一种中性溶解的改性光固化胶原的制备方法和光固化胶原水凝胶

摘要

本发明公开了一种中性溶解的改性光固化胶原的制备方法和光固化胶原水凝胶，属于生物材料技术领域。经过改性的胶原能够在中性条件下溶解。可通过硫醇‑烯反应快速固化为胶原水凝胶，兼具优良的凝胶强度和生物相容性。其交联剂为包含两个或多个硫醇基团的化合物，可以通过光引发剂或其他产生自由基的反应形成凝胶。此外，该凝胶可以方便的修饰功能分子，如蛋白药物、抗体、多肽等。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种中性溶解的改性光固化胶原的制备方法和光固化胶原水凝胶。

背景技术

光固化凝胶通过对分子进行适当的改性，在引发剂存在的情况下，通过光照能够快速使分子聚合，形成凝胶。该类材料的改性基团一般包含双键，可在自由基引发下发生聚合反应，如光敏透明质酸、海藻酸钠、明胶、聚乙二醇等。目前光敏生物材料主要基于两种原理：1、通过烯类自聚合，如甲基丙烯基团、丙烯基团等，如文献1-3[文献1：Lin,H.,et al.,Application of visible light-based projection stereolithography for livecell-scaffold fabrication with designed architecture.Biomaterials,2013.34(2):p.331-9.；文献2：Nichol,J.W.,et al.,Cell-laden microengineered gelatinmethacrylate hydrogels.Biomaterials,2010.31(21):p.5536-44.；文献3：Jeon,O.,etal.,Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates andmechanical properties.Biomaterials,2009.30(14):p.2724-34.]；2、基于点击化学的一种，硫醇-烯反应进行聚合，如文献4-6[文献4：Fu,Y.,et al.,3D cell entrapment incrosslinked thiolated gelatin-poly(ethylene glycol)diacrylatehydrogels.Biomaterials,2012.33(1):p.48-58；文献5：Lin,C.C.,A.Raza and H.Shih,PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect onthe formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.Biomaterials,2011.32(36):p.9685-95；文献6：Guvendiren,M.and J.A.Burdick,Stiffening hydrogelsto probe short-and long-term cellular responses to dynamic mechanics.NatCommun,2012.3:p.792]。但光敏材料有一定缺点：1、多糖类高分子无粘附位点，需要另行枝接粘附多肽等，才能支持细胞伸展；2、蛋白类材料如明胶，分子量较小，凝胶成型最小浓度较高，故细胞在其中生长状态差强人意。基于硫醇-烯反应的光固化体系，速度快、引发剂用量小，但仍然无法克服上述问题，故相容性提高并不明显。

胶原是一种生物相容性良好的生物材料，广泛应用于组织工程和再生医学领域，现已经有一系列产品如胶原修复膜、胶原骨支架等在临床上取得了应用许可。在实验研究中，酸溶性胶原得到了广泛的应用，未变性的胶原溶解于酸性溶液中，中和后在一定盐浓度下在37度可形成凝胶。但传统的胶原凝胶存在以下不足：1、中和困难，实验研究中常用的鼠尾胶原的浓度一般为0.3％w/v，当提高其浓度后，则不易中和均匀；2、中性后难以稳定存在，0.3％w/v鼠尾胶原在中性条件下，温度稍高就会形成凝胶，当浓度提高，凝胶速度会加快，不仅每次使用需要现配，且限制了操作时间，操作复杂；3、强度差，凝胶的形成依靠胶原纤维的缠结和非共价键的作用，易变形和析出水分；4、凝胶慢，胶原依靠组装后的纤维缠结及非共价键形成水凝胶，其凝胶速度较慢，通常大于15min。因此，有必要对酸溶性胶原进行适当改性，以提高其可操作性和力学强度。

有文献报道光固化胶原的合成方法，以甲基丙烯酸NHS活性酯[Gaudet,I.D.andD.I.Shreiber,Characterization of methacrylated type-I collagen as a dynamic,photoactive hydrogel.Biointerphases,2012.7(1-4):p.25]或甲基丙烯酸酐[Brinkman,W.T.,et al.,Photo-cross-linking of type I collagen gels in the presence ofsmooth muscle cells:mechanical properties,cell viability,andfunction.Biomacromolecules,2003.4(4):p.890-5]改性，得到光固化的光敏胶原。但该种胶原仍然只能溶解于酸性溶液中，限制了其使用范围，未见大量引用和报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中性溶解的改性光固化胶原的制备方法和光固化胶原水凝胶，制备了能够中性溶解可由自由基引发聚合的改性胶原，其固化速度、力学稳定性，甚至细胞相容性相比胶原都有了明显提升。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种中性溶解的改性光固化胶原的制备方法，包括如下步骤：

