基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价方法

摘要

本发明公开了基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价方法，包括先收集样品并培养，然后对样品进行热处理，采用多功能植物效率分析仪对样品进行测定，获得快速荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)和参数，最后根据部温度下各组样品OJIP曲线变化和参数的差异进行比对分析，得到山核桃耐热性的评价结果。本发明中提出一种利用快速叶绿素荧光上升动力学技术，无损伤地评价不同砧木嫁接山核桃耐热性的方法，可通过不同品种山核桃的快速叶绿素荧光在不同温度的变化，分析出山核桃的耐热性，是一种科学有效、无损、准确的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及山核桃耐高温性评价技术领域，特别涉及一种基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价方法。

背景技术

山核桃是一种落叶乔木，为胡桃科山核桃属植物，又名小核桃、野漆树。主要产于浙、皖交界的天目山区、昌北区及横路乡一带，是我国重要的经济作物之一。

温度是影响植物生长的主要环境因子。山核桃幼苗要求生长在阴凉环境下。在夏季高温季节或者干旱少雨的月份，常导致山核桃叶片出现不同程度的萎蔫或坏死，表现出较差的抗热性。高温会影响植物的生长代谢，使植物体受到伤害，严重时甚至导致植物死亡。因此耐热性研究是经济植物生理抗性研究的热点和重点。

快速叶绿素荧光动力学OJIP上升曲线和JIP-test分析，以其无损、准确、快速的特点，被广泛而成功地应用于植物逆境生理状态的研究。目前人们对于山核桃耐热性研究方法较多较杂，且都是破坏性的，需要取样分析，导致这些方法操作繁杂，不够直观，尤其缺乏利用快速叶绿素荧光动力学，系统地无损伤地对山核桃耐热性进行试验和评价，筛选不同山核桃苗的耐热性。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明建立了利用快速叶绿素荧光上升动力学技术，评价不同砧木嫁接山核桃耐热性的方法，可以解决现在对于山核桃耐热性研究方法较多较杂，且都是破坏性的，操作繁杂，不够直观，尤其缺乏利用快速叶绿素荧光动力学，系统地无损伤地对山核桃耐热性进行试验和评价的难题。

(二)技术方案

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价方法，包括以下具体步骤：

S1：样品收集和培养：选用不同品种山核桃幼苗栽于培养钵，作为样品放置苗圃中进行缓苗养护；

S2：样品热处理：将幼苗设立对照组和实验组，分别放于热处理环境，热处理环境因素均设置相同，并且设定不同的胁迫温度；

S3：获得OJIP曲线和参数：测定样品叶片的OJIP曲线与相关的叶绿素荧光参数；

S4：分析与评价：对获得的OJIP曲线进行JIP-test分析，对数据进行处理与绘图，进行单因素方差分析(one-wayANOVA)和Duncan多重比较分析(α＝0.05)，将分析结果统计整理后得到评价结果。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S3中，测定样品叶片的OJIP曲线的具体步骤为：

S301：测定前将样品均暗适应20min，向暗适应后的叶片连续照射1s饱和脉冲红光(650nm，3500μmol·m

S302：选取植株从上往下第4-5片成熟叶片作为测定叶片，采用多功能植物效率分析仪测定样品叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，即OJIP曲线，并获得以下叶绿素荧光参数，包括初始荧光Fo(50μs)、反应中心(RCs)、K点(300μs)的荧光水平Fk、J点(2ms)的荧光水平F

作为本发明的一种优选技术方案，每天对样品进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定，每个品种的山核桃幼苗选取6株，并且对每株植物进行两次测量，每次测量后，将植物放回生长室并继续热处理。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S4中，对获得的OJIP曲线的参数对照表格中的公式加以计算，转换为本发明中所选用的JIP-test试验参数，参照表格为：

表1 OJIP曲线和JIP-test参数的公式说明

作为本发明的一种优选技术方案，所述S4中，进行单因素方差分析的具体步骤为：

分析各组样品的OJIP荧光诱导动力学曲线在不同胁迫温度时的表现、分析各组样品叶片OJIP曲线K相和J相在不同高温时的表现、分析，荧光诱导动力学OJIP曲线与荧光强度和温度之间存在相关性，因此可以分析不同的样品叶片在不同高温胁迫下的伤害程度差异和不同样品的相对可变荧光(ΔVt)的差异。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S4中，进行Duncan多重比较分析(α＝0.05)的具体步骤为：

