一种4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测方法

摘要

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种4‑氨基‑3‑氟苯酚中邻氨基苯酚的检测方法，该方法包括：制备4‑氨基‑3‑氟苯酚供试品溶液；制备4‑氨基‑3‑氟苯酚和邻氨基苯酚对照品溶液；制备4‑氨基‑3‑氟苯酚和邻氨基苯酚系统适用性溶液；将所述供试品溶液、所述对照品溶液与所述系统适用性溶液进行高效液相色谱检测，检测条件如下：色谱柱为C18色谱柱；流动相A为由磷酸二氢钾和亚硫酸氢钠组成的缓冲液，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～5mmol/L；流动相B为甲醇和乙腈。本发明提供的检测方法重复性好，对于有效控制4‑氨基‑3‑氟苯酚的质量有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测方法。

背景技术

4-氨基-3-氟苯酚分子式为C

邻氨基苯酚为4-氨基-3-氟苯酚工业生产过程中的主要杂质，其结构如下所示：

4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的存在直接影响4-氨基-3-氟苯酚的质量，可能影响工艺反应，也可能传递到下一步工艺反应生成其他杂质，因此对4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚杂质含量的检测显得十分重要。现有技术中4-氨基-3-氟苯酚检测方法通常采用高效液相色谱法，流动相多为不同的缓冲盐水溶液乙腈洗脱，采用现有的方法在对4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚杂质进行检测时，存在重复性差，不能满足重复性要求的缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测方法，所述检测方法重复性好，对于有效控制4-氨基-3-氟苯酚的质量有重要的意义。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱法，所述检测方法包括如下步骤：

制备4-氨基-3-氟苯酚供试品溶液；

制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚对照品溶液；

制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚系统适用性溶液；

将所述供试品溶液、所述对照品溶液与所述系统适用性溶液进行高效液相色谱检测，检测条件如下：

色谱柱为C18色谱柱；

流动相A为由磷酸二氢钾和亚硫酸氢钠组成的缓冲液，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～5mmol/L；

流动相B为甲醇和乙腈。

优选的是，在将所述供试品溶液、所述对照品溶液与所述系统适用性溶液进行高效液相色谱检测步骤中，所述检测条件还包括：

柱温为30℃～40℃；流速为0.9～1.1mL/min；采用紫外检测器进行检测，检测波长为220nm～240nm；进样体积为5μL～15μL；洗脱方式为梯度洗脱。

上述任一方案中优选的是，所述色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱或月旭Ultimate XB-C18色谱柱，所述磷酸二氢钾的浓度为0.01～0.03mol/L，通过pH调节剂将所述流动相A的pH值调节为6～7，所述pH调节剂包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的至少一种，所述流动相B中所述甲醇和所述乙腈的体积比为(30～60)：(40～70)。

上述任一方案中优选的是，所述梯度洗脱具体为：

在0～8分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(90～98)∶(2～10)匀速渐变至(85～89)∶(11～15)；

在8～13分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(85～89)∶(11～15)不变；

在13～25分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(85～89)∶(11～15)匀速渐变至(80～84)∶(16～20)；

在25～50分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(80～84)∶(16～20)匀速渐变至(75～79)∶(21～25)；

在50～51分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(75～79)∶(21～25)匀速渐变至(90～98)∶(2～10)；

在51～60分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(90～98)∶(2～10)不变。

上述任一方案中优选的是，所述梯度洗脱具体为：

在0～8分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从95∶5匀速渐变至87∶13；

在8～13分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在87∶13不变；

在13～25分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从87∶13匀速渐变至83∶17；

在25～50分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从83∶17匀速渐变至78∶22；

在50～51分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从78∶22匀速渐变至95∶5；

在51～60分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在95∶5不变。

上述任一方案中优选的是，所述制备4-氨基-3-氟苯酚供试品溶液包括如下步骤：

利用甲醇溶解4-氨基-3-氟苯酚样品，制成每1mL含4-氨基-3-氟苯酚样品0.5mg～2mg的供试品溶液。

上述任一方案中优选的是，所述制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚对照品溶液包括如下步骤：