(1)酸溶解型胶原溶液的制备：以提取的Ⅰ型胶原为原材料，将Ⅰ型胶原加入0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备3-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；

(2)将步骤(1)中的酸溶解型胶原溶液用0-5倍质量的水稀释后，采用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，此时温度应维持在0-10℃；

(3)酸酐溶液的制备：将降冰片烯二酸酐溶于溶剂中，获得酸酐溶液；

(4)将步骤(2)所得酸酐溶液逐滴加入步骤(2)中的pH值7-10和0-10℃条件下的胶原溶液中进行反应，同时滴加氢氧化钠溶液使pH维持在7-10；此时温度可调范围为0-37℃，反应时间30min-1day；

(5)将步骤(3)所得反应产物使用蒸馏水透析，再经冻干即得到所述中性溶解的改性光固化胶原。

上述步骤(1)中，所述Ⅰ型胶原为鼠胶原、牛胶原、猪胶原或鱼胶原等Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原的提取方式为酶法或酸法提取；所述酸溶液为乙酸溶液或盐酸溶液，所制备的酸溶解型胶原溶液的pH为1-5。

上述步骤(2)中，所述强碱溶液为浓度0.5～6mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；步骤(3)中，所述溶剂为乙醇或丙酮。

上述步骤(4)中，所述酸酐溶液中的酸酐与胶原溶液中的胶原的重量比例为(0.1～10):1；反应温度0～37℃；酸酐溶液中的溶剂与胶原溶液的体积比为(0.5-2):20。反应过程中，降冰片烯二酸酐与改性胶原侧链的自由氨基和羟基中的一种或两种发生反应，反应后以酯键和/或酰胺键与胶原连接。

所制备的改性光固化胶原能够在pH＝7-8的PBS溶液、Hanks平衡盐溶液或各种细胞培养基中溶解，也可溶解于酸性溶液中；

所制备的改性光固化胶原能够在中性条件下和其他溶液或其他溶液的改性产物均匀共混且不形成胶原纤维；所述其他溶液是指明胶、藻酸钠、透明质酸、水溶性纤维素、黄原胶、结冷胶、卡拉胶和聚乙二醇等高分子水溶液中的一种或几种。

利用所述改性光固化胶原制备胶原水凝胶，该胶原水凝胶的获得过程包括如下步骤(a)-(c)：

(a)将所述改性光固化胶原在低温条件下溶解于中性溶液中，得到浓度为5-10mg/ml的改性光固化胶原溶液；

(b)在步骤(a)所得改性光固化胶原溶液中加入交联剂和光引发剂；其中：交联剂在光固化胶原溶液中的浓度为0.5-10mM，光引发剂质量占改性光固化胶原溶液质量的0.01％-2％。

(c)将步骤(b)最终所得溶液进行光照，光作用于光引发剂产生自由基而引发硫醇-烯反应，得到所述胶原水凝胶。

上述步骤(b)中，所述交联剂为含有两个或两个以上巯基基团的化合物小分子或高分子，如二硫苏糖醇(DTT)；巯基改性的不同分子量的双臂或多臂聚乙二醇；巯基改性的双臂或多臂聚乙烯醇；包含2个或多个自由巯基的合成多肽、基因工程肽或蛋白。)

上述步骤(b)中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP)或2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(irgacure 2959)等水溶性光引发剂。

上述步骤(c)中，光照波长使用与光引发剂匹配的最佳波长，光强可调整。

上述步骤(c)中形成凝胶的过程中，带有巯基的交联剂分子可与改性胶原侧链的降冰片烯基反应，形成网络骨架结构，即将胶原分子交联成网络结构形成凝胶；该胶原水凝胶能够固定不作为凝胶骨架结构的功能分子，所述功能分子为蛋白质、肽、小分子药物、核酸、碳水化合物或多糖分子等；所述功能分子带有1个或1个以上的反应基团，所述反应基团为自由巯基或/和烯类基团(如甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、马来酰亚胺基、降冰片烯基等)。

所述反应基团分两种，功能分子自带的反应基团和修饰的反应基团。

功能分子自带的反应基团主要为自由巯基或烯类基团，包括但不限于各种蛋白、合成多肽、抗体、细胞等；修饰的反应基团分为巯基反应基团和烯类反应基团，以各种方式修饰于功能分子上。

