用于筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法

摘要

本发明公开了一种用于筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法，所述方法包括：将圆锥石头花种子分组，将各组种子对应不同时间进行EMS诱变，得到EMS诱变的圆锥石头花种子；将所述EMS诱变的圆锥石头花种子播种至泥炭和珍珠岩混合物的基质上，培育至发芽，长成圆锥石头花幼苗；培育所述圆锥石头花幼苗至突变体植株；对所述突变体植株进行数据统计分析，并分离获得圆锥石头花的重瓣花突变体。本发明筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法通过正向遗传突变体筛选，鉴定出三种在花型和花色上具有不同变异的重瓣花突变体，以及许多其他表型。本发明的EMS诱变的结果与发现的数种突变体的预期一致，表明本发明方法对圆锥石头花种子的诱变成功。

说明书

技术领域

本发明涉及生物育种技术领域，具体涉及一种用于筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法。

背景技术

圆锥石头花(Gypsophila paniculata)是石头花属的一种开花植物，是该属植物中唯一用作切花的种(Li等，2019)。由于其观赏价值，圆锥石头花是全球商业花卉栽培中最重要的切花之一(Zvi等，2008)。然而，使用传统育种方法培育特定花型性状的遗传变异是圆锥石头花育种中的一个主要障碍(Wang等，2013)。结果，世界花卉市场上的商业品种之间缺乏变异(Zvi等，2008)。因此，在过去的十年中，对具有观赏性状的新特征的新品种有巨大的需求。

具有改变表型的多种突变体的产生提供了鉴定和表征相关基因的生物学功能的关键工具。已经开发出多种诱变办法和方法，例如T-DNA插入、辐照和化学方法(Alonso等，2003；Belfield等，2012；Jansen等，1997)。每种方法都有产生突变的优点和缺点，但是化学诱变是很容易获得的，并且与其他方法相比会产生更细微的变化。例如，甲烷磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)诱导了核苷酸的化学修饰，导致错配和碱基对变化。EMS诱导的鸟嘌呤(G)残基的烷基化导致胸腺嘧啶(T)配对，而不是胞嘧啶(C)配对。随后，通过DNA修复将原来的G/C对替换为A/T对(Greene等，2003)。EMS诱变在拟南芥(Arabidopsis)中产生了遍布基因组均匀分布的突变，主要诱导C至T的变化，导致C/G至T/A的置换，较少的G/C至C/G或G/C至T/A的颠换或A/T至G/C的转换(Kim等，2006)。由于主要存在单核苷酸多态性或置换，因此可分离功能丧失性或功能获得性突变体。结合正向遗传学方法，可监测和检测大量随机诱变处理的个体的变化(Alonso和Ecker，2006年)。

花型是关键的观赏性状之一，也是圆锥石头花育种中的头等大事。育种家已经发布了数种具有重瓣花型的圆锥石头花商业品种，例如“Million Stars”、“Bristol Fairy”、“Snowball”和“Huixing 1”(Li等，2020；Shibuya等，2017)。考虑到与遗传改造相关特殊观赏性状的挑战性，EMS诱变是有效诱导可能导致性状改良突变体的理想替代方案。此外，通过EMS诱变已经鉴定出数种特定的突变表型，例如大花马齿苋(Portulaca grandiflora)的重瓣花突变体(Lokeshwar和Bhalla，1982)、观赏姜的矮化和杂色植株(Sakhanokho等，2012)以及四种蝇子草(Silene)种的有价值的观赏突变体(Jiang和Dunn，2017)。因此，通过EMS诱导基因突变提供了简便的方法为通过创制有益的突变开展观赏植物育种。

发明内容

为此，本发明提供一种用于筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例提供一种用于筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法，所述方法包括：

