一种用于检测血清中RANKL含量的抗体对及其用途

摘要

本申请提供一种用于检测血清中RANKL含量的抗体对及其用途，本申请将RANKL抗原分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列，并用这两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiRANKL_N和AntiRANKL_C，通过该抗体对可以有效的测定血清中RANKL的含量，进而便于诊断和治疗骨质疏松症。

说明书

技术领域

本申请涉及医药领域，尤其涉及一种用于检测血清中RANKL含量的抗体对及其用途。

背景技术

骨质疏松症是一种与年龄相关的慢性全身性代谢性疾病，它主要以骨量减少、骨微结构破坏和骨脆性增加为特征。由于其发病率和死亡率的提高，该病已经成为全球性的公共健康问题。鉴于骨质疏症松的高发病率及其带来的严重后果，人们对其发病机制进行了深入研究。

RANKL蛋白被认为是破骨细胞活化增殖过程中必不可少的生物分子，它有三种亚型且均能促进破骨细胞增殖。RANKL可由多种细胞表达，软骨组织表达的RANKL受1，25(OH)2D3 BMP2，Wnt/b-catenin信号通路调节，并吸引破骨细胞前体聚集吸收新形成的多余骨质，预防骨硬化；而骨细胞中RANKL的表达与应力刺激相关；炎症性疾病中B细胞、T细胞表达的RANKL可能参与免疫反应与B细胞的成熟过程。研究发现57岁以上女性血清RANKL水平明显升高，这与绝经后骨质疏松出现时间一致。Kim等认为RANKL通过介导活性氧通路诱导持久性的钙震荡，最终促进单核细胞向破骨细胞分化。Xu等同样认为通过调节RANKL/OPG的比例可以诱导破骨细胞分化。综上，RANKL在破骨细胞分化过程中扮演着重要的角色。除此之外RANKL还可以激活成熟破骨细胞，延长其存活时间，增强骨吸收能力。由于使用相关抗体、肽、天然化合物抑制RANKL可以阻止破骨细胞的形成和功能，故RANKL被视为诊断及治疗骨质疏松症的一个潜在靶点,由于RANKL与骨质疏松的发生、发展有关,所以血清中RANKL含量检测也是我们研究的方向。然而，截止目前，还没有针对RANKL临床检测的配对抗体报道。

发明内容

本申请为解决上述技术问题而提供一种用于检测血清中RANKL含量的抗体对及其用途。

本申请所采取的技术方案是：本申请第一方面提供一种用于检测血清中RANKL含量的抗体对，包括与RANKL的N端表位即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiRANKL_N和与RANKL的C端表位即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiRANKL_C，所述单克隆抗体AntiRANKL_N包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiRANKL_C包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。

进一步的，所述单克隆抗体AntiRANKL_N轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:4所示的LCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:5所示的LCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:6所示的LCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列；所述单克隆抗体AntiRANKL_N重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:8所示的HCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:9所示的HCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ IDNO:10所示的HCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列。

进一步的，所述单克隆抗体AntiRANKL_C轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:14所示的LCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:15所示的LCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:16所示的LCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列；所述单克隆抗体AntiRANKL_C重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示的HCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的HCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:20所示的HCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列。

进一步的，所述单克隆抗体AntiRANKL_N和AntiRANKL_C均为IgG型单克隆抗体，且一个为捕获抗体，一个为检测抗体。

进一步的，所述AntiPF4_N为捕获抗体，所示AntiPF4_C为检测抗体。

进一步的，所述检测抗体的检测标记物为检测标记蛋白、荧光基团、放射性同位素中的一种。

进一步的，所述检测抗体的检测标记蛋白包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶，且检测抗体与检测标记蛋白重组表达。

进一步的，所述检测抗体的检测方法包括酶联免疫(ELISA)检测法、化学发光检测检测法、蛋白质印迹检测检测法和免疫组化(IHC)检测法。

进一步的，所述抗体对选自与RANKL结合的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和di-scFv的抗体片段。