本发明制备的干态改性光固化胶原和改性光固化胶原水凝胶应用于细胞的三维培养、挤出、光固化、喷墨等方式的3D打印、原位注射、凝胶敷料、止血剂等。

本发明的优点和有益效果如下：

1、本发明首次合成可光固化且可在中性条件下溶解的胶原，并进一步制备成胶原水凝胶，所制备的凝固具有良好的力学性能和极佳生物相容性。

2、本发明改性胶原为水相合成，合成方法简单，成本低廉。相比于多糖光固化材料，无需修饰粘附多肽促进细胞粘附。相比于其他硫醇-烯光固化材料，无需使用具有降解位点的交联剂。相比于光固化蛋白类材料，细胞具有更快的增殖速度和伸展能力。

3、普通胶原的凝胶速度为15min以上，本发明制备的改性胶原凝胶固化速度快至秒级，且在引入自由基前可以稳定保存。极大地提高了中性状态下的胶原可操作性。

4、本发明制备的改性胶原可以方便的和其他材料混合而不会引起胶原纤维化，极大地提高的该材料的改造空间。

5、本发明改性胶原固化后形成水凝胶，能够方便修饰活性物质，如药物、生长因子、多肽等。

6、实现了多种方式的含细胞的胶原打印。

附图说明

图1为改性胶原核磁谱图。

图2为改性胶原和胶原；其中：(a)SDS电泳图；(b)Zeta电位；(c)溶解度。

图3为凝胶外观和成纤维细胞7天时的生长状态；其中：(a)光固化前；(b)光固化后凝胶；(c)注射器中固化后挤出；(d)凝胶中成纤维细胞鬼笔环肽染色。

图4为不同种类和浓度的交联剂对成纤维细胞成活率和伸展能力的影响；其中：(a)SH-PEG-SH的1天和7天死活染色；(b)多肽的1天和7天死活染色；(c)DTT的1天和7天死活染色；(d)1天后成活率。

图5为不同引发剂用量的光固化改性胶原凝胶流变曲线。

图6为不同浓度的光固化改性胶原凝胶流变曲线。

图7为实施例4光敏改性胶原的挤出式3D打印；其中：(a)示意图；(b)打印结构外观；(c)1天死活染色；(d)7天DAPI染色；(e)7天鬼笔环肽染色；(f)merge。

图8为实施例5光敏改性胶原的挤出式3D打印；其中：(a)示意图；(b)打印结构外观；(c)1天死活染色；(d)7天DAPI染色；(e)7天鬼笔环肽染色；(f)merge。

图9为7天时成纤维细胞在海藻酸钠/改性胶原、海藻酸钠/胶原凝胶中的伸展情况；其中：(a)海藻酸钠/改性胶原凝胶；(b)海藻酸钠/胶原凝胶。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，以下结合实例对本发明进行描述，但实例仅为对本发明的特点和优点做进一步阐述，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1：

胶原提取：

牛跟腱破碎脱脂，浸入0.16mol/L的乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶(3mg/mL)。4℃搅拌72小时后，用4mol/L氯化钠溶液盐析，所得沉淀使用0.16mol/L乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液(0.16mol/L)调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取150mL上述牛跟腱，加冷纯水150mL，得到300mL 3mg/mL的牛跟腱溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，并将反应体系升温至25度，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠维持pH9直至pH不变。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、反应所得改性胶原核磁共振氢谱(图1)和SDS凝胶电泳(图2(a))证明降冰片烯基成功修饰，且胶原仍然保留三股螺旋结构。

7、测量未改性胶原溶液和改性胶原溶液不同pH下的等电点和溶解度，如图2(b)-(c)所示。

8、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为6mg/mL。

9、将上述改性胶原溶液加入SH-PEG-SH(分子量1000)，终浓度为4mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*10

实施例2：

胶原提取：

牛跟腱破碎脱脂，浸入0.16mol/L的乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶(3mg/mL)。4℃搅拌72小时后，用4mol/L氯化钠溶液盐析，所得沉淀使用0.16mol/L乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液(0.16mol/L)调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取150mL上述牛跟腱，加冷纯水150mL，得到300mL 3mg/mL的牛跟腱溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，并将反应体系升温至25度，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠维持pH9且pH保持不变。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为6mg/mL。

