用于药物筛选的mGluR2突变体和用于失敏机制研究的mGluR5突变体的构建及其功能检测

摘要

代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)属于C族GPCRs,其功能异常可导致老年痴呆症,焦虑,沮丧,精神分裂症等多种神经系统疾病。mGluRs在体内为同源二聚体,每个单体都包括与配体结合的VFT区(Venus flytrapmodule),七次跨膜区(heptahelical domain,HD)、连接VFT与HD区的富含半胱氨酸区(Cys-rich domain,CRD)以及胞内的C末端。mGluRs的活性和信号转导受到配体和变构剂的调控,它操作性较强的结构和重要的生理功能使之成为治疗神经系统疾病的重要药物靶点。除了受到外源性配体的调控,mGluRs的信号活性及转导也受到细胞内的相关蛋白的调控。
　　负向变构剂(Positive Allosteric Modulator,PAM)类药物的低毒性和高种属特异性使它成为近年来药物研发的热点,但因其研发过程需要加入激动剂和PAM两种化合物,这所带来的高工作量及高信噪比给研发带来了困难。而去除VFT区的mGluRs可以被PAM单独激活,以此模型筛选药物无疑大大降低的工作量和信噪比。由于不同的受体偶联不同的信号通路,所以传统的药物筛选方法具有较低的普适性。这里我们通过去除VFT区并插入SNAP/CLIP标签的mGluR2的突变体来建立筛选PAM类的候选细胞模型。VFT区的去除避免了筛选PAM过程中需要加入激动剂带来的额外工作量和高信噪比,而使用基于SNAP/CLIP的TR-FRET避免了检测不同下游信号通路带来的低普适性。这里我们构建了去除VFT区的一系列候选细胞模型,包括VFT区或CRD区的去除,mGluR2的N端和e2-loop的SNAP/CLIP标签的插入以及C1KKXX,C2KKXX尾巴的替换。鉴于各突变可能会对受体的表达量尤其是膜表达量产生影响,我们检测了各个突变体的表达情况。另外,我并确定了去除VFT而保留CRD的突变体具有功能,并且其信号强度高于同时去除VFT和CRD的突变体的。
　　根据报道,GRK2介导的mGluR1的脱敏需要mGluR1,Gαq和GRK2三者的相互作用。这里我们利用GRK2的突变体RH,PH,D110A等证明了单独的RH结构域的表达即可介导mGluR5的脱敏,这说明是GRK2的RH结构域负责mGluR5的脱敏。同时我们发现失去和mGluR5结合能力的D110A不能介导mGluR5的脱敏,这说明GRK2与Gαq的直接相互作用是GRK2介导mGluR5脱敏的必要条件。另外,我们利用GRK2的突变体D527A证明GRK2介导的mGluR5脱敏不需要GRK2的PH区与mGluR5相互作用。同时利用mGluR5的i2-loop突变体K677A,K678A,K679A,KAA,AAA,证明GRK2介导的mGluR5不需要mGluR5的i2-loop和GRK2相互作用。这说明与mGlu1不同,GRK2介导mGluR5的脱敏不需要i2-loop与GRK2的直接相互作用。

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1 绪论

1.1 mGluRs的结构

1.2 mGluRs的分布和功能

1.3 变构剂具有理想的临床潜力

1.4 筛选PAM的必要性以及困难

1.5 使用ΔV-mGluRs作为PAM的筛选模型可提高信噪比并减小工作量

1.6 基于SNAP标记的TR-FRET是新的广谱高通量筛选方法

1.7 TR-FRET技术

1.8 GPCR的脱敏

1.9 G蛋白偶联受体激酶简介

1.10 GRK2介导的mGluR1的非磷酸化依赖型脱敏

1.11 mGluR1的内吞

1.12 课题研究的意义

2 实验技术原理

2.1 定点突变

2.2 细胞转染

2.3 ELISA

2.4 IP3检测

2.5 钙流实验

2.6 TR-FRET

2.7 数据处理

3 用于药物筛选的mGluR2突变体的构建

3.1 实验材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

4 用于失敏机制研究的mGluR5突变体的构建及其功能检测

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

致谢

参考文献

附录 主要符号和缩略词表