一种3-（邻三氟甲氧基苯磺酰氨）吴茱萸次碱在制备防治酒精性肝损伤药物中的应用

摘要

本发明属于药物化合物制药应用技术领域，具体涉及一种3‑(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱在制备防治酒精性肝损伤药物中的应用。本发明涉及的3‑(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可降低酒精促炎作用下细胞的炎症因子的水平，减轻细胞损伤及可抑制酒精性肝损伤模型中肝组织的炎症因子表达，保护发生酒精性肝损伤时的肝功能，表明本发明使用的3‑(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可用于制备预防和或治疗酒精性肝损伤的药物。

说明书

技术领域

本发明属于药物化合物制药应用技术领域，具体涉及一种3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱在防治酒精性肝损伤药物中的应用。

技术背景

吴茱萸是一种传统中药，是芸香科植物吴茱萸将近成熟的果实，始载于《神农本草经》，主要用于治疗胃肠道疾病、高血压、心绞痛、胆心综合症、风湿性关节炎等。吴茱萸次碱(rutaecarpine，RUT)是吴茱萸中提取的一种吲哚喹唑啉类生物碱。以往研究结果显示，吴茱萸次碱具有广泛的生物活性，如心脏保护作用，扩血管和降压作用，对脑缺血再灌注损伤的保护作用，抑制血小板聚集和动脉血栓形成，吴茱萸次碱还有抗炎镇痛、抗肿瘤等药理作用。

酒精性肝损伤(alcoholic liver injury,ALI)是临床常见危重疾病，严重影响人类健康，其主要是由酒精及其代谢产物对肝脏造成的毒副作用，可发展为肝纤维化，肝硬化甚至是肝癌等一系列疾病，是引起肝脏疾病及住院患者死亡的重要原因。迄今为止ALI尚无任何有效治疗措施，因此，寻找可以减轻组织损伤、促进修复、防止慢性纤维化、肝癌发生的肝脏保护药物具有重要意义。

专利CN109761980A公开了一种3-胺基磺酰胺基取代的吴茱萸次碱类衍生物，其中3-胺基磺酰胺基上R基可以为2-三氟甲氧基苯基，并公开了该衍生物在制备丁酰胆碱酯酶抑制药物中的应用，及该衍生物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。目前，基于吴茱萸次碱的衍生物在防治酒精性肝损伤的应用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种吴茱萸次碱衍生物的新用途，具体为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱在预防和或治疗酒精性肝损伤中的用途。

所述3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱的分子式为C

本发明的目的之二在于提供一种用于预防和或治疗酒精性肝损伤的药物。

所述药物由包含药学上有效剂量的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱和药学上可接受的辅助剂制得。

优选的，所述的药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

该药物可以单独预防酒精性肝损伤，或单独治疗酒精性肝损伤，或同时预防和治疗酒精性肝损伤；在不同功用中，根据实际情况选择相同或不同有效剂量的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱和药学上可接受的辅助剂，并选择相同或不同的剂型。

本发明的有益效果在于：

1.本发明通过体内及体外诱导实验，证明本发明涉及的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可降低酒精促炎作用下细胞的炎症因子的水平、减轻细胞损伤及可抑制酒精性肝损伤模型中肝组织的炎症因子表达、保护发生酒精性肝损伤时的肝功能，表明本发明使用的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可用于制备预防和或治疗酒精性肝损伤的药物。

2.本发明通过实验证实3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可明显降低细胞炎症因子水平，改善炎症，表明3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱保护酒精性肝损伤的作用机制与其降低炎症因子水平作用有关，可以作为相关病理研究的基础，具有较高的科研价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱在体外对乙醇(EtOH)和脂多糖(LPS)诱发细胞活性的保护作用的实验结果。图片表明，体外实验中，3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱降低了细胞上清液中LDH活性，表明其可减轻乙醇(EtOH)和脂多糖(LPS)引起的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的损伤。

图2A、2B、2C为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对体外乙醇(EtOH)和脂多糖(LPS)诱导炎症因子的抑制作用实验的Real time PCR结果。图片表明，体外实验中，3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱显著抑制乙醇(EtOH)和脂多糖(LPS)诱导的炎症因子水平。