本申请第二方面提供一种DNA分子，它编码权利要求1或2或3所述的抗体。

本申请第三方面提供一种上述任一一种抗体对在制备检测血清中RANKL含量的试剂盒中的应用。

本申请具有的优点和积极效果是：本申请将RANKL抗原分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列，并用这两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiRANKL_N和AntiRANKL_C，通过该抗体对可以有效的测定血清中RANKL的含量，进而便于诊断和治疗骨质疏松症。

除了上面所描述的本申请解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的优点之外，本申请所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征所带来的优点，将在下文中作进一步详细的说明。

附图说明

图1是本申请实施例提供的AntiRANKL_N和AntiRANKL_C抗体对检测示意图；

图2是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-NL-LFc载体电泳图；

图3是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-NH-HFc载体电泳图；

图4是本申请实施例提供的重组AntiRANKL_N蛋白纯化电泳图；

图5是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-CL-LFc载体电泳图；

图6是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-CL-HFc载体电泳图；

图7是本申请实施例提供的重组AntiRANKL_C蛋白纯化电泳图；

图8是本申请实施例提供的AntiRANKL_N和AntiRANKL_C抗体对制备的试剂盒验证流程示意图；

图9是本申请实施例四提供的性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第一次测定曲线；

图10是本申请实施例四提供的性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第二次测定曲线；

图11是本申请实施例四提供的性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第三次测定曲线；

图12是本申请实施例提供的临床诊断中本申请抗体制成试剂盒与对照试剂盒检测RANKL的剂量-反应曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

实施例一：单克隆抗体AntiRANKL_N和AntiRANKL_C的制备

1、对RANKL(SEQ ID NO:1)蛋白抗原性分析，将RANKL抗原分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列，分别合成RANKL的N端表位(SEQ ID NO:2)和PF4的C端表位(SEQ ID NO:3)，分别偶联KLH，获得N端免疫原和C端免疫原；后免疫小鼠，小鼠为8周龄的雌性Balb/c小鼠。

2、动物免疫：采用N端免疫原和C端免疫原分别免疫8周龄的雌性Balb/c小鼠，100ug的抗原免疫小鼠4次，每次间隔4周。

3、细胞融合：断颈处死小鼠，置于75％乙醇溶液中5-10min，在无菌条件下取出脾脏，用已灭菌处理的毛玻璃片挤压并轻轻研磨脾脏细胞，脾脏细胞计数，将免疫后的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞按1:1的比例混合，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1000rpm/min离心10分钟，弃去上清，用吸管吸净残留液体(为了避免影响PEG的浓度)，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

4、用吸管在60s内加预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，边加边轻轻搅拌。

5、用10ml吸管在90s内加20-30ml预热的不完全培养基(终止PEG作用)；20-27℃静置10分钟。

6、1000r/min离心5分钟，弃上清；

7、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。

8、分装96孔细胞培养板(孔板内有饲养细胞层)，每孔0.1-0.15ml(或分装24孔板，每孔1.0-1.5ml)，然后将培养板置37℃，6％CO

9、5天后用HAT培养基换出1/2培养基

10、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；

11、经常观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清通过ELISA检测其活性(阳性克隆)，筛选抗体效价高的杂交瘤细胞，经过3-4次亚克隆，确保形成单克隆时扩大培养，并进行腹水细胞注射，抗体纯化。

实施例二：对实施例1获得的单克隆抗体进行验证

(1)将RANKL全抗原(SEQ ID NO:1)、RANKL的N端抗原(SEQ ID NO:2)和RANKL的C端抗原(SEQ ID NO:3)分别进行包被，包被浓度2ug/ml，4℃2小时，用0.9％NaCl洗涤液洗板2次，拍干，加封闭液(0.5molPBS+1％BSA+2.5％蔗糖)200μl，37℃封闭2小时，之后倒尽板孔中液体，拍干；