利用甲醇溶解4-氨基-3-氟苯酚对照品和邻氨基苯酚对照品，制成每1mL含邻氨基苯酚对照品5μg～10μg、4-氨基-3-氟苯酚对照品1μg～5μg的对照品溶液。

上述任一方案中优选的是，所述制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚系统适用性溶液包括如下步骤：

利用甲醇溶解4-氨基-3-氟苯酚对照品和邻氨基苯酚对照品，制成每1mL含邻氨基苯酚对照品5μg～10μg、4-氨基-3-氟苯酚对照品0.5mg～2mg的系统适用性溶液。

上述任一方案中优选的是，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～0.2mmol/L。

上述任一方案中优选的是，在将所述供试品溶液、所述对照品溶液与所述系统适用性溶液进行高效液相色谱检测步骤中，所述检测条件如下：

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；流动相A为由磷酸二氢钾和亚硫酸氢钠组成的缓冲液，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.1mmol/L，所述磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L，用氢氧化钾溶液将所述流动相A的pH值调节为6.5；流动相B为甲醇和乙腈，所述甲醇和所述乙腈的体积比为30:70；柱温为30℃；流速为1mL/min；采用紫外检测器进行检测，检测波长为224nm；进样体积为5μL；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱具体为：

在0～8分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从95∶5匀速渐变至87∶13；在8～13分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在87∶13不变；在13～25分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从87∶13匀速渐变至83∶17；在25～50分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从83∶17匀速渐变至78∶22；在50～51分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从78∶22匀速渐变至95∶5；在51～60分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在95∶5不变。

本发明发现因邻氨基苯酚在溶液状态下，容易被氧化，导致高效液相色谱分析时，重复性很差。本发明通过在流动相中加入亚硫酸氢钠来检测4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的含量，该检测方法重复性好、专属性强、准确度高、分离效果好，对控制4-氨基-3-氟苯酚的质量有重要的意义。

附图说明

图1为按照实施例2提供的检测方法对供试品1检测得到的高效液相色谱图；

图2为按照实施例2提供的检测方法对供试品1检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图3为按照实施例2提供的检测方法对供试品2检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图4为按照实施例2提供的检测方法对供试品3检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图5为按照实施例2提供的检测方法对供试品4检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图6为按照实施例2提供的检测方法对供试品5检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图7为按照实施例2提供的检测方法对供试品6检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图8为按照实施例3提供的检测方法对空白溶剂检测得到的高效液相色谱图；

图9为按照实施例3提供的检测方法对系统适用性溶液检测得到的高效液相色谱图；

图10为按照实施例3提供的检测方法对系统适用性溶液检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图11为本发明实施例5中邻氨基苯酚的浓度-峰面积标准曲线图；

图12为按照对比例1提供的检测方法对供试品1检测得到的高效液相色谱图；

图13为按照对比例1提供的检测方法对供试品1检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图14为按照对比例1提供的检测方法对供试品2检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图15为按照对比例1提供的检测方法对供试品3检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图16为按照对比例1提供的检测方法对供试品4检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图17为按照对比例1提供的检测方法对供试品5检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图18为按照对比例1提供的检测方法对供试品6检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图19为按照对比例2提供的检测方法对供试品1检测得到的高效液相色谱图；

图20为按照对比例2提供的检测方法对供试品1检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图21为按照对比例2提供的检测方法对供试品2检测得到的高效液相色谱图的峰表；

图22为按照对比例2提供的检测方法对供试品3检测得到的高效液相色谱图的峰表。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除另有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可以通过市场上购买或者按照本领域常规方法合成制备；所述实验试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例提供了一种4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)制备4-氨基-3-氟苯酚供试品溶液；