图3为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精诱导的小鼠酒精性肝损伤的保护作用实验的小鼠肝组织HE染色结果，图片显示，酒精诱导模型组(EtOH-fed)小鼠与正常组(CD-fed)小鼠比较，肝脏出现肝索紊乱，脂肪空泡增多和炎性细胞浸润的现象，显示肝脏受损；EtOH-fed小鼠给予不同浓度的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱(3-B-RUT(5，10，20μg/kg))后，降低了乙醇所诱导的肝脏损伤。

图4为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精诱导的小鼠酒精性肝损伤的保护作用实验各组的结果评分，图中分数越高代表肝组织损伤越严重。

图5为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对小鼠酒精性肝损伤模型中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的影响的实验结果图。图片显示，体外实验中，酒精诱导模型组(EtOH-fed)ALT和AST含量明显升高，显示肝功能受损，而不同浓度的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱有效降低模型组ALT和AST水平，证实3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精性肝损伤时肝功能具有保护作用。

图6为3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精性肝损伤模型中炎症的抑制作用实验的Real time PCR结果。图片表明，体内实验中，3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱明显降低了酒精性肝损伤模型中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α和趋化因子CCL2mRNA水平，表明其可抑制酒精诱导的炎症因子的表达。

上述图1，图2，图4，图5，图6中，均有含义：

与对照组(NC)比较：*P<0.05；**P<0.01,***P<0.001；

与EtOH+LPS刺激组比较：#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

具体实施方式

除非另有说明，本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。

本文中使用的单位nM即nMol/L，μM即μmol/L，换算关系为1μmol/L＝1000nMol/L。

下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：

实施例1：3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱的制备方法，包括如下步骤：

S1.采用改进的伯格曼合成工艺合成中间体3-氨基取代的吴茱萸次碱：首先按照按照Iqbal报道的方法将靛红酸酐硝化，然后按照Bergman三氟乙酸酐合成路线，以硝化的靛红酸酐，三氟乙酸酐和色胺为原料，经缩合，闭环、氢化、去三氟甲基等反应步骤得到3-氨基吴茱萸次碱；

S2.用2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯代替H

反应过程如下：

实施例2

实验：3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱在体外对乙醇(EtOH)和脂多糖(LPS)诱发细胞活性的保护作用

1.实验细胞：RAW264.7细胞，即小鼠单核巨噬细胞白血病细胞。

将RAW264.7细胞接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔，添加10％胎牛血清的高糖培养基(DMEM)，37℃、5％CO

2.实验分组：将培养24h后的细胞分为7组，每组三孔，正常组(NC)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱组(3-B-Rut 10nM)、模型组(EtOH3.25μg/ml+LPS 1μg/ml)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱低剂量组(EtOH 3.25μg/ml+LPS1μg/ml+3-B-RUT2.5nM)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱中剂量组(EtOH 3.25μg/ml+LPS1μg/ml+3-B-RUT5nM)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱高剂量组(EtOH3.25μg/ml+LPS1μg/ml+3-B-RUT 10nM)、吴茱萸次碱原药组((EtOH3.25μg/ml+LPS1μg/ml+RUT 5μM)。

3.实验过程：按照步骤2中分组在培养液中添加需要剂量的乙醇(EtOH)+脂多糖(LPS)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱(3-B-RUT)或/和原药吴茱萸次碱(RUT)后，继续培养36h，收集上清液备用。

进行LDH测试：

按照上表对收集到的各组上清液进行LDH测试，溶液滴加完毕后混匀，室温静置5分钟，用酶标仪在450nm处测定各孔OD值，记录结果，并以培养上清液中LDH活性对剂量作图，其中，

培养上清中LDH活性＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(0.2μmol/ml)×N×1000。

注：公式中N为待测样本测定前稀释倍数。

已有研究表明，过量饮酒会增加肠道通透性，使脂多糖通过门静脉进入肝脏，激活kuffer细胞释放炎症因子等，本实验采用EtOH和LPS共同对细胞进行刺激，符合体内酒精产生的促炎作用，其效果优于单独使用EtOH或LPS。

上述OD值即光密度值，LDH为乳酸脱氢酶，由于乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜，而当细胞受损或死亡时可释放到细胞外，因此细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比。