(2)加入不同体积的实施例1获得的AntiRANKL_N和AntiRANKL_C(如表1所示)，37℃反应1小时；

(3)0.9％NaCl洗涤液洗板3次，拍干；

(4)加入HRP标记的羊抗小鼠IgG的二抗，37℃反应1小时；

(5)0.9％NaCl洗涤液洗板5次，拍干；

(6)最后加入底物液鲁米诺，测定其发光值，测定结果如表1所示：

表1

由表1可知，AntiRANKL_N能特异性的结合RANKL的N端抗原(SEQ ID NO:2)，而不结合RANKL的C端抗原(SEQ ID NO:3)。AntiRANKL_C能特异性的结合RANKL的C端抗原(SEQ IDNO:3)，而不结合RANKL的N端抗原(SEQ ID NO:2)。

实施例三：单克隆抗体AntiRANKL_N和AntiRANKL_C的测序及通过杂交瘤细胞制备相应抗体

1、提取实施例1中AntiRANKL_N杂交瘤细胞的总RNA，采用cDNA合成逆转录试剂盒，以RNA为模板合成第一条链cDNA，再以cDNA为模板，扩增单克隆抗体AntiRANKL_N可变区基因。对可变区PCR产物序列进行T/A克隆，后挑选阳性菌落进行测序，并对测序结果进行氨基酸翻译分析。

结果表明，AntiRANKL_N单抗轻链可变区的LCDR1,LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:4，5和6。此外，包含上述可变区的轻链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12和7所示。

AntiRANKL_N单抗重链可变区的HCDR1,HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别于SEQ IDNO：8,9和10。此外，包含上述可变区的重链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:13和11所示。

优化AntiRANKL_N单抗轻链可变区基因和重链可变区基因，将轻链可变区基因克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，构建pcDNA3.1-NL-LFc载体，如图2所示；将重链可变区基因克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，构建pcDNA3.1-NH-HFc载体，如图3所示，本实施例中，pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区，将pcDNA3.1-NL-LFc和pcDNA3.1-NH-HFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗RANKL的N端抗体AntiRANKL_N，如图4所示,收集抗体AntiRANKL_N。

2、提取实施例1中AntiRANKL_C杂交瘤细胞的总RNA，采用cDNA合成逆转录试剂盒，以RNA为模板合成第一条链cDNA，再以cDNA为模板，扩增单克隆抗体AntiRANKL_C可变区基因。对可变区PCR产物序列进行T/A克隆，后挑选阳性菌落进行测序，并对测序结果进行氨基酸翻译分析。

结果表明，AntiRANKL_C单抗轻链可变区的LCDR1,LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:14，15和16。此外，包含上述可变区的轻链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：22和17所示。

AntiRANKL_C单抗重链可变区的HCDR1,HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别于SEQ IDNO：18,19和20。此外，包含上述可变区的重链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ IDN0:23和21所示。

优化AntiRANKL_C单抗轻链可变区基因和重链可变区基因，将轻链可变区基因克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，构建pcDNA3.1-CL-LFc载体，如图5所示；将重链可变区基因克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，构建pcDNA3.1-CH-HFc载体，如图6所示，本实施例中，pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区，将pcDNA3.1-CL-LFc和pcDNA3.1-NH-CFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗RANKL的C端抗体AntiRANKL_C，如图7所示，收集抗体AntiRANKL_C。

实施例四：AntiRANKL_N和AntiRANKL_C抗体对在化学发光法诊断试剂盒中的应用

按照现有化学发光法诊断试剂生产工艺，将实施例3获得的AntiRANKL_C作为捕获抗体进行包被配置成RANKL包被板，将实施例3获得的中AntiRANKL_N标记作为结合抗体进行配置成RANKL酶结合物，将RANKL抗原配置成系列校准品(0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)形成一套完整试剂盒，并对其进行一系列验证。

1、性能验证指标

参考市场上现有RANKL试剂盒的技术要求，制定对RANKL检测试剂的性能验证指标。

(1)最低检测限

应不高于40pg/ml。

(2)剂量-反应曲线的线性

在线性区间0pg/ml～800pg/ml内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900。

(3)准确度

以试剂盒检测回收率，应在0.85-1.15范围内。

(4)精密度

精密度(CV)应不大于10％。

2、实验配置

(1)RANKL包被板配置

将AntiRANKL_C作为捕获抗体，加入到包被缓冲液(0.05mol PBS)，按照2ug/ml比例加入。每个空白发光板板孔加入100ul，4℃过夜，取出，用洗板洗涤液(0.9％NaCl)洗涤2次，加入每孔200ul封闭液(0.5mol PBS+1％BSA+2.5％蔗糖)，4℃过夜，取出，弃掉板中液体，干燥后制成RANKL包被板。