将圆锥石头花种子分组，将各组种子对应不同时间进行EMS诱变，得到EMS诱变圆锥石头花种子；

将所述EMS诱变圆锥石头花种子播种至泥炭和珍珠岩混合物的基质上，培育至发芽，长成圆锥石头花幼苗；

培育所述圆锥石头花幼苗至长成突变体植株；

对所述突变体植株进行分析，并分离获得圆锥石头花的重瓣花突变体。

优选地，所述EMS的浓度为150mM EMS。

优选地，所述每组圆锥石头花种子的数量为1000。

优选地，所述每组圆锥石头花种子重量为0.641±0.02g。

优选地，所述EMS诱变过程为：

将干燥的所述圆锥石头花种子放入离心管中，4℃下，用100mM磷酸钾缓冲液预吸过夜；

除去磷酸钾缓冲液，向所述离心管中加入10mL 100mM磷酸钾缓冲液，向所述磷酸钾缓冲溶液中加入EMS至终浓度150mM/L；

将所述圆锥石头花种子在磷酸钾缓冲溶液中孵育6h孵育后，将所述圆锥石头花种子在30min内，先后用100mM/L的硫代硫酸钠和蒸馏水洗涤10次，将圆锥石头花种子干燥。

优选地，所述不同时间为0小时、4小时、6小时、8小时和12小时。

优选地，所述EMS诱变时间为6h。

优选地，所述EMS诱变圆锥石头花种子在一周内播种培育。

上述所述方法制备得到的圆锥石头花的重瓣花突变体，也属于本发明的保护范围。

本发明具有如下优点：

本发明是通过正向遗传学方法开展圆锥石头花的重瓣花突变体筛选的有效方法，鉴定出三种在花型和花色上具有不同变异的重瓣花突变体，以及许多其他表型。本发明的EMS诱变的结果与发现了数种突变体的预期一致，表明本发明方法对圆锥石头花野生型种子的诱变成功。在缺乏圆锥石头花基因组信息和有效的遗传改造的情况下，本发明提供了形成圆锥石头花多种突变体的简单方法，并为圆锥石头花的遗传改造和分子育种提供了基础材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供圆锥石头花的野生型植株和花的表型，比例尺为10cm；

图2为本发明实施例提供的使用150mM EMS在圆锥石头花中不同处理时间下M1种子的发芽率，平均发芽率来自三个重复，单向方差分析用于评估统计显著性，p值是通过Tukey的HSD检验计算出的(α＝0.05)；

图3为本发明实施例提供的具有不同类型的植株和叶的EMS突变体的表型，其中，A：M1群体中的多种叶型，每片叶均收集自不同的突变体；B：M1群体中突变体的典型植株表型，比例尺为1cm；

图4为本发明实施例提供的具有不同花型和花色的重瓣花突变体的表型，相同的花纵线源自一株突变植物，比例尺为1cm；

图5为本发明实施例提供的具有不同花型的重瓣花突变体中AG的氨基酸序列比对，相同的氨基酸以黑色背景表示，而序列差异则以白色突出显示。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料和方法：植物材料，这项研究选择了圆锥石头花的野生型，其具有单瓣粉红色花，如图1所示。圆锥石头花的种子是从玉溪云星生物技术有限公司(中国玉溪)获得的。圆锥石头花种子的千粒重(thousand kernel weight，TKW)为约0.641g(n＝10)。

实施例1

本实施例提供用于筛选圆锥石头花的重瓣花突变体的有效方法，其包括以下步骤：

1、圆锥石头花种子EMS诱变

为了确定EMS诱变的最佳处理时间，在对大量种子进行诱变处理之前，使用150mMEMS在不同时间(0小时、4小时、6小时、8小时和12小时，3次重复，每次重复1000粒种子)时以梯度过程进行预处理。基于可见性状的标准(例如50％的种子发芽控制率、幼苗的白化和毛状体表型)来选择最佳处理(Li，2018)。每种处理的种子发芽率数据示于表1，使用150mMEMS在圆锥石头花中不同诱变时间的种子发芽率。单向方差分析用于评估统计显著性，p值是用Tukey的HSD检验计算出的(α＝0.05)。Sig.＝显著性。