(2)制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚对照品溶液；

(3)制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚系统适用性溶液；

(4)将所述供试品溶液、所述对照品溶液与所述系统适用性溶液进行高效液相色谱检测，检测条件如下：

色谱柱为C18色谱柱；

流动相A为由磷酸二氢钾和亚硫酸氢钠组成的缓冲液，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～5mmol/L；

流动相B为甲醇和乙腈。

所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～5mmol/L，例如亚硫酸氢钠的浓度可以为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L或5mmol/L等，如果流动相A中亚硫酸氢钠的浓度过低，无法克服采用高效液相色谱法检测4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚重复性差的缺点，如果亚硫酸氢钠的浓度过高，将导致无法检测到邻氨基苯酚色谱峰，因此只有亚硫酸氢钠的浓度在0.05～5mmol/L范围内时，既能克服采用高效液相色谱法检测4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚时重复性差的缺点，也能实现对4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测。为了得到的色谱峰更优，峰面积更大，邻氨基苯酚与4-氨基-3-氟苯酚及各杂质分离度更好，优选地，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～0.2mmol/L，例如亚硫酸氢钠的浓度为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.12mmol/L、0.14mmol/L、0.16mmol/L、0.18mmol/L或0.2mmol/L，更优选地，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.1mmol/L。

向流动相A中加入的还原剂的选择需要综合考虑多种因素，该还原剂化学稳定性好，不与待测样品发生化学反应，具有较好的溶解度，不在流动相A中形成小颗粒，该还原剂的色谱峰对待测样品的色谱峰不产生干扰且得到的待测样品的色谱峰形较优，因此本发明实施例选择将亚硫酸氢钠加入到流动相A中，亚硫酸氢钠通常不出峰，加入该还原剂后对待测样品的色谱峰不产生干扰。

根据本发明的实施例，对所述4-氨基-3-氟苯酚供试品溶液进行高效液相色谱检测分析，基于高效液相色谱检测结果，确定所述4-氨基-3-氟苯酚供试品溶液中邻氨基苯酚的含量，本发明通过在流动相中加入亚硫酸氢钠来检测4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的含量，该检测方法重复性好、专属性强、准确度高、线性良好、分离效果好，对控制4-氨基-3-氟苯酚的质量有重要的意义。

进一步地，在步骤(4)中，所述检测条件还包括：柱温为30℃～40℃，例如柱温可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等，柱温升高可加快分离过程，但因样品保留时间不稳将增加检测工作的麻烦，当柱温降低时，流动相黏度增加，分离过程时间会加长，会延长检测时间，因此控制柱温在30℃～40℃既可以确保检测结果的稳定性，也可以实现较快地检测4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的含量，优选地，柱温为30℃。

进一步地，在步骤(4)中，所述检测条件还包括：流速为0.9～1.1mL/min，例如流速可以为0.9mL/min、1mL/min或1.1mL/min等，优选地，流速为1mL/min。

进一步地，在步骤(4)中，所述检测条件还包括：采用紫外检测器进行检测，检测波长为220nm～240nm，例如检测波长可以为220nm、222nm、224nm、226nm、228nm、230nm、235nm或240nm等，4-氨基-3-氟苯酚及其杂质在224nm附近处有最大吸收，因此，紫外检测器的检测波长设置为220nm～240nm之间，均可进一步提高检测的准确度。

进一步地，在步骤(4)中，所述检测条件还包括：进样体积为5μL～15μL，例如进样体积可以为5μL、7μL、9μL、11μL、13μL或15μL等，为了满足灵敏度要求且峰形最优，优选地，进样体积为5μL。

进一步地，在步骤(4)中，所述检测条件还包括：洗脱方式为梯度洗脱。

进一步地，所述色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱或月旭Ultimate XB-C18色谱柱，色谱柱对4-氨基-3-氟苯酚及其相关物质的检测具有重要影响，如果色谱柱(例如Diamonsil C18(2)色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)、

