无创胃脱落细胞与核酸取样系统及其使用方法

摘要

本发明创造提供了无创胃脱落细胞与核酸取样系统及其使用方法，包括胃管，胃管体外段连接胃部灌洗装置和样本收集装置，胃部灌洗装置包括水槽、液泵、灌洗液输入管和灌洗喷头，水槽连接液泵，液泵出液口通过灌洗液输入管连接胃管体外段，胃管的胃内段前部区域设置灌洗喷头；样本收集装置包括胃内灌洗液回收口、灌洗液输出管、回液瓶、样本收集瓶、废液收集瓶和负压空气泵；本发明创造旨在提出无创胃脱落细胞与核酸取样系统，通过对患者进行胃部灌洗并回收灌洗液，便于下一步对回收灌洗液中的胃脱落细胞、核酸、蛋白甚至菌群进行分析，可作为胃镜检查的初筛手段，提高胃镜的早期胃癌检出率以及检测效率；提升早期胃癌检测的患者的依从性并降低检测成本。

说明书

技术领域

本发明创造属于医疗器械领域，尤其是涉及无创胃脱落细胞与核酸取样系统。

背景技术

胃癌是世界上第二大癌症死因，也是威胁我国人民健康最常见的恶性肿瘤之一。每年我国约有l6万人死于胃癌，且近年来青年人胃癌发生率有上升趋势。改善胃癌患者预后的关键是作好二级预防，即早发现、早治疗。进展期胃癌手术切除后患者的5年生存率约30—40％。而对早期胃癌，癌细胞仅浸润至胃黏膜层和黏膜下层，无论有无淋巴结转移，手术治疗后5年生存率在80—90％，其中始发阶段小胃癌(SGC)及微小胃癌(MGC)的10年生存率可达100％。因此，早期胃癌的及时准确检出和治疗，对于降低胃癌死亡率具有十分重要的意义。

由于早期胃癌并不具有特异性临床症状，因此对自然人群的早期胃癌筛查就成为了早期胃癌发现的重要手段。对40岁以上且具有明显消化不良症状或癌前期病变患者，目前普遍认为胃镜检查是最好的早期胃癌筛查方法。与影像学检查相比，内镜可以直接观察病变形态，视野阔、分辨力强、活检准确率高，因此具有显著优势。研究表明胃镜结合活检对于早期胃癌的检出率可达80～90％，而熟练准确掌握内镜活检取材是诊断早期胃癌的关键。早期胃癌通常非常微小，而且第一钳活检后会有出血从而影响到以后活检的准确性，因此内镜活检的第一钳取样非常关键，直接关系到诊断的准确率，需要丰富的实践经验。

尽管内镜检查对早期胃癌的灵敏度和准确性很高，但内镜检查的侵入性大，成本高，导致很多人不能适用标准内镜检查，同时对内镜医师的熟练程度有较高的要求。在胃癌早期诊断方面有丰富经验的日本主要采用放射影像学的气钡双对比方法进行普查，在此基础上对可疑病灶再行胃镜精检。由此，早期胃癌病人的手术率达到50％以上，5年存活率达90％以上。目前我国主要在胃癌高发区进行选择性局部普查，如年龄>35岁，具不良的饮食习惯和食用高盐，霉变食物等，有肿瘤家族史等，然后综合分析筛选出高危个体，再行内镜及X射线摄片检查。但放射学检查作为初筛手段，其胃癌漏诊率仍然较高，主要原因除了早期胃癌恶性病变部分征象不明显外，常规钡餐检查对黏膜的微细结构显示不足也是一个重要因素。目前的新型胶囊胃镜类似放射学检查，虽然无侵入性，但是其只能提供图像诊断，依赖内镜医师经验判断，并且对肠道狭窄不的患者还有手术风险。其高成本等因素也限制了胶囊内镜成为早期胃癌筛查方法。

发明创造内容

有鉴于此，本发明创造旨在提出无创胃脱落细胞与核酸取样系统，通过对患者进行胃部灌洗并回收灌洗液，便于下一步对回收灌洗液中的胃脱落细胞、核酸、蛋白甚至菌群进行分析，可作为胃镜检查的初筛手段，提高胃镜的早期胃癌检出率以及检测效率，提升早期胃癌检测的患者的依从性并降低检测成本。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

无创胃脱落细胞与核酸取样系统，包括胃管，所述胃管体外段连接胃部灌洗装置和样本收集装置，所述胃部灌洗装置包括水槽、液泵、灌洗液输入管和灌洗喷头，水槽连接液泵，液泵出液口通过灌洗液输入管连接胃管体外段，所述胃管的胃内段前部区域设置灌洗喷头；

