芽胞@Zr4+免疫微球用于检测牛结核分枝杆菌感染血清中MPB83抗体

摘要

牛结核病(Bovine Tubereulosis)主要是由牛结核分枝杆菌(M.bovis)引起的一种慢性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将动物牛结核病列为B类动物传染病，在我国也将其列为二类动物疫病。寻找一种快速检测牛结核病的方法，对预防和控制结核病具有重要的意义。
　　本研究以解淀粉芽胞杆菌的芽胞制备单分散的功能微球，并以此制作成芽胞@Zr4+复合微球;由于Zr+离子有多个结合位点，MPB83抗原蛋白能够有效的通过Zr4+离子偶联到微球表面制备成免疫微球，并用于牛结核分枝杆菌感染血清中MPB83抗体的检测。实验结果表明:该微球具有良好的分散性、稳定性，微球表面氨基、羧基等参与了Zr4+离子的偶联配合作用;MPB83抗原蛋白免疫微球用于牛结核分枝杆菌感染血清中MPB83抗体的检测时，在1∶1，000-1∶20，000具有良好的线性(R2=0.993);其检测限为1∶32，000，远低于商品ELISA检测试剂盒的检测限(1∶5，120; S/N=3);以牛传染性鼻气管炎、牛副结核等六种阳性血清为对照，证明了本研究提出的新型诊断方法具有良好的特异性。此外，用本方法与牛结核分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒同时分析了69份临床牛血清，比较其结果，得到敏感度为71.43％、特异性为97.50％、符合率为86.95％，证明了本方法具有推广应用价值。

目录

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摘要

缩略词表(Abbreviation)

1．文献综述

1．1 牛结核病

1．1．1 牛结核病及其病原菌—牛结核分枝杆菌的概述

1．1．2 牛结核分枝杆菌的主要保护性抗原

1．1．3 牛结核病诊断技术的研究进展

1．2 芽胞

1．2．1 芽胞形成及结构

1．2．2 芽胞应用

1．3 悬浮芯片技术

1．3．1 悬浮芯片技术概述

1．3．2 悬浮芯片技术的应用

1．4 课题研究背景及意义

2．材料与方法

2．1 主要仪器

2．2 主要材料及试剂

2．2．1 菌株

2．2．2 免疫试剂及血清

2．2．3 普通化学试剂

2．2．4 试剂盒

2．3 主要溶液配置

2．3．1 培养基

2．3．2 芽胞处理溶液

2．3．3 核酸电泳试剂

2．3．4 蛋白电泳胶(SDS-PAGE胶)制备溶液

2．3．5 蛋白质纯化制备溶液

2．3．6 Bradford溶液

2．4 实验方法

2．4．1 芽胞的培养及处理

2．4．2 芽胞吸附Zr4+平衡曲线以及吸附Zr4+前后的表征

2．4．3 蛋白表达与纯化

2．4．4 免疫检测方法的建立

3．实验结果

3．1 解淀粉芽胞杆菌处理结果以及吸附机理研究

3．1．1 解淀粉芽胞杆菌预处理结果

3．1．2 Spore@Zr4+微球的FTIR表征

3．1．3 Spore@Zr4+微球的XPS表征

3．1．4 等温吸附曲线

3．1．5 Spore@Zr4+微球的Zeta电位表征

3．2 蛋白表达与纯化

3．2．1 质粒提取及其鉴定

3．2．2 蛋白表达与纯化

3．2．3 蛋白浓度测定

3．3 免疫检测方法的建立

3．3．1 条件优化

3．3．2 线性及检测限

3．3．3 重复性

3．3．4 特异性

3．3．5 实际样品分析

4．总结与讨论

参考文献

致谢

附录