进一步地，所述磷酸二氢钾的浓度为0.01～0.03mol/L，例如磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L、0.02mol/L或0.03mol/L等，如果磷酸二氢钾浓度过高，则容易析出，有可能对仪器和色谱柱造成损伤，因此将磷酸二氢钾的浓度控制在0.01～0.03mol/L范围内，优选地，磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L。

进一步地，通过pH调节剂将所述流动相A的pH值调节为6～7，例如流动相A的pH值可以为6、6.5或7等，如果pH值过低，4-氨基-3-氟苯酚出峰时间过早，会干扰主峰及杂质峰检测，优选地，pH值为6.5，

进一步地，所述pH调节剂包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的至少一种。

进一步地，所述流动相B中所述甲醇和所述乙腈的体积比为(30～60)：(40～70)，例如甲醇和乙腈的体积比可以为30:70、35:65、40:60、50:50或60:40等，为了使得到的色谱峰峰形更好，优选地，甲醇和乙腈的体积比为30:70。

如果流动相不同，色谱峰峰形差距会非常大，当所述流动相B为水-甲醇流动相体系时，杂质峰形不好，拖尾严重；当所述流动相B为乙醇-乙腈流动相体系时，杂质峰形有分叉；当所述流动相B为甲醇-乙腈流动相体系时，4-氨基-3-氟苯酚及邻氨基苯酚与其它各杂质的分离度较好，且基线平稳；当将所述流动相A中的磷酸二氢钾替换为醋酸时，基线噪音增大且梯度洗脱条件下基线漂移严重。

进一步地，所述梯度洗脱具体为：

在0～8分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(90～98)∶(2～10)匀速渐变至(85～89)∶(11～15)；

在8～13分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(85～89)∶(11～15)不变；

在13～25分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(85～89)∶(11～15)匀速渐变至(80～84)∶(16～20)；

在25～50分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(80～84)∶(16～20)匀速渐变至(75～79)∶(21～25)；

在50～51分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(75～79)∶(21～25)匀速渐变至(90～98)∶(2～10)；

在51～60分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(90～98)∶(2～10)不变。

所述供试品溶液中各物质极性均有所差异，采用梯度洗脱的方式可以使得主峰及各杂质峰均能够达到更好的分离。

进一步地，所述梯度洗脱具体为：

在0～8分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从95∶5匀速渐变至87∶13；在8～13分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在87∶13不变；在13～25分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从87∶13匀速渐变至83∶17；在25～50分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从83∶17匀速渐变至78∶22；在50～51分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从78∶22匀速渐变至95∶5；在51～60分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在95∶5不变。

进一步地，所述制备4-氨基-3-氟苯酚供试品溶液包括如下步骤：

利用甲醇溶解4-氨基-3-氟苯酚样品，制成每1mL含4-氨基-3-氟苯酚样品0.5mg～2mg(例如可以为0.5mg、1mg、1.5mg或2mg等)的供试品溶液，

进一步地，所述制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚对照品溶液包括如下步骤：

利用甲醇溶解4-氨基-3-氟苯酚对照品，制成每1mL含4-氨基-3-氟苯酚对照品1μg～5μg(例如可以为1μg、2μg、3μg、4μg或5μg等)的4-氨基-3-氟苯酚对照品溶液；

利用甲醇溶解邻氨基苯酚对照品，制成每1mL含邻氨基苯酚对照品5μg～10μg(例如可以为5μg、6μg、7μg、8μg或10μg等)的邻氨基苯酚对照品溶液。

进一步地，所述制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚对照品溶液包括如下步骤：

称取适量4-氨基-3-氟苯酚对照品和邻氨基苯酚对照品置同一容量瓶中，向容量瓶中加入适量甲醇溶解并定容，制成每1mL含邻氨基苯酚对照品5μg～10μg

(例如可以为5μg、6μg、7μg、8μg或10μg等)和4-氨基-3-氟苯酚对照品1μg～5μg(例如可以为1μg、2μg、3μg、4μg或5μg等)的对照品溶液。