所述样本收集装置包括胃内灌洗液回收口、灌洗液输出管、回液瓶、样本收集瓶、废液收集瓶和负压空气泵，胃管的胃内段设置胃内灌洗液回收口，胃管体外段通过灌洗液输出管连接样本收集瓶或废液收集瓶，灌洗液输出管上设置回液瓶，所述样本收集瓶、废液收集瓶连接负压空气泵。

进一步的，所述胃管体外段末端设置灌洗液输出接口，灌洗液输出管末端配装于灌洗液输出接口；胃管体外段侧壁设置灌洗液输入接口，灌洗液输入管末端配装于灌洗液输入接口；所述灌洗液输出接口、灌洗液输入接口5 配装有可拆卸的密封塞。

进一步的，所述灌洗喷头包括套管，套管套装于胃管的胃内段构成可转动连接，套管两端设置旋转罗盘，套管侧壁均匀开设多个喷孔，喷孔通过螺旋输液管连通胃管的胃内段。

进一步的，所述螺旋输液管呈圆弧形，所述喷孔的喷液方向与螺旋输液管205所构成的圆弧相切。

进一步的，还包括设备外壳，设备外壳上分别开设连接样本收集瓶的第一负压接入口，和连接废液收集瓶的第二负压接入口。

进一步的，所述设备外壳，所述胃部灌洗装置和样本收集装置设置于设备外壳内部，设备外壳上设置有控制控制负压空气泵、液泵的控制按键。

无创胃脱落细胞与核酸取样系统的使用方法，包括以下步骤：

第一步，通过鼻饲的方法将胃管的胃内段置入患者胃体内部；

第二步，胃部灌洗装置将生理盐水导入胃管体外段，再经胃管的胃内段设置的灌洗喷头喷出，进行胃内冲洗；

第三步，进行胃内冲洗一段时间后，将回液瓶连接样本收集瓶或废液收集瓶；启动负压空气泵使得本收集瓶、废液收集瓶内部形成负压，将胃腔内与胃液混合的生理盐水引入样本收集瓶，多余的液体引入废液收集瓶；

第四步，当需要多次收集样本时，可以反复进行胃内冲洗，并置换样本收集瓶；

第五步，对样本收集瓶内的样本使用分子生化手段进行处理，对灌洗液中的胃部脱落细胞进行染色分析。

进一步的，所述分子生化手段包括基于胃部灌洗液的脱落细胞取样，具体包括以下步骤，

第一步，使用离心管收集胃部灌洗液，使用离心机离心沉淀细胞；

第二步，去掉上清液，加入细胞培养液或磷酸盐缓冲液重悬细胞，然后通过滤网过滤以去除杂质与细胞团聚物；

第三步，若灌洗液中存在较多血细胞，可通过负向富集的方式去除，包括但不限于：使用红细胞裂解液裂解红细胞，或使用磁球负选白细胞，或使用淋巴细胞分离液与密度梯度离心法去除红细胞与部分白细胞等；

第四步，经富集处理后的细胞悬液可固定后用于后续细胞分析，包括但不限于：免疫荧光染色。

进一步的，所述分子生化手段包括基于基于胃部灌洗液的脱落细胞核酸提取，具体包括以下步骤，

第一步，使用离心管收集胃部灌洗液，经离心机离心沉淀细胞；

第二步，去掉上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬细胞，再次离心；

第三步，去掉上清液，细胞沉淀用于DNA提取；

第四步，采用核酸提取试剂提取胃部灌洗液细胞沉淀的DNA；

第五步，检测提取后的DNA浓度用于后续测序。

相对于现有技术，本发明创造所述的无创胃脱落细胞与核酸取样系统及其使用方法具有以下优势：

(1)本发明技术方案针对临床中现有早期胃癌的检查方式操作不便、检查成本较高，且存在漏检率的现状而提出；本发明通过简单快速对患者进行胃部灌洗并回收灌洗液，对其中的胃脱落细胞、核酸、蛋白甚至菌群进行分析的无创胃脱落细胞与核酸取样系统，本发明能够一次胃内置管即可完成无创地胃部脱落细胞与核酸收集，需要多次收集样本的话可以反复冲洗并置换样本收集瓶；通过简单快速的对患者进行胃部灌洗并回收灌洗液，从而便于下一步对灌洗液其中的胃脱落细胞、核酸、蛋白甚至菌群(如幽门螺旋杆菌)进行分析。

(2)通过使用本系统可实现无创检测；能够作为胃镜检查的初筛手段，对胃部灌洗液阳性患者进一步行胃镜检查以提高胃镜的检出率，提高胃镜的使用效率；操作简单，对操作人员要求低，能够实现自动化控制，设备只需要护士辅助操作，剩下样品收集等都可以采用自动化完成，且无需进行胃镜检查前的其他前置检查项目，大大提高检测效率；系统制作成本低，现有的影像学检查和内镜检查系统复杂，检测成本较高。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明创造实施例整体示意图；