表1

为避免暴露于有毒和致癌的EMS，诱变过程在通风橱中的Plexiglas手套箱中进行。将约30,000个充分干燥的种子(19.23g)放入10ml离心管中，并在4℃下用100mM磷酸钾缓冲液过夜处理。除去磷酸钾缓冲液后，添加10mL新鲜的100mM磷酸钾缓冲液。然后添加154.4μL EMS至终浓度150mM。在室温下轻轻摇动将种子在溶液中孵育6小时。孵育后，将种子在30分钟内顺序地用100mM硫代硫酸钠和蒸馏水彻底洗涤10次。然后将种子小心地转移至滤纸，使其完全干燥过夜。经诱变处理的种子需要尽快播种，这是由于经EMS诱变处理的M1种子(经诱变剂处理的第一代种子)非常弱，不能长时间保存(即使1周后，种子也会全部死亡)。

2、圆锥石头花种子突变体的筛选

圆锥石头花种子EMS诱变后，将所有种子播种至泥炭和珍珠岩混合物的基质上，以便在育种床上发芽。然后使经诱变处理的幼苗在云南省农业科学院的实验农场中在自然光周期下的日光温室中生长。本实施例研究了与野生型相比显示出任何变异的显性突变体。观察并研究了五块场地(每块一平方米)中随机种植的植株，包括总植株和显性突变体的数量。

3、结果

3.1EMS诱变方法，在EMS诱变的预处理中，对照的种子发芽率(0小时)为71.13％(n＝3，如图2所示)，而种子的发芽率则随着诱变时间的增加而显著降低(α＝0.05)。处理6小时后，种子发芽率降低至38.47％(n＝3)，为种子发芽率对照的约一半。同时，还确定了经过6小时处理的经诱变处理幼苗中的一些可见性状，如白化植株和毛状体表型。这表明150mMEMS的6小时处理是对圆锥石头花的EMS诱变的理想方法。

据估计，5,000个经EMS诱变处理的M1群体足以在拟南芥中任意给定基因中产生突变，这是由于EMS会在每个个体中产生多点突变(Qu和Qin，2014)。圆锥石头花基因组中有超过56000个基因，是拟南芥(27655个基因)的两倍多(Initiative，2000)。因此，EMS诱变圆锥石头花至少需要10000株M1植株才能在任一基因中产生至少一个突变。因此，本实施例通过150mM EMS对30,000粒种子进行6小时诱变处理，以达到所需的最小M1群体。将这些种子播种在温室的繁殖床上，以进行进一步的突变筛选。如图2所示，使用150mM EMS在圆锥石头花中不同处理时间下M1群体的种子发芽率。平均发芽率来自三个重复。单向方差分析用于评估统计显著性，p值是通过Tukey的HSD检验计算出的(α＝0.05)。

3.2EMS突变体筛选

种子发芽后，观察并研究了具有不同突变表型的植株。为了确定这种EMS处理的效果，本实施例在五块场地进行了抽样调查。对显性突变体进行计数，显性突变率为约54.63％(n＝5，表2，经EMS诱变处理群体中的显性突变率)。因此，本实施例的EMS诱变产生了足够的突变体，在圆锥石头花中产生了多种表型。

表2

例如，分离了数种具有不同类型的植株和叶的突变体，如图3所示，例如矮化植株、叶的形状和颜色变异的植株。结果表明，EMS诱变可引起圆锥石头花叶的质地、形状和颜色变异，浅黄色的叶杂色突变体是圆锥石头花的一种新的观赏性状。此外，对白化和淡黄色幼苗的鉴定表明，八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)，类胡萝卜素合成的关键酶，很可能被靶向并失去其功能。此外，还鉴定了许多败育突变体，证实了这种EMS诱变的充分性。