进一步地，所述制备4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚系统适用性溶液包括如下步骤：

利用甲醇溶解4-氨基-3-氟苯酚对照品和邻氨基苯酚对照品，制成每1mL含邻氨基苯酚对照品5μg～10μg(例如可以为5μg、6μg、7μg、8μg、9μg或10μg等)、4-氨基-3-氟苯酚对照品0.5mg～2mg(例如可以为0.5mg、1mg、1.5mg或2mg等)的系统适用性溶液。

进一步地，在步骤(4)中，所述检测条件如下：

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；流动相A为由磷酸二氢钾和亚硫酸氢钠组成的缓冲液，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.1mmol/L，所述磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L，用氢氧化钾溶液将所述流动相A的pH值调节为6.5；流动相B为甲醇和乙腈，所述甲醇和所述乙腈的体积比为30:70；柱温为30℃；流速为1mL/min；采用紫外检测器进行检测，检测波长为224nm；进样体积为5μL；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱具体为：

在0～8分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从95∶5匀速渐变至87∶13；

在8～13分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在87∶13不变；

在13～25分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从87∶13匀速渐变至83∶17；

在25～50分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从83∶17匀速渐变至78∶22；

在50～51分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比从78∶22匀速渐变至95∶5；

在51～60分钟内，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在95∶5不变。

本发明实施例提供了最优的检测条件，根据本发明实施例提供的检测条件对4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚进行检测，该检测方法重复性好，专属性强，准确度高，分离效果好，线性良好，得到的色谱峰峰形优、基线平稳，对控制4-氨基-3-氟苯酚的质量有重要的意义。

进一步地，所述检测方法还包括获得标准曲线，所述标准曲线的获得是通过如下方式进行的：(1)利用前面所述的检测方法分别测定不同浓度的邻氨基苯酚对照品，其中，所述邻氨基苯酚对照品的浓度为6.006μg/mL、4.5045μg/mL、3.6036μg/mL、3.003μg/mL、1.5015μg/mL、0.6006μg/mL、0.1301μg/mL，(2)以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。由此，利用所述标准曲线，通过检测待测4-氨基-3-氟苯酚样品中邻氨基苯酚所对应的峰面积，从而获知待测4-氨基-3-氟苯酚样品中邻氨基苯酚所对应的含量。

以下实施例中所涉及的对照品来源：

4-氨基-3-氟苯酚：连云港盛和生物科技有限公司，批号：20190817，纯度99.49％；

邻氨基苯酚：北京偶合科技有限公司，批号：20200113，纯度98.00％。

以下实施例中，采用的仪器如下：

高效液相色谱仪：岛津HPLC-2030(紫外检测器)；分析天平：Sartorius CPA225D。

以下实施例和对比例中，所用到的溶液的配制方法如表1所示：

表1

实施例1亚硫酸氢钠用量考察

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A的制备：分别称取适量的磷酸二氢钾置4个不同的容量瓶中，用水分别溶解，再分别加入不同量的亚硫酸氢钠，用水定容，然后用氢氧化钾溶液调节pH值为6.5，得到4份缓冲液，所述缓冲液中磷酸二氢钾的浓度均为0.01mol/L，亚硫酸氢钠的浓度分别为0.1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L，考察上述4分缓冲液分别作为流动相A时对检测结果的影响；流动相B为甲醇-乙腈，甲醇和乙腈的体积比是30:70；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；检测波长为224nm；进样体积为5μL；

梯度洗脱程序：

。

实验步骤：

(1)按照表1中空白溶剂的制备方法、对照品溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法、系统适用性溶液的制备方法制备空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液。