通过W

分析各组样品叶片光合性能在不同高温下的表现：Fv/Fm反映PSⅡ的最大光能转换效率，观察在不同温度时各样品

分析各组样品叶片的PSI和PSII电子传递在不同高温的变化，高温胁迫后样品电子传递连通性越低，表明该样品对温度更加敏感。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中，热处理环境具体设置为：光照强度为520-680μmol·m

(三)有益效果

1.本发明提供的基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价评价方法，其OJIP曲线的变化主要取决于对PSII(Q

2.本发明提供的基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价评价方法，其所有处理叶片测定前均暗适应20min，向暗适应后的叶片连续照射1s饱和脉冲红光(650nm，3500μmol·m

3.本发明提供的基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价评价方法，对各组样品之间的相对可变荧光(ΔVt)进行差异分析，可以明显地反映出叶片放氧复合体和PSII复合物单元的变化，进而便于作为参考，分析各组山核桃的耐高温性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明的流程示意框图；

图2是本发明的高温胁迫对山核桃叶片快速荧光诱导曲线的变化示意图；

图3是本发明的高温胁迫对山核桃叶片相对可变荧光(ΔVt)的影响示意图；

图4是本发明实施例1中的曲线L带的各组样品F

图5是本发明实施例1中的曲线K带的各组样品F

图6是本发明的高温胁迫对山核桃叶片OJIP中V

图7是本发明的高温胁迫对山核桃叶片PSII反应中心的能量通量的影响示意图

图8是本发明的高温胁迫对山核桃叶片光合性能指数的影响示意图；

图9是本发明的高温胁迫对山核桃叶片量子产额和通量比的影响示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“上”、“下”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

如图1-9所示，基于快速荧光诱导动力学的山核桃耐高温性评价方法，具体包括以下步骤：

S1：样品收集和培养：供试品种分别为：湖南砧木山核桃、美国砧木山核桃、临安砧木山核桃及实生苗(以下简写‘HN’、‘MG’、‘LA’、‘SS’)。选用生长势良好、生长一致的幼苗栽于聚乙烯培养钵(上口径约24cm，高度26cm，下口径19.7cm)，作为样品放置苗圃中进行缓苗养护；

S2：样品热处理：将幼苗分别放于智能光照培养箱，光照强度为600μmol·m

S3：获得OJIP曲线和参数：采用多功能植物效率分析仪测定样品叶片的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，即OJIP曲线，每天对样品进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定，每个品种的山核桃幼苗选取6株，并且对每株植物进行两次测量，每次测量后，将植物放回生长室并继续热处理；

S4：分析与评价：参照表格的公式说明对获得的OJIP曲线进行JIP-test分析，使用Origin2017软件对数据进行处理与绘图，采用SPASS17.0进行单因素方差分析(one-wayANOVA)和Duncan多重比较分析(α＝0.05)，将分析结果统计整理后得到评价结果。

S301：测定前将样品均暗适应20min，向暗适应后的叶片连续照射1s饱和脉冲红光(650nm，3500μmol·m

S302：选取植株从上往下第4-5片成熟叶片作为测定叶片，采用多功能植物效率分析仪测定样品叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，即OJIP曲线，并获得以下叶绿素荧光参数，包括初始荧光Fo(50μs)、反应中心(RCs)、K点(300μs)的荧光水平F

对获得的OJIP曲线的参数对照表格中的公式加以计算，转换为本发明中所选用的JIP-test试验参数，参照表格为：

表1 OJIP曲线和JIP-test参数的公式说明

采用SPASS17.0进行单因素方差分析和进行Duncan多重比较分析(α＝0.05)的具体步骤为：

4种山核桃对照组(25℃)的荧光诱导动力学曲线呈典型的O-J-I-P曲线。30℃高温处理下，4种山核桃的OJIP曲线与相较于对照组无明显差异。随着胁迫温度升高(从35℃到43℃)，4种山核桃的OJIP曲线，在300ms左右出现“K”相，逐渐转变为O-K-J-I-P曲线。‘LA’与‘SS’的OJIP曲线分别在35℃开始发生变化，随着处理温度越高，OJIP曲线的变化越明显。随着温度的升高，‘LA’、‘SS’的OJIP曲线比‘HN’和‘MG’的OJIP曲线上升趋势更显著。胁迫温度高于35℃时，叶片的叶绿素荧光强度和P点荧光水平都会急剧下降(见图2C-E)。‘SS’在35℃-43℃高温胁迫时，K点较25℃有显著的上升，同时I点和P点急剧下降，P点明显低于其他三个品种。在43℃处理的情况下，‘SS’的K点荧光水平超过其他三个品种(见图2E)。相比之下，‘HN’和‘MG’叶片在40℃或43℃的高温胁迫下，叶绿素荧光强度下降幅度较小，K点水平也较低。另外，在40℃和43℃热胁迫下，F