实验结果：如图1所示，LDH结果显示，EtOH+LPS刺激的RAW264.7细胞经过低、中、高浓度的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱处理后，培养上清中LDH活性明显降低，高剂量效果最好，且优于原药吴茱萸次碱。说明3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对EtOH+LPS刺激的细胞具有较好的保护作用。

实施例3

实验：3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对体外乙醇(EtOH)和脂多糖(LPS)诱导炎症因子的抑制作用

1.实验细胞：RAW264.7细胞，即小鼠单核巨噬细胞白血病细胞。

将RAW264.7细胞接种于12孔板中，接种密度约为0.5×10

2.实验分组：将培养24h后的细胞分为7组，每组3孔，正常组(NC)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱组(3-B-RUT 10nM)、吴茱萸次碱组(RUT 5μM)、模型组(EtOH 3.25μg/ml+LPS 1μg/ml)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱低剂量组(EtOH3.25μg/ml+LPS1μg/ml+3-B-RUT2.5nM)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱中剂量组(EtOH3.25μg/ml+LPS1μg/ml+3-B-RUT 5nM)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱高剂量组(EtOH3.25μg/ml+LPS1μg/ml+3-B-RUT 10nM)、吴茱萸次碱原药组(EtOH3.25μg/ml+LPS1μg/ml+RUT 5μM)，每组重复3-4次实验。

3.实验过程：按照步骤2中分组在培养液中添加需要剂量的乙醇(EtOH)+脂多糖(LPS)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱(3-B-RUT)或/和原药吴茱萸次碱(RUT)后，继续培养24h，PBS缓冲液洗涤细胞三遍，收集细胞，提取RNA,并进行逆转录、扩增。

实验结果：如图2A、2B、2C所示，Real time PCR结果显示EtOH+LPS刺激明显诱导RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的水平升高，而3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱处理组TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表达均明显被抑制，且抑制效果优于原药吴茱萸次碱。

“TNF-α”肿瘤坏死因子-α，是一种多向性的促炎性细胞因子；“IL-1β”白介素-1β，是在局部和全身炎症反应中起核心作用的细胞因子，能诱导其它炎症细胞因子等的合成；“IL-6”白介素-6，是急性感染和炎症早期诊断的灵敏指标，当感染和炎症发生后，IL-6率先生成且水平迅速升高，可在2h达高峰，其升高水平与感染的严重程度相一致，TNF-α、IL-1β和IL-6可作为肝脏炎症及肝损伤的指标，实验结果提示3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可显著抑制EtOH+LPS诱发的炎症反应。

实施例4

实验：3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精诱导的小鼠酒精性肝损伤的保护作用

实验小鼠：6-8周龄C57BL/6小鼠适应性培养1-2天。

实验分组：将经过适应性培养后的小鼠分为7组，正常组(CD-fed)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱组(CD-fed+3-B-RUT 20μg/kg)、模型组(EtOH-fed)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱低剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 5μg/kg)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱中剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 10μg/kg)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱高剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 20μg/kg)、吴茱萸次碱组(EtOH-fed+RUT 5mg/kg)，每组6-10只。

实验模型建立和实验过程：小鼠采用慢性乙醇喂养16天，包括3天适应，建立酒精性肝损伤模型，并在造模前6小时给予1次腹腔注射低、中、高(5，10，20μg/kg)剂量的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱以及吴茱萸次碱(5mg/kg)进行药物干预。EtOH喂养的小鼠喂食含5％乙醇的酒精液体饲料，CD喂养的小鼠喂食对照流食饲料，EtOH喂养组的小鼠在最后一天给予乙醇灌胃(5g/kg，33％EtOH)。灌胃9h后，麻醉处死所有实验小鼠，取小鼠肝组织，固定，HE染色。

实验结果：如图3所示，HE染色显示，酒精诱导模型组(EtOH-fed)与正常组(CD-fed)小鼠比较，肝脏出现肝索紊乱，脂肪空泡增多和炎性细胞浸润的现象，显示肝脏受损；EtOH-fed小鼠给予不同浓度的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱(3-B-RUT(5，10，20μg/kg))后，其以浓度依赖方式降低了乙醇所诱导的肝脏损伤，且3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱的保护作用(20μg/kg)与原药RUT(20mg/kg)相当，证实3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可有效降低模型组的肝脏损伤程度，对酒精性肝损伤具有一定的保护作用。