(2)分别取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液各5μL按照本实施例色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，分析结果如表2所示。对空白溶剂进行色谱分析，是为了检测空白溶剂中是否存在对待检测成分对应的色谱峰有干扰的色谱峰；对系统适用性溶液进行色谱分析，是为了确定待检测成分与其它成分的色谱峰的分离度是否良好，待检测成分的色谱峰是否均在色谱图上体现。

表2

由表2可以看出，随着流动相A中亚硫酸氢钠浓度逐渐降低，供试品溶液中4-氨基-3-氟苯酚、对氨基苯酚、邻氨基苯酚对应的峰面积均相应增加，当流动相A中亚硫酸氢钠浓度为0.1mmol/L时，对氨基苯酚和邻氨基苯酚均被检出，因此，最优选地，流动相A中亚硫酸氢钠浓度为0.1mmol/L，可以满足检测灵敏度要求。

实施例2重复性验证

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A的制备：分别称取适量的磷酸二氢钾和亚硫酸氢钠置同一容量瓶中，用水溶解并定容，然后用氢氧化钾溶液调节pH值为6.5，得到缓冲液，所述缓冲液中磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L，亚硫酸氢钠的浓度为0.1mmol/L；流动相B为甲醇-乙腈，甲醇和乙腈的体积比是30:70；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；检测波长为224nm；进样体积为5μL；

梯度洗脱程序：

实验步骤：

(1)按照表1中供试品溶液的制备方法平行配制6份供试品溶液。

(2)按照表1中空白溶剂的制备方法、对照品溶液的制备方法、系统适用

性溶液的制备方法制备空白溶剂、对照品溶液、系统适用性溶液。

(3)分别取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液各5μL按照本实施例色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图进行高效液相色谱分析，按照外标法计算邻氨基苯酚含量，并计算其相对标准偏差，分析结果如表3所示，供试品1的色谱图如图1所示，供试品2-6的色谱图与供试品1的色谱图类似，供试品-1-6的色谱图对应的峰表如图2-7所示。

表3

根据中国药典2020年版四部通则9101分析方法验证指导原则中要求(如表4所示)，邻氨基苯酚重复性可接受范围应为RSD值不大于3％，由表3可知邻氨基苯酚含量的RSD值为1.14％，小于3％，符合药典要求，重复性良好。

表4 样品中待测定成分的含量与精密度可接受范围关系

实施例3专属性验证

色谱条件：同实施例2色谱条件。

实验步骤：

(1)将实施例2制备的供试品1作为供试品溶液。

(2)按照表1中空白溶剂的制备方法、系统适用性溶液的制备方法制备空白溶剂、系统适用性溶液。

(3)分别取空白溶剂、供试品溶液、系统适用性溶液各5μL按照本实施例色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，进行高效液相色谱分析，如图1、图8和图9所示，图1为供试品溶液色谱图，图8为空白溶剂色谱图，图9为系统适用性溶液色谱图，图10为系统适用性溶液色谱图对应的峰表，4-氨基-3-氟苯酚的保留时间为8.771min，邻氨基苯酚的保留时间为11.495min，由图1、图8和图9可知，空白溶剂峰不干扰4-氨基-3-氟苯酚及各已知杂质和未知杂质的测定，由图2可知4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚与其它各组分的分离度均大于1.5，符合要求，表明根据本发明实施例提供的检测方法能够有效将4-氨基-3-氟苯酚和邻氨基苯酚与其它各组分分离，专属性好。

实施例4定量限

色谱条件：同实施例2色谱条件。

实验步骤：

精密称取邻氨基苯酚对照品10mg，置50mL容量瓶中作为贮备液。用甲醇溶解并逐级稀释后单独进样5μL，以信噪比(S/N)≈10时的相应浓度作为定量限浓度，此时邻氨基苯酚的浓度为0.13μg/mL。

实施例5线性与范围

色谱条件：同实施例2色谱条件。

实验步骤：

(1)按照表1中对照品溶液贮备液的制备方法制备对照品溶液贮备液。

(2)精密量取30mL对照品溶液贮备液于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到稀释液，分别精密量取稀释液各2mL，1.5mL，1.2mL，1.0mL，0.5mL，0.2mL置不同10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得6份线性溶液，分别作为线性200％、150％、120％、100％、50％、20％溶液。