总而言之，由于没有有效的圆锥石头花分子遗传工程方法，例如拟南芥中的T-DNA插入突变体库或基因编辑系统，因此，本实施例的方案提供了简便且有效的方法来在圆锥石头花中产生可用的突变。

3.3重瓣花突变体的鉴定

为了鉴定重瓣花突变体，对开花的M1植株中的花型进行了突变体筛选。结果，分离了三种不同类型的重瓣花突变体，如图4所示。与野生型花相比，这三种重瓣花突变体的表型在花型和颜色上表现出不均等的变异，包括一种白色和两种粉红色的重瓣花。更具体地说，诱变导致雄蕊变弱甚至消失，但雌蕊似乎没有改变。进一步的，在所有突变体中均未产生种子，推测多余的花瓣可能从雄蕊转化而来，从而导致突变体的不育。在育种中利用花粉少或没有花粉的突变体作为雌性，将有利于圆锥石头花的杂交育种，这是基于我们的观察认为该种具有高的自花授粉率。

在花型和花色上有区别的重瓣花突变体的发现表明在EMS诱变过程中靶向多个碱基对或基因。由于M1代仅包含显性突变体，因此表明调节重瓣花的一个或更多个目标基因是显性的。此外，结果与理论预期是一致的，表明对圆锥石头花野生型种子的EMS诱变是成功的。

3.4圆锥石头花中的重瓣花调控基因

为了进一步研究圆锥石头花中重瓣花的调控基因，本发明克隆了三种重瓣突变体的AGAMOUS(AG)基因。通过基因测序，从这些突变体中鉴定出AG基因中数个SNP转换或缺失，以及同义替换。尽管突变体的花型相似，但是在AGa和AGb基因中检测到的突变位点却彼此不同。例如，M1中检测到AGa基因540bp处的单个碱基对缺失(T/-)，导致氨基酸从亮氨酸变为丝氨酸(L181S)，以及四个氨基酸置换和终止密码子提前(I185>STOP)。此外，本发明还从M1和M3中鉴定出AGb中相同的6bp的碱基对缺失，与参考基因组序列相比，导致两个非同义氨基酸的缺失。这表明AG基因的功能丧失可能引起半重瓣或重瓣花型。表3为从圆锥石头花的重瓣花突变体检测到的AG基因的突变信息。如图5所示，具有不同花型的重瓣花突变体中AG的氨基酸序列比对。相同的氨基酸以黑色背景表示，而序列差异则以白色突出显示。

表3

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

1.Alonso，J.M.and J.R.Ecker.2006.Moving forward in reverse:genetictechnologies to enable genome-wide phenomic screens in Arabidopsis.NatureReviews Genetics 7:524-536.doi:10.1038/nrg1893.

2.Alonso,J.M.,A.N.Stepanova,T.J.Leisse,C.J.Kim,H.Chen,P.Shinn,D.K.Stevenson,J.Zimmerman，P.Barajas,and R.Cheuk.2003.Genome-wide insertionalmutagenesis of Arabidopsis thaliana.Science 301:653-657.doi:10.1126/science.1086391.

3.Annick,D.,R.Olivier,M.Marion,B.Sylvie,N.B.Langlade,B.Véronique,V.Philippe,B.Mohammed,and D.Q.Fuller.2010.Tinkering with the C-function:amolecular frame for the selection of double flowers in cultivated roses.PLoSOne5:e9288.doi:10.1371/journal.pone.0009288.

4.Belfield,E.J.,X.Gan,A.Mithani,C.Brown,C.Jiang,K.Franklin,E.Alvey,A.Wibowo,M.Jung,and K.Bailey.2012.Genome-wide analysis of mutations in mutantlineages selected following fast-neutron irradiation mutagenesis ofArabidopsis thaliana.Genome research 22:1306-1315.doi:10.1101/gr.131474.111.

5.Bowman,J.L.,D.R.Smyth,and E.M.Meyerowitz.1989.Genes directingflower development in Arabidopsis.The Plant Cell 1:37-52.doi:10.1105/tpc.1.1.37.