实施例5

实验：3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对小鼠酒精性肝损伤模型中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的影响

实验小鼠：6-8周龄C57BL/6小鼠适应性培养1-2天。

实验分组：将经过适应性培养后的小鼠分为7组，正常组(CD-fed)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱组(CD-fed+3-B-RUT 20μg/kg)、模型组(EtOH-fed)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱低剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 5μg/kg)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱中剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 10μg/kg)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱高剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 20μg/kg)、吴茱萸次碱组(EtOH-fed+RUT 5mg/kg)，每组6-10只。

实验模型建立和实验过程：小鼠采用慢性乙醇喂养16天，包括3天适应，建立酒精性肝损伤模型。EtOH喂养的小鼠喂食含5％乙醇的酒精液体饲料，CD喂养的小鼠喂食对照流食饲料，EtOH喂养组的小鼠在最后一天给予乙醇灌胃(5g/kg，33％EtOH)。并在造模前6小时给予1次腹腔注射低、中、高(5，10，20μg/kg)剂量的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱以及吴茱萸次碱(5mg/kg)进行药物干预。灌胃9h后，麻醉处死所有实验小鼠，取小鼠血清样本，并根据ALT和AST试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书检测动物模型血清中ALT和AST的含量。

ALT试剂盒使用过程如下表所示：

按照上表完成操作后，将待测血清样本室温放置15分钟，用酶标仪在510nm处测定各孔OD值，以(绝对OD值＝测定孔OD值-对照孔OD值)，查标准曲线，求得相应的ALT活力单位。

AST试剂盒使用过程如下表所示：

室温放置15分钟，用酶标仪在510nm处测定各孔OD值，以(绝对OD值＝测定孔OD值-对照孔OD值)，查标准曲线，求得相应的AST活力单位。

实验结果：如图5所示，ALT和AST高含量存在于肝细胞浆中，当肝细胞出现损伤导致细胞膜通透性增加或肝细胞死亡时，细胞浆中的ALT和AST会不同程度进入血液中，由此ALT和AST可作为肝细胞损伤的主要检查指标。本实验中酒精诱导模型组(EtOH-fed)中ALT和AST含量明显升高，显示肝功能受损，而不同浓度的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱有效降低模型组ALT和AST水平，证实3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精性肝损伤时肝功能具有保护作用。

实施例6

实验：3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱对酒精性肝损伤模型中炎症的抑制作用

实验小鼠：6-8周龄C57BL/6小鼠适应性培养1-2天。

实验分组：将经过适应性培养后的小鼠分为7组，正常组(CD-fed)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱组(CD-fed+3-B-RUT 20μg/kg)、模型组(EtOH-fed)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱低剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 5μg/kg)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱中剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 10μg/kg)、3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱高剂量组(EtOH-fed+3-B-RUT 20μg/kg)、吴茱萸次碱组(EtOH-fed+RUT 5mg/kg)，每组6-10只。

实验模型建立和实验过程：小鼠采用慢性乙醇喂养16天，包括3天适应，建立酒精性肝损伤模型，并在造模前6小时给予1次腹腔注射低、中、高(5，10，20μg/kg)剂量的3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱以及吴茱萸次碱(5mg/kg)进行药物干预。EtOH喂养的小鼠喂食含5％乙醇的酒精液体饲料，CD喂养的小鼠喂食对照流食饲料，EtOH喂养组的小鼠在最后一天给予乙醇灌胃(5g/kg，33％EtOH)。灌胃9h后，麻醉处死所有实验小鼠，灌流获得实验小鼠肝脏原代巨噬细胞，提取原代巨噬细胞RNA，逆转录，扩增。

实验结果：如图6所示，Real-time PCR结果提示酒精性肝损伤模型中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α和趋化因子CCL2 mRNA水平均显著上升，趋化因子CCL2在机体病态产生早期释放，可以与单核细胞趋化受体MCP-1结合，在一些炎症反应过程中发挥重要调节作用，IL-1β、IL-6和TNF-α和CCL2可以做为肝脏炎症及肝损伤的判断指标。实验表明3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱可明显降低炎症因子水平，改善炎症，指示这是3-(邻三氟甲氧基苯磺酰氨)吴茱萸次碱保护避免造成酒精性肝损伤的作用机制之一。

以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。