图2为本发明创造实施例所述的负压空气泵及其连接结构示意图；

图3为本发明创造实施例所述的灌洗喷头结构示意图；

图4为本发明创造实施例所述的灌洗喷头结构内部结构示意图；

图5为本发明创造实施例所述的设备外壳结构示意图；

图6为明场图、细胞核染料DAPI的染色图、细胞角蛋白CK的染色图。

附图标记说明：

1-水槽；2-液泵；3-灌洗液输入管；4-密封塞；5-灌洗液输入接口；6- 灌洗液输出管；8-灌洗液输出接口；9-胃管体外段；10-胃管的胃内段；11- 胃体；12-胃内灌洗液回收口；13-灌洗喷头；14-回液瓶；16-负压空气泵； 17-第一负压接入口；18-第二负压接入口；19-设备外壳；20-控制按键；100- 胃部灌洗装置；200-样本收集装置；201-样本收集瓶；202-废液收集瓶；204- 喷孔；205-螺旋输液管；206-旋转罗盘。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在本发明创造的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本发明创造的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明创造中的具体含义。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。

如图1至5所示，无创胃脱落细胞与核酸取样系统，包括胃管，所述胃管体外段9连接胃部灌洗装置和样本收集装置，所述胃部灌洗装置包括水槽 1、液泵2、灌洗液输入管3和灌洗喷头13，水槽1连接液泵2，液泵2出液口通过灌洗液输入管3连接胃管体外段9，所述胃管的胃内段10前部区域设置灌洗喷头13；

所述样本收集装置包括胃内灌洗液回收口12、灌洗液输出管6、回液瓶 14、样本收集瓶201、废液收集瓶202和负压空气泵16，胃管的胃内段10 设置胃内灌洗液回收口12，胃管体外段9通过灌洗液输出管6连接样本收集瓶201或废液收集瓶202，灌洗液输出管6上设置回液瓶14，所述样本收集瓶201、废液收集瓶202连接负压空气泵16。

本发明技术方案针对临床中现有早期胃癌的检查方式操作不便、检查成本较高，且存在漏检率的现状而提出；本发明通过简单快速对患者进行胃部灌洗并回收灌洗液，对其中的胃脱落细胞、核酸、蛋白甚至菌群进行分析的无创胃脱落细胞与核酸取样系统，该系统的胃部灌洗装置利用液泵将水槽内的生理盐水按照一定压强均匀地通过胃管导入胃腔内，由灌洗喷头13喷入胃腔冲刷整个胃部；通过样本收集装置的负压空气泵16使得样本收集瓶201、废液收集瓶202内部形成负压，利用负压吸引胃腔内的液体进入样本收集瓶201、废液收集瓶202；灌洗液输出管6可选择连接样本收集瓶201或废液收集瓶202，连接样本收集瓶201用于取样进行后续分析，连接废液收集瓶202 用于将多余液体进入废液瓶内，本发明能够一次胃内置管即可完成无创地胃部脱落细胞与核酸收集，需要多次收集样本的话可以反复冲洗并置换样本收集瓶；通过简单快速的对患者进行胃部灌洗并回收灌洗液，从而便于下一步对灌洗液其中的胃脱落细胞、核酸、蛋白甚至菌群(如幽门螺旋杆菌)进行分析。

所述胃管体外段末端设置灌洗液输出接口8，灌洗液输出管6末端配装于灌洗液输出接口8；胃管体外段9侧壁设置灌洗液输入接口5，灌洗液输入管3末端配装于灌洗液输入接口5；所述灌洗液输出接口8、灌洗液输入接口5配装有可拆卸的密封塞4。当单独进行胃内灌洗时，将灌洗液输出管 6安装密封塞4；灌洗液输入管3末端插入灌洗液输入接口5，实现单独胃内灌洗；同理，当单独进行胃内灌洗液引出时，灌洗液输入管3安装密封塞4，灌洗液输出管6末端配装于灌洗液输出接口8，实现单独胃内灌洗液引出。

所述灌洗喷头13包括套管203，套管203套装于胃管的胃内段10构成可转动连接，套管203两端设置旋转罗盘206，套管203侧壁均匀开设多个喷孔204，喷孔204通过螺旋输液管205连通胃管的胃内段10。可转动连接可采用两端设置可转动的轮滑轴或轴承，喷孔204通过套管203内部的螺旋输液管205连通胃管,液体喷出产生的反作用力可以反向推动套管203形成旋转，使液体能够均匀冲刷整个胃部；