6.Deng,Z.and K.Bhattarai.2018.Gerbera,p.407-438.In:J.Van Huylenbroeck(ed.).Ornamental Crops.Springer International Publishing,Cham.doi:10.1007/978-3-319-90698-0_17.

7.Fang,J.Y.and S.Traore.2011.In vitro mutation induction ofSaintpaulia using ethyl methanesulfonate.Hortscience 46:981-984.doi:10.21273/HORTSCI.46.7.981.

8.Greene,E.A.,C.A.Codomo,N.E.Taylor,J.G.Henikoff,B.J.Till,S.H.Reynolds,L.C.Enns,C.Burtner,J.E.Johnson,and A.R.Odden.2003.Spectrum ofchemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen inArabidopsis.Genetics 164:731-740.doi:10.1017/S0016672303006207.

9.Initiative,A.G.2000.Analysis of the genome sequence of theflowering plant Arabidopsis thaliana.Nature 408:796-815.doi:10.1038/35048692.

10.Jander,G.,S.R.Baerson,J.A.Hudak,K.Gonzalez,and K.J.Gruys.2003.Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determinefrequency of herbicide resistance.Plant Physiology 131:139-146.doi:10.1104/pp.102.010397.

11.Jansen,G.,E.Hazendonk,K.L.Thijssen,and R.H.Plasterk.1997.Reversegenetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.Nature Genetics17:119-121.doi:10.1038/ng0997-119.

12.Jiang,L.and B.L.Dunn.2017.Ethyl methanesulfonate and caffeinemutagenetic treatment to four ornamental Silene species.Journal ofEnvironmental Horticulture 34:95-100.doi:https://doi.org/10.24266/0738-2898-34.4.95.

13.Kim,Y.,K.S.Schumaker,and J.-K.Zhu.2006.EMS Mutagenesis ofArabidopsis,p.101-103.In:J.Salinas and J.J.Sanchez-Serrano(eds.).ArabidopsisProtocols.Humana Press,Totowa,NJ.doi:10.1385/1-59745-003-0:101.

14.Latado,R.R.,A.H.Adames,and A.T.Neto.2004.Dendranthema grandifloraTzvelevIn vitro mutation of Chrysanthemum(Dendranthema grandiflora Tzvelevwith ethylmethanesulphonate(EMS)in immature floral pedicels).Plant CellTissue and Organ Culture 77:103-106.doi:10.1023/B:TICU.0000016481.18358.55.

15.Lenhard,M.,A.Bohnert,G.Jurgens,and T.Laux.2001.Termination of stemcell maintenance in Arabidopsis floral meristems by interactions betweenWUSCHEL and AGAMOUS.Cell 105:805-814.doi:10.1016/S0092-8674(01)00390-7.

16.Li,F.2018.Meiotic recombination suppressors of Arabidopsisthaliana.Ghent University.

17.Li,F.,G.Wang,R.Yu,M.Wu,Q.Shan,L.Wu,J.Ruan，and C.Yang.2019.Effectsof seasonal variation and gibberellic acid treatment on the growth anddevelopment of Gypsophila paniculata.HortScience 54:1370-1374.doi:10.21273/hortsci14156-19.

18.Li,F.,X.Mo,L.Wu,and C.Yang.2020.A novel double-flowered cultivarof Gypsophila paniculata mutagenized by 60Co γ-Ray.HortScience.doi:10.21273/HORTSCI15137-20.

19.Lokeshwar,R.and J.Bhalla.1982.Gamma rays and EMS induced doubleflower and dichotomous branching in Portulaca grandiflora Hook.Science andCulture 48:354-355.

20.Mizukami,Y.and H.Ma.1997.Determination of Arabidopsis floralmeristem identity by AGAMOUS.The Plant Cell 9:393-408.