(3)取邻氨基苯酚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每1mL含邻氨基苯酚对照品0.13μg的溶液，作为定量限溶液。

(4)分别取线性溶液各5μL按照本实施例色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，以邻氨基苯酚的浓度为横坐标，以邻氨基苯酚峰峰面积为纵坐标进行线性回归，具体结果如表5所示，得线性回归方程为y＝16,148.9923x-3,161.8271，相关系统r为0.999，标准曲线如图11所示，由图11可知，在本实施例色谱条件下，邻氨基苯酚浓度在0.1301～6.006μg/mL范围内线性关系良好。

表5

实施例6回收率

色谱条件：同实施例2色谱条件。

实验步骤：

(1)按照表1中对照品溶液贮备液的制备方法，平行配制两份对照品溶液贮备液。

(2)按照表1中对照品溶液的制备方法，平行配制两份对照品溶液。

(3)按照表1中供试品溶液、系统适用性溶液的制备方法制备供试品溶液、系统适用性溶液。

(4)定量限溶液贮备液：取邻氨基苯酚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含邻氨基苯酚对照品约1.3ug的溶液，作为定量限溶液贮备液。

(5)回收率溶液：

定量限回收率溶液：取4-氨基-3-氟-苯酚供试品约50mg，精密称定置50mL容量瓶中，加入适量甲醇使溶解，加入定量限溶液贮备液5mL，作为定量限回收率溶液，平行制备3份，每份定量限回收率溶液的体积为50mL。

50％回收率溶液：取4-氨基-3-氟-苯酚供试品约50mg，精密称定置50mL容量瓶中，加入适量甲醇使溶解，加入对照品溶液储备液2.5mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得，平行配制三份，每份50％回收率溶液的体积为50mL。

100％回收率溶液：取4-氨基-3-氟-苯酚供试品约50mg，精密称定置50mL容量瓶中，加入适量甲醇使溶解，加入对照品溶液储备液5mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得，平行配制三份，每份100％回收率溶液的体积为50mL。

150％回收率溶液：取4-氨基-3-氟-苯酚供试品约50mg，精密称定置50mL容量瓶中，加入适量甲醇使溶解，加入对照品溶液储备液7.5mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得，平行配制三份，每份150％回收率溶液的体积为50mL。

(6)分别取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、回收率溶液各5μL按照本实施例色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，按外标法计算邻氨基苯酚含量，计算邻氨基苯酚回收率，具体结果如表6所示，

表6

表6为4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚回收率计算结果，测得量指的是采用本实施例提供的检测方法对回收率溶液进行高效液相色谱分析，按照外标法计算得到的50mL回收率溶液中邻氨基苯酚的含量；本底量指的是采用本实施例提供的检测方法对供试品溶液进行高效液相色谱分析，按照外标法计算得出供试品中邻氨基苯酚的百分含量，然后用每份供试品的称样量乘以检测出来的百分含量，算出该称样量下的本底量；加入量指的是50mL回收率溶液中实际加入的邻氨基苯酚的量。

由表6可知，4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的回收率在95％～105％范围内，证明该方法的准确度良好。

实施例7对4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的检测

色谱条件：同实施例2色谱条件。

实验步骤：

(1)按照表1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。

(2)按照表1中对照品溶液的制备方法制备对照品溶液。

(3)按照表1中系统适用性溶液的制备方法制备系统适用性溶液。

(4)按照表1中空白溶剂的制备方法制备空白溶剂。

(5)精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、供试品溶液和对照品溶液各5μL按照本实施例色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，进行高效液相色谱分析，按照外标法计算4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的含量，根据本实施例提供的检测方法可以实现对4-氨基-3-氟苯酚的质量进行有效的控制。