(2)RANKL酶结合物配置

A、与检测抗体结合的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶中的一种。

B、本实施例中，AntiRANKL_N抗体标记HRP，取1mg/mlAntiRANKL_N抗体，并用醋酸溶液活化1mgHRP备用，抗体和HRP按1：1混合后颠倒混匀，2h后加入硼氢化钠终止反应，得到AntiRANKL_N-HRP结合抗体。

C、将AntiRANKL_N-HRP作为结合抗体，加入到酶稀释液(50MmolTris+1％BSA)，按照1/1000比例加入。

(3)校准品配置

将RANKL抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释六个梯度(0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)。

(4)回收率标准溶液配置

将RANKL抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释到600pg/L，作为标准溶液，选取30-40pg/L正常人血清作为低值样本。

(5)质控品配置

将RANKL抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释成QC1(150pg/ml±10％),QC2(650pg/ml±10％)。

3、加样操作，如图8所示

(1)分别取上述配置的(3)-(5)RANKL校准品、回收率标本和质控品各50μl加入上述配置的(1)相应包被板板孔内，再取上述配置的(2)相应RANKL酶结合物配置50μl加入上述配置的(1)相应包被板板孔内,振荡器振荡30秒钟，使其充分混合均匀；

(2)盖上封板膜，置37℃温育60分钟；

(3)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板5次；

(4)每孔加入底物液100ul(购买自ThermoFisher T2142)；

(5)用中生百克BHP9504化学发光仪检测化学发光强度(RLU)。

4、性能指标考核

(1)最低检测限

平行测定20孔零校准品(0pg/ml)的相对发光强度，计算发光值平均值和标准偏差SD，用剂量-反应曲线计算发光值为均值+2×SD时对应的浓度值即为最低检出限，结果如表2所示。

表2

由表2可知，最低检测限为15.07pg/ml,不高于40pg/ml，符合指标。

(2)剂量-反应曲线的线性

复孔测定试剂盒的参考品(S0～S5，浓度依次为0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)，平行测定三次，采用四参数法拟合试剂盒的剂量-反应曲线，三次测定的剂量-反应曲线如图9、图10和图11所示。测定的剂量-反应曲线线性相关系数(R

表3

由图9、图10和图11，以及表3可知，连续三次测定0-800pg/ml浓度范围RANKL抗原曲线，线性相关系数R

(3)准确度

将RANKL抗原配制成标准溶液(600pgl/L)按体积比为1：9加入到已知浓度的低值样本(30-40pg/L)中，在试剂盒上进行检测，根据下方公式计算回收率R，如表4所示。

式中：R——回收率；

V——加入标准溶液的体积；

V

C——低值样本加入标准溶液后的检测浓度；

C

Cs——标准溶液的浓度。

表4

由表4可知，连续三次检测由RANKL国际标准品配制的准确性标本，结果准确度均在95～105％范围内，在90％～110％要求内，符合指标。

(4)精密度

平行测定质控品Q1和质控品Q2各10孔，分别按照下方公式计算CV，结果如表5所示。

式中：

SD—质控品测定浓度值的标准差

表5

由表5可知，连续三次平行测定QC1和QC2，结果CV(％)均不大于10％要求，符合指标。

本实施例中，RANKL检测试剂的最低检测限、剂量-反应曲线、准确性和精密度性能指标均符合现有技术要求并优于市场现有方法学试剂。

实施例五：临床检测

随机选取40份人血清标本，用本申请抗体制成试剂盒及对照RANKL试剂盒进行检测，检测结果如表6所示。

表6

并根据表6绘制剂量-反应曲线，如图12所示。

如图12所示，基于本申请抗体制成试剂盒与对照试剂盒(购自北京康安泽成生物科技有限公司)检测浓度结果相关性R

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明的申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 廊坊天光生物技术有限公司