21.Qu,L.-J.and G.Qin.2014.Generation and identification ofArabidopsis EMS mutants,p.225-239.In:J.J.Sanchez-Serrano and J.Salinas(eds.).Arabidopsis Protocols.Humana Press，Totowa，NJ.doi:10.1007/978-1-62703-580-4_12.

22.Sakhanokho,H.F.,K.Rajasekaran,N.Tabanca,B.J.Sampson，L.M.Nyochembeng,C.T.Pounders，D.E.Wedge,N.Islam-Faridi,andJ.M.Spiers.2012.Induced polyploidy and mutagenesis of embryogenic cultures ofornamental ginger(Hedychium J.Koenig).Acta Horticulturae 935:121-128.doi:10.17660/ActaHortic.2012.935.17.

23.Shibuya,T.，Y.Murakawa,K.Nishidate,M.Nishiyama,and Y.Kanayama.2017.Characterization of flowering-related genes and flowering response inrelation to blue light in Gypsophila paniculata.The Horticulture Journal 86:94-104.doi:10.2503/hortj.MI-126.

24.Tanaka,Y.,Y.Oshima,T.Yamamura,M.Sugiyama,N.Mitsuda,N.Ohtsubo,M.Ohme-Takagi,and T.Terakawa.2013.Multi-petal cyclamen flowers produced byAGAMOUS chimeric repressor expression.Scientific Reports 3:2641.doi:10.1038/srep02641.

25.Tang,Q.Y.and C.X.Zhang.2013.Data Processing System(DPS)softwarewith experimental design,statistical analysis and data mining developed foruse in entomological research.Insect Science 20:254-260.doi:10.1111/j.1744-7917.2012.01519.x.

26.Urs,A.N.N.,Y.Hu,P.Li,Z.Yuchi,Y.Chen,and Y.Zhang.2019.Cloning andexpression of a nonribosomal peptide synthetase to generate blue rose.ACSSynthetic Biology 8:1698-1704.doi:10.1021/acssynbio.8b00187.

27.Wang,Q.,N.Dan,X.Zhang,S.Lin,M.Bao,and X.Fu.2020.Dianthuscaryphyllus L.Identification,characterization and functional analysis of C-class genes associated with double flower trait in carnation(Dianthuscaryphyllus L.).Plants 9:87.doi:10.3390/plants9010087.

28.Wang,S.M.,X.C.Piao,S.Y.Park,and M.L.Lian.2013.Improvedmicropropagation of Gypsophila paniculata with bioreactor and factorsaffecting ex vitro rooting in microponic system.In Vitro Cellular andDevelopmental Biology-Plant 49:70-78.doi:10.1007/s11627-012-9464-x.

29.Zhang，L.，F.Chen,X.Zhang,Z.Li,Y.Zhao，R.Lohaus,X.Chang,W.Dong,S.Y.W.Ho，X.Liu,A.Song,J.Chen，W.Guo，Z.Wang,Y.Zhuang，H.Wang,X.Chen，J.Hu，Y.Liu，Y.Qin，K.Wang，S.Dong,Y.Liu，S.Zhang，X.Yu，Q.Wu，L.Wang，X.Yan，Y.Jiao，H.Kong,X.Zhou,C.Yu,Y.Chen,F.Li,J.Wang,W.Chen,X.Chen,Q.Jia,C.Zhang,Y.Jiang,W.Zhang，G.Liu,J.Fu,F.Chen,H.Ma,Y.Van de Peer,and H.Tang.2020.The water lily genomeand the early evolution of flowering plants.Nature 577:79-84.doi:10.1038/s41586-019-1852-5.

30.Zvi，M.M.B.，A.Zuker，M.Ovadis，E.Shklarman，H.Ben-Meir，S.Zenvirt，andA.Vainstein.2008.Agrobacterium-mediated transformation of Gypsophila(Gypsophila paniculata L.).Molecular Breeding 22:543-553.doi:10.1007/s11032-008-9197-z.