对4个山核桃之间的相对可变荧光(ΔVt)进行差异分析。如图3所示，在35℃高温处理下，4种山核桃苗的ΔK、ΔJ均＞0，其中‘HN’和‘MG’的ΔK、ΔJ低于‘LA’和‘SS’的ΔK、ΔJ。40℃和43℃处理时，300μs左右出现K点处的叶绿素荧光产量均有明显增加(ΔK>0)。其中‘LA’和‘SS’的ΔK植较‘HN’和‘MG’显著上升。2ms处的ΔJ值也表现出同样的上升趋势，说明35℃处理时，‘HN’、‘LA’、‘SS’的放氧复合体的活性受到抑制。受抑制程度为‘LA’>‘SS’>‘HN’>‘MG’。

绘制4种山核桃在O(50μs)-K(300μs)相之间标准化的OJIP诱导曲线，即W

4种山核桃叶片OJIP曲线K相和J相的W

单位反应中心能量活性参数可以更准确地反映光合器官对光能的吸收，转化和耗散。ABS/RC是单位反应中心吸收的光能；叶片受到高温胁迫导致ABS/RC的增加。参考图7，受到高温胁迫的影响，‘LA’和‘SS’ABS/RC显著升高(P<0.05)。在43℃热胁迫后，该值增加了29％，远远高于‘HN’、‘MG’。TRo/RC是单位反应中心捕获的光能，‘LA’和‘SS’从30℃开始，其通量显著增加；而‘HN’和‘MG’则发生在40℃后。ETo/RC是单位反应中心用于电子传输的光能。在高温处理之前，‘LA’和‘SS’较对照组下降了15.4％和14.3％，‘HN’和‘MG’在40℃热胁迫后开始下降。在相同条件下，‘LA’和‘SS’DIo/RC的增幅明显高于‘HN’和‘MG’，35℃高温胁迫下就开始显着增加(P<0.05)。

Fv/Fm反映PSⅡ的最大光能转换效率。参考图8，30℃和35℃时，4种山核桃叶片的

PI

参考图9，当4种山核桃叶片在轻度胁迫(30℃)时，ΨEo和

参数δRo表示电子传递到PSI末端的效率。在35℃时，4种山核桃叶片δRo开始增加，当胁迫温度升高到40℃和43℃时，δRo值进一步升高。‘LA’和‘SS’在30℃时，

光合作用是植物对高温胁迫最敏感的生理过程之一，而叶绿素荧光动力学技术可以反映出光合器官在逆境胁迫下的内在变化。大量的研究表明，高温胁迫会导致OEC失活，电子传递能力降低，PSII活性下降。高温胁迫后，山核桃叶片OJIP曲线J-I和I-P相在35℃开始大幅下降，其中在43℃时都处于最低水平。其中‘LA’和‘SS’比‘MG’和‘HN’下降的更快。图2表明，在35℃高温胁迫下，‘LA’和‘SS’的ΔK、ΔJ值较‘MG’和‘HN’显著上升，说明35℃处理时，品种‘LA’和‘SS’叶片的光合性能受到损伤，OEC受到破坏，电子传递受到抑制；43℃处理时，品种‘LA’和‘SS’的ΔK值较其它两个品种显著上升，说明‘LA’和‘SS’叶片有大量QA－积累，QA与QB之间的电子传递受到严重抑制，PSII受体侧遭受到更严重的伤害，而‘MG’、‘HN’能够在高温胁迫下维持PSII(OEC)的稳定性。L带可表示PSII不同组分间的聚集性或天线色素与PSII活性反应中心RCs的能量传递连通性,植物遭受胁迫后,L带较高。品种‘LA’即使是在轻度热胁迫下(30℃)也会导致L带的能量连接性明显降低。在相同的胁迫温度下，‘LA’的连通性远低于其他三个品种。高温胁迫后的‘LA’的L带幅度增加得更快，因此，失去更多PSII能量连接的‘LA’对温度更加敏感。

综上分析，‘LA’和‘SS’的山核桃耐高温性弱于‘MG’和‘HN’，其中‘MG’也就是美国砧木山核桃耐高温性表现最为出色。

综上所述，本发明可以通过利用OJIP曲线了解到山核桃在光系统中电子传递的连通性程度，便于对该品种山核桃的耐高温性做出评价，在此过程中运用了快速叶绿素荧光动力学OJIP上升曲线和JIP-test分析，用于品种间耐热性差异筛选，以其无损、准确、快速的特点，科学有效地对山核桃的耐高温性作出评价。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。