对比例1

色谱条件：与实施例2色谱条件基本相同，不同之处在于所述流动相A中不含有亚硫酸氢钠。

实验步骤：

(1)按照表1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行配制6份。

(2)取供试品溶液5μL按照本实施例色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，进行高效液相色谱分析，按照外标法计算邻氨基苯酚含量，具体结果如表7所示，供试品1的色谱图如图12所示，供试品2-6的色谱图与供试品1色谱图类似，供试品1-6色谱图对应的峰表如图13-18所示。

表7

由表7可知，测得的4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的含量的重复性非常差，根据中国药典2020年版四部通则9101分析方法验证指导原则中要求(如表4所示)，邻氨基苯酚重复性可接受范围应为RSD值不大于3％，而目前方法检测结果RSD值为14.7％，不符合药典要求。

对比例2

色谱条件：与实施例2色谱条件基本相同，不同之处在于所述流动相A中不含有亚硫酸氢钠。

实验步骤：

(1)制备亚硫酸氢钠溶液贮备液：称取亚硫酸氢钠1.0g至100mL容量瓶中，用纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

(2)制备供试品溶液：精密称取供试品约10mg置10mL容量瓶中，加入1mL亚硫酸氢钠溶液贮备液，3mL甲醇，超声20min，放冷至室温，用甲醇定容到10mL，摇匀即得，平行配制3份。

(3)制备空白溶剂：精密量取亚硫酸氢钠溶液贮备液5mL置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

(4)取空白溶剂、供试品溶液各5μL按照本实施例色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，进行高效液相色谱分析，按照外标法计算邻氨基苯酚含量，具体结果如表8所示，供试品1色谱图如图19所示，供试品2和3的色谱图与供试品1的色谱图类似，供试品1-3色谱图对应的峰表如图20-22所示。

表8

由表8可知，供试品中加入亚硫酸氢钠溶液后，测得的4-氨基-3-氟苯酚中邻氨基苯酚的含量的重复性非常差，RSD值为15.7％，不符合药典要求。

对比例3

色谱条件：与实施例2色谱条件基本相同，不同之处在于所述流动相A中不含有亚硫酸氢钠。

实验步骤：

(1)制备亚硫酸氢钠溶液贮备液：取适量亚硫酸氢钠置容量瓶中，用纯化水溶解并定量稀释成每1mL含亚硫酸氢钠20mg的溶液，作为亚硫酸氢钠溶液贮备液。

(2)制备供试品溶液：精密称取供试品约10mg置10mL容量瓶中，加入1mL亚硫酸氢钠溶液贮备液，3mL甲醇，超声20min，放冷至室温，用甲醇定容到10mL，摇匀即得，平行配制3份。

(3)取供试品溶液5μL按照本实施例色谱条件，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，按照外标法计算邻氨基苯酚含量，计算三份供试品的邻氨基苯酚的含量的相对标准偏差RSD，RSD为13.9％，大于药典3％要求，不符合检测要求。

对比例4

色谱条件：与实施例2色谱条件基本相同，不同之处在于所述流动相A中不含有亚硫酸氢钠。

实验步骤：

(1)制备亚硫酸氢钠溶液贮备液：取适量亚硫酸氢钠置容量瓶中，用纯化水溶解并定量稀释成每1mL含亚硫酸氢钠1mg的溶液，作为亚硫酸氢钠溶液贮备液。

(2)制备供试品溶液：精密称取供试品约10mg置10mL容量瓶中，加入1mL亚硫酸氢钠溶液贮备液，3mL甲醇，超声20min，放冷至室温，用甲醇定容到10mL，摇匀即得，平行配制3份。

(3)取供试品溶液5μL按照本实施例色谱条件，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，按照外标法计算邻氨基苯酚含量，计算三份供试品的邻氨基苯酚的含量的相对标准偏差RSD，RSD为16.8％，大于药典3％要求，不符合检测要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。