<120> 一种用于检测血清中RANKL含量的抗体对及其用途

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu

1 5 10 15

Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met

35 40 45

Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val

50 55 60

Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser

65 70 75 80

Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn

85 90 95

Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile

100 105 110

Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln

115 120 125

Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys

130 135 140

Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu

145 150 155 160

Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro

165 170 175

Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly

180 185 190

Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val

195 200 205

Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His

210 215 220

His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val

225 230 235 240

Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met

245 250 255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe

260 265 270

Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu

275 280 285

Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp

290 295 300

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp

305 310 315

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu

1 5 10 15

Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala

20 25 30

Pro Pro

<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser

1 5 10 15

Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val

20 25 30

Arg Asp Ile Asp

35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Gln Ser Leu Val Ser Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Tyr Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Pro Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp

85 90 95

Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

Lys Ser Ser Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Asn Lys Leu Thr Thr Val Val

1 5 10 15

Ser

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gln Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp

20 25 30

Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Glu Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Val

65 70 75 80

Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Asn Lys Leu Thr Thr Val Val Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 12

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 13

Leu Val Ser

1

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 14

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 15

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn Val

100 105 110

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 16

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 17

Ile Asn Ser Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

Ala Arg Val Pro Thr Ala Thr Glu Gly Tyr Ser Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Pro Gly Ser Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Pro Thr Ala Thr Glu Gly Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

tccatcgtga tgactcagac accaaagttc ctcttggtgt ccgccggtga ccgcgtgaca 60

atcacatgca agcccagcca gagcctggtg agtagcaacg gcaacacata cctggcttgg 120

tatcagcaaa aacctggaca gtccccaaaa ctgctgatct actacgctag caaccgatac 180

actggagtgc cagaccggtt cactggtagt ggttatggca ccgacttcac ctttactatt 240

agcaccgtcc aggctgagga tctggctgta tatttctgtc agcaggacta ctcttcccca 300

cttacattcg gcgctgggac aaagctggaa ctcaag 336

<210> 21

<211> 369

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

caagtccaac ttcaacagcc tggctctgta ctggttagac cacagtctgt gaagctttca 60

tgtaaggcct caggttatac attcacaagc tcttggatgc actgggcaaa acagagacca 120

ggtcagggtc tggagtggat cggagaaatt caccccaatt cagggaatac taattacagc 180

gacaagttca aaggtaaggc cactttgacc gtggacaaaa gtagcagcac tgcttacgtg 240

gatctcagct ccctgacctc tgaagactct gctgtctatt attgtaagtc atccgaatcc 300

atcctctata gtaacaagtt gactactgtc gttagctggg gtcagggtac cacactgact 360

gtgtctagc 369

<210> 22

<211> 333

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

gatatcgtac tgactcagtc tccagcatct ttggccgtga gtctgggcca acgtgctaca 60

attagctacc gggcaagtaa gtctgtctct acctcagggt atagttatat tcattggaac 120

cagcaaaagc caggccagcc tccccgactg ctgatctacc tggtgagcaa cctcgaaagc 180

ggcgttcctg ctaggttttc cggctctggg tctggcaccg actttacatt gaatattcac 240

cccgtcgaag aggaggatgc tgctacctac tattgtcagc atattagaga gctgacaaga 300

tctgaaggtg gacctagttg gaagtctaac gtg 333

<210> 23

<211> 360

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

gaggtcaaac ttgtagaaag cggaggggga ctggtgaaac ctggtggcag cctgaaactg 60

agctgcgcca cctcaggctt cactttttct agctatgcta tgacatgggt tcgccagaca 120

cccgagaaac gcctggagtg ggtggcatct atcaactccg gaggccgcac cttttaccca 180

gggagtgtcc gcgggcgttt cacaatatct agagataacg ctcgcaatat tctgtatctg 240

cagatgagct ctctgaggtc cgaggacact gccatgtatt attgtgccag agtgcctacc 300

gccactgaag gatactccat ggactattgg ggccagggga ccagcgtgac agtctctagc 360