7、将上述改性胶原溶液中加入不同种类和浓度的交联剂：加入SH-PEG-SH(分子量1000)，终浓度为4mM和8mM，加入二硫苏糖醇(DTT)，终浓度为4mM和8mM，加入带有MMP酶降解位点的末端带有巯基的合成多肽(氨基酸序列为GCREG PQGIWGQ ERCG)，终浓度为4mM和8mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*10

8、将上述改性胶原溶液加入不同浓度的SH-PEG-SH(分子量1000)，终浓度分别为0、2、4、6、8mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，使用流变仪测量光固化过程的储能模量和损耗模量的变化，光波长为365nm，光强为20mW/cm

9、将上述改性胶原溶液加入DPBS稀释为浓度2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、加入SH-PEG-SH(分子量1000)，终浓度4mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，使用流变仪测量光固化过程的储能模量和损耗模量的变化，光波长为365nm，光强为20mW/cm

实施例3：

胶原提取：大鼠取尾腱，破碎脱脂，浸入0.02M的乙酸溶液。4度溶解3周，离心后取上清氯化钠盐析，所得沉淀使用0.02M乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液调节浓度，得到3mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取300mL上述鼠尾胶原溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠直至pH不变，调节反应体系温度为25度。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为6mg/mL。

7、将碱性成纤维细胞生长因子和sh-peg-nhs反应，得到带有巯基基团的碱性成纤维细胞生长因子。

8、将上述改性胶原溶液加入SH-PEG-SH(分子量1000)，终浓度为4mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入上述修饰的生长因子，终浓度为1μg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*10

实施例4：

胶原提取：牛跟腱破碎脱脂，浸入0.16M的乙酸溶液，并加入0.3％的胃蛋白酶。4度搅拌72小时后，氯化钠盐析，所得沉淀使用0.16M乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取150mL上述牛跟腱，加冷纯水150mL，得到300mL 3mg/mL的牛跟腱溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠直至pH不变，调节反应体系温度为25度。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为10mg/mL。

7、将上述改性胶原溶液加入SH-PEG-SH，终浓度为4mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*10

实施例5：

胶原提取：牛跟腱破碎脱脂，浸入0.16M的乙酸溶液，并加入0.3％的胃蛋白酶。4度搅拌72小时后，氯化钠盐析，所得沉淀使用0.16M乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取150mL上述牛跟腱，加冷纯水150mL，得到300mL 3mg/mL的牛跟腱溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠直至pH不变。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为10mg/mL。

7、将上述改性胶原溶液加入SH-PEG-SH，终浓度为4mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*105/mL，加入一定量的PBS调节改性胶原的终浓度为0.6mg/mL。

8、将上述溶液加入3D打印机喷头，挤出的同时以2mW/cm

实施例6：

胶原提取：牛跟腱破碎脱脂，浸入0.16M的乙酸溶液，并加入0.3％的胃蛋白酶。4度搅拌72小时后，氯化钠盐析，所得沉淀使用0.16M乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取150mL上述牛跟腱，加冷纯水150mL，得到300mL 3mg/mL的牛跟腱溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠直至pH不变。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为6mg/mL。

7、将上述改性胶原溶液加入金属蛋白酶降解合成多肽CGPQGIWGQC，终浓度为5mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*10

实施例7：

胶原提取：牛跟腱破碎脱脂，浸入0.16M的乙酸溶液，并加入0.3％的胃蛋白酶。4度搅拌72小时后，氯化钠盐析，所得沉淀使用0.16M乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

胶原改性：

1、取150mL上述牛跟腱，加冷纯水150mL，得到300mL 3mg/mL的牛跟腱溶液。

2、将0.9g降冰片烯二酸酐溶于15mL乙醇中。

3、使用3M氢氧化钠调节胶原溶液pH值为9，冰浴保持4度。

4、将上述酸酐溶液逐滴加入胶原溶液中，同时滴加3M氢氧化钠维持pH9，待酸酐滴加完毕，继续滴加氢氧化钠直至pH不变。

5、反应2小时后，将溶液移至8000截留分子量的透析袋中，使用蒸馏水透析4天，每天换水两次，将透析完成的溶液冻干，即得可溶性改性胶原。

6、将胶原重溶于DPBS溶液中，浓度为10mg/mL。

7、将上述改性胶原溶液加入以下试剂，交联剂SH-PEG-SH，终浓度为4mM，加入光引发剂LAP，终浓度为0.05mg/mL，加入成纤维细胞，终浓度为5*10