所述螺旋输液管205呈圆弧形，所述喷孔204的喷液方向与螺旋输液管 205所构成的圆弧相切。为了尽可能充分的冲洗胃中早期胃癌的高发区域，在胃部灌洗管的尾端设置了呈圆弧形的螺旋输液管205，套管203内部设置螺旋液体管道连通喷孔，喷孔的出液方向可以设置为与螺旋输液管所在圆相切的方向或其它与螺旋输液管外壁非垂直的方向，液体由喷孔喷出后能够对胃部进行冲洗，而螺旋输液管在液体喷出反作用带动下转动，从而进一步提高了冲刷效果，液体产生的压强使导管不会贴壁在胃黏膜上。

还包括设备外壳19，设备外壳19上分别开设连接样本收集瓶201的第一负压接入口17，和连接废液收集瓶202的第二负压接入口18；所述设备外壳19，所述胃部灌洗装置和样本收集装置设置于设备外壳19内部，设备外壳19上设置有控制控制负压空气泵16、液泵2的控制按键20。通过设备外壳19使得系统构成一独立结构，便于转运、安装和维护。

无创胃脱落细胞与核酸取样系统的使用方法，包括以下步骤：

第一步，通过鼻饲的方法将胃管的胃内段10置入患者胃体11内部；

第二步，胃部灌洗装置将生理盐水导入胃管体外段9，再经胃管的胃内段10设置的灌洗喷头13喷出，进行胃内冲洗；

第三步，进行胃内冲洗一段时间后，将回液瓶14连接样本收集瓶201 或废液收集瓶202；启动负压空气泵16使得本收集瓶201、废液收集瓶202 内部形成负压，将胃腔内与胃液混合的生理盐水引入样本收集瓶201，多余的液体引入废液收集瓶202；

第四步，当需要多次收集样本时，可以反复进行胃内冲洗，并置换样本收集瓶201；

第五步，对样本收集瓶201内的样本使用分子生化手段进行处理，对灌洗液中的胃部脱落细胞进行染色分析。

所述分子生化手段包括基于胃部灌洗液的脱落细胞取样，具体包括以下步骤，

第一步，使用离心管收集胃部灌洗液，使用离心机离心沉淀细胞；

第二步，去掉上清液，加入细胞培养液或磷酸盐缓冲液重悬细胞，然后通过滤网过滤以去除杂质与细胞团聚物；

第三步，若灌洗液中存在较多血细胞，可通过负向富集的方式去除，包括但不限于：使用红细胞裂解液裂解红细胞，或使用磁球负选白细胞，或使用淋巴细胞分离液与密度梯度离心法去除红细胞与部分白细胞等；

第四步，经富集处理后的细胞悬液可固定后用于后续细胞分析，包括但不限于：免疫荧光染色。

所述分子生化手段包括基于基于胃部灌洗液的脱落细胞核酸提取，具体包括以下步骤，

第一步，使用离心管收集胃部灌洗液，经离心机离心沉淀细胞；

第二步，去掉上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬细胞，再次离心；

第三步，去掉上清液，细胞沉淀用于DNA提取；

第四步，采用核酸提取试剂提取胃部灌洗液细胞沉淀的DNA；

第五步，检测提取后的DNA浓度用于后续测序。

具体实施方式及分析结果如下：

实施方法1：基于胃部灌洗液的脱落细胞取样，具体包括以下步骤，

第一步，使用50ml试管将病人灌洗液样本转移出来，使用离心机400g 离心10min，去上清，加入5ml细胞培养液重悬，并通过400目滤网过滤后形成重悬液；

第二步，在15ml试管加内入3mlFicoll淋巴细胞分离液，再缓慢加入 5ml所述重悬液；设置离心机0加速0减速，400g离心30min；取出试管移除上清，收集中间一层细胞，加入5倍体积PBS冲洗；400g离心10min，去上清，加入1ml2％FPS固定细胞，10min室温，400g离心10min，去上清，加入PBS重悬后4℃保存以进行后续染色分析。

实施方法2：基于胃部灌洗液的脱落细胞核酸提取，具体包括以下步骤，

第一步，使用离心管收集50ml胃部灌洗液，使用离心机400g离心10 分钟；

第二步，去掉上清液，使用1mlPBS缓冲液重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移到1.5ml离心管中，使用离心机400g离心10分钟；

第三步，去掉上清液，细胞沉淀用于DNA提取；

第四步，采用Qiagen公司试剂盒提取胃部灌洗液细胞沉淀DNA提取；

第五步，DNA浓度检测使用ThermoFisher Scientific公司的Nanodrop 设备。

实验中发现，采用本发明无创胃脱落细胞与核酸取样系统的使用方法，基于胃部灌洗液的脱落细胞核酸提取，胃部灌洗液中的胃部脱落细胞的明场与荧光染色，如图6所示，其中左图为明场图、中图为细胞核染料DAPI的染色图、右图为细胞角蛋白CK的染色图；结果显示样本内存在大量完整细胞(1×10

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。