂0.5份、抗冻剂0.25份；所述银杏酚酸提取物是由以下方法制备得到：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质 1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物。
进一步的，步骤(1)微波功率不小于500W。
进一步的，步骤(2)硅胶柱规格为φ3.0×60cm。
进一步的，步骤(3)酪蛋白磷酸肽和水的质量比为1:10，精提液和酪蛋白磷酸肽水溶液的体积比为1:1。
进一步的，所述增效剂为竹醋液。
进一步的，所述表面活性剂为葡萄糖酰胺。
进一步的，所述防腐剂为双乙酸钠。
进一步的，所述抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚。
进一步的，所述抗冻剂为乙二醇。
一种宁南霉素和银杏酚酸复合杀菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将银杏外种皮于50℃下干燥、粉碎置于容器中，按照固液比1:15加入无水乙醇，与 70℃下微波萃取10min，然后用纱布粗滤，得到粗提液；
2)将粗提液使用硅胶柱纯化，使用体积比为80:20:3的石油醚、乙酸乙酯和冰醋酸为洗脱剂以流速2ml/min洗脱1-3次得到洗脱液，然后将洗脱液真空浓缩去除有机溶剂后得到精提液；用高速分散器在5000r/min下分散2min，在微射流压力40MPa下均质 1～3次；通过旋转蒸发，除去溶剂，冷冻干燥得到白色粉末，即为银杏酚酸提取物；
3)按重量比将银杏酚酸提取物15份、宁南霉素10份、增效剂3份、表面活性剂5份、防腐剂0.3份、抗氧化剂0.5份、抗冻剂0.25份溶于5倍重量50％的乙醇溶液中，混合均匀，得到宁南霉素和银杏酚酸的复合杀菌剂。
本对比例原料配方及制备方法基本同实施例3，与之不同的是银杏酚酸提取物不经过酪蛋白磷酸肽的处理。
对比例2
本对比例原料配方及制备方法基本同实施例3，与之不同的是不包含银杏酚酸提取物的添加及其制备的部分。
对比例3
本对比例原料配方及制备方法基本同实施例3，与之不同的是不包含宁南霉素的添加。
对比例4
本对比例原料配方及制备方法基本同实施例3，与之不同的是没有增效剂的加入。
杀菌效果实验：
选取黑曲霉菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌作为验证菌剂，制备菌悬液进行验证试验。取各试验指标菌的纯培养分离的典型菌落接种营养肉汤经增菌培养，参照麦氏比浊法，配制含菌量在1×10
在无菌试管内加入菌悬液0.1ml与实施例1-3以及对比例1-4所得杀菌剂5ml，作用至设定时间，吸取0.1ml混合液置于营养琼脂培养基平板上涂布均匀。置于37℃培养后计数菌落数，计算平均杀灭率。试验重复3次。
评价指标：
存活率(％)＝1一杀菌率(％)。
协同系数(T/E)值＝各因子单独作用时细菌存活百分率之乘积/多因子共同作用实测细菌存活百分率(存活率为0时，按0.0001％计算)。T/E值为判断复合增效作用强弱的标准，T/E值小于1为拮抗作用，等于1为相加作用，大于1为协同作用，其值愈大，协同作用愈强。实验结果如下表所示：
表1杀菌效果实验数据
通过表中数据我们可以看出，银杏酚酸和宁南霉素的T/E值，我们可以看出，其值均大于1，且时间越长，协同作用越明显。缺少了相应的处理步骤和某一成分的对比例，其抑菌杀菌效果均呈现了不同程度的下降。
大田实验
实验地点：临沂市兰山区农民专业合作社生产基地温室，在温室地表下设有全自动滴灌系统，温室内安装有自动温、湿度监测仪。
土壤状况：有机质含量42.63g/kg，p H值7，黄瓜品种同为津优2号
实验设计：
设7个处理，分别为S1-S7
S1：实施例3所得杀菌剂，稀释后使用，有效成分(银杏酚酸、宁南霉素)用量：5g/667m
S2：对比例1所得杀菌剂，稀释后使用，有效成分(银杏酚酸、宁南霉素)用量：5g/667m
S3：对比例2所得杀菌剂，稀释后使用，有效成分(银杏酚酸、宁南霉素)用量：5g/667m
S4：对比例3所得杀菌剂，稀释后使用，有效成分(银杏酚酸、宁南霉素)用量：5g/667m
S5：对比例4所得杀菌剂，稀释后使用，有效成分(银杏酚酸、宁南霉素)用量：5g/667m
S6：10％宁南霉素，制剂用量50g/667m
CK：清水对照。
试验均设3次重复，小区面积10m
防治效果每个小区随机选择6株黄瓜，调查全株叶片，在第1次施药前调查药前病情指数，施药后7d各调查病情指数。按6级标准调查病叶数，计算病情指数、病指增长值和实际防效，并对试验结果进行显著性检验(DMRT法)。
病情指数、病指增长值和实际防效按下列公式计算:
病情指数＝∑(各级病叶数×该病级值)/(检查总叶数×最高病级值)×100；
病指增长值＝施药后病情指数－施药前病情指数；
防效＝(对照区病指增长值－处理区病指增长值)/对照区病指增长值×100％。
调查时所用分级标准为:0级—叶片无病斑；1级—病斑占叶片面积5％以下；3级—病斑占叶片面积6％～10％；5级—病斑占叶片面积11％～20％；7级—病斑占叶片面积21％～40％；9级—病斑占叶片面积41％以上或叶片枯死。
黄瓜果实品质及产量在黄瓜成熟以后取样，进行果实营养成分测定。取样方法是所有植株摘取底部向上第3条成熟度一致的果实，营养成分测定项目包括可溶性固形物、可溶性总糖、维生素C、可溶性蛋白和硝酸盐含量。对各测定项目，根据每小区6株，计算出平均值。
可溶性固形物含量采用手持糖量计直接测定；可溶性总糖含量采用蒽酮比色法测定；维生素C含量采用钼蓝比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G－250法测定；亚硝酸盐含量采用盐酸萘乙二胺法测定。黄瓜果实按成熟先后分次采收，采收时将果实直接称质量。
以小区为单位，测量所有植株，统计果实数量和质量，累计计产，计算出每公顷产量。
实验结果如表2所示：
表2种植试验结果
表3试验组所得黄瓜品质
从表中数据可以看出，本发明实施例3所得杀菌剂对于黄瓜病害巨头良好的防控效果，对于黄瓜品质的提升也具有显著的积极的效果。而没有了纳米化处理的对比例1、不添加银杏酚酸的对比例2、不添加宁南霉素的对比例3和不添加增效剂的对比例4，其种植效果均远不如实施例，可以说明本发明各原料和处理步骤对于实现其高效的抑菌杀菌效果十分关键，缺少了任意成分或步骤，均会导致实验效果的下降，本发明各成分相辅相成，缺一则效弱。
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。
机译： 一种土霉素复合盐和纯土霉素的制备方法
机译： 一种万古霉素类复合抗生素的制备方法
机译： 一种乙酰基复合抗生素硬脂酸红霉素的制备方法
