一种二维纳米片固定化纤维素酶的方法

摘要

本发明公开了一种二维纳米片固定化纤维素酶的方法，包括1)配制二维纳米片溶液，2)配制纤维素酶酶液与3)纤维素酶的固定化等步骤。通过金属离子和卟啉配体自组装制备得到二维纳米片，由于在第三个维度将纳米片的厚度降低到20nm以下，制得的纳米片具有较高的比表面积，明显提高了酶的负载量。且该纳米片的稳定性好，可以重复使用。同时，由于自组装的配体使用具有光敏性质的配体，该纳米片在光照下提高了固定化酶的催化效率。

说明书

技术领域

本发明涉及金属有机框架领域，尤其涉及一种二维纳米片固定化纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木属酶、曲霉属和青霉属。产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶、蛋白酶等。

纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。纤维素酶作为一种绿色生物催化剂，具有高催化活性、副反应少、低污染、操作稳定性高等一系列优点，然而，纤维素酶在实际工业应用中，自身也存在一些局限性:在高温、有机溶剂、强酸或强碱等条件下不够稳定，易变性失活，对环境的耐受性差；易被降解，反应过程中易发生团聚现象，与底物难以充分接触。游离纤维素酶价格比较高，而且一般只能催化一次反应，无法从反应体系中回收和重复利用，使得产品的生产成本大大提高，限制其在工业实践中的广泛应用。

β-葡萄糖苷酶是主要作用于β-(1，4)糖苷键，还作用于β-(1，1)、(1，2)、(1，3)、(1，6)糖苷键。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。纤维素酶在催化水解纤维素时首先由葡聚糖内切酶作用于微纤维的非结晶区，使其露出许多末端供外切酶作用，外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶)从非还原末端依次分解，产生纤维二糖，部分降解的纤维素进一步由葡聚内切酶和外切酶协同作用，分解生成纤维二糖、三糖等低聚糖，最后由β-葡萄糖苷酶作用分解成葡萄糖。在这个过程，β-葡萄糖苷酶起到关键作用，而在纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，制约了酶系中内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶发挥最大的作用，从而导致水解糖液中纤维二糖积累，降低了后续发酵可利用的糖量，成为纤维素酶解的瓶颈，往往在纤维素酶解过程中需要额外添加β-葡萄糖苷酶。

而酶的固定化技术极大的扩展了酶的应用范围。固定化酶是通过适当的方法将酶固定在一定的空间内，在保持其自身特性的同时能够实现回收和重复利用。固定化酶的出现解决了游离酶实际应用中的诸多局限。因此，研究纤维素酶的固定化技术是十分迫切的。酶的固定化可以使酶容易从反应混合物中分离回收，以便用于下一步反应。此外，酶的固定化还可以提高其热稳定性和化学稳定性和抵抗外界极端变化条件，所以开发新的纤维素酶固定化体系成为目前关注的中心。

中国专利CN106867990A公开了一种果糖水溶液固定化酶的制备方法，该合成方法中采用果糖做致孔剂，通过正硅酸乙酯水解反应溶胶-凝胶法来制备固定化β-葡萄糖苷酶。但该提取对酶的负载量低，酶的回收利用率低。因此，开展二维纳米片对于酶尤其是纤维素酶的固定化技术，并将其用于β-葡萄糖苷酶固定但不仅限于该产品的工业化生产具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种二维纳米片固定化纤维素酶的方法，通过金属离子和卟啉配体自组装制备得到二维纳米片，由于在第三个维度将纳米片的厚度降低到20nm以下，制得的纳米片具有较高的比表面积，明显提高了酶的负载量。且该纳米片的稳定性好，可以重复使用。同时，由于自组装的配体使用具有光敏性质的配体，该纳米片在光照下提高了固定化酶的催化效率。

技术方案：本发明的一种二维纳米片固定化纤维素酶的方法，包括下述步骤：

1)配制二维纳米片溶液：以含羧基官能团的酸为调节剂，四水合醋酸镥(III)与中-四(4-羧基苯基)卟啉(H

2)配制纤维素酶酶液：将纤维素酶粉溶于磷酸缓冲盐溶液中，2℃～7℃下搅拌均匀后，以12000r/min～15000r/min的转速离心3min～5min，将上清液转移到容量瓶中，用磷酸缓冲盐溶液定容后得到酶促合成β-葡萄糖苷酶纤维素酶，即纤维素酶酶液；

其中，优选5℃下搅拌均匀后，以12000r/min的转速离心3min。

3)纤维素酶的固定化：将二维纳米片溶液与纤维素酶酶液混合，抽滤后加入去离子水溶解，并用磷酸盐缓冲液洗去多余的纤维素酶，定容、冷冻干燥得到二维纳米片固定化的纤维素酶。

其中，所述的磷酸缓冲盐溶液的pH值为6.8～7.4。优选pH值为7.0。

其中，所述的步骤(1)的中-四(4-羧基苯基)卟啉与四水合醋酸镥(III)的质量比为1:1～4，所述调节剂与中-四(4-羧基苯基)卟啉(H

其中，所述的步骤(1)的调节剂为甲酸、4,4-联苯二羧酸、乙酸、苯甲酸、三氟乙酸中的一种或二种以上。优选甲酸。

其中，制备所述的步骤(1)中二维纳米片的反应温度为120℃～200℃，反应时间为8h～24h。

其中，所述的步骤(2)的纤维素酶粉是从动物、植物或微生物中提取的一种。

其中，所述的步骤(2)的酶促合成β-葡萄糖苷酶纤维素酶的活性为500U/g，加酶量为30mg/g～35mg/g。加酶量优选30mg/g。

其中，所述的步骤(3)的固定化时间为12h～16h，固定化温度为25℃～28℃，固定化pH为6.8～7.4。固定化时间优选12h，固定化温度优选27℃，固定化pH优选7.0。

原理描述：本申请通过金属离子和卟啉配体自组装制备得到二维纳米片，由于在第三个维度将纳米片的厚度降低到20nm以下，制得的纳米片具有较高的比表面积，明显提高了酶的负载量。且该纳米片的稳定性好，可以重复使用。同时，由于自组装的配体使用具有光敏性质的配体，该纳米片在光照下提高了固定化酶的催化效率。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明制备的二维纳米片从投射电镜中可以看出其具有高比表面积和高空隙率，有利于提高固定化酶的载酶量和提高固定化酶的催化效率；本发明的二维纳米片为酶的固定化载体，易于从反应体系中回收，可以重复使用，极大地提高酶的利用率和降低生产成本；本发明的二维纳米片具有良好的生物相容性，可以为其表面固定化酶蛋白提供良好的微环境；本发明的酶的使用寿命和效率大大提高，本发明固定化酶重复使用10次后，β-葡萄糖苷酶的光学纯达到99％以上。

附图说明

图1为本发明的二维纳米片的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。

本发明的二维纳米片如图1所示，纳米片的长度0.2μm～10μm，纳米片的厚度2nm～20nm。从投射电镜中可以看出其具有高比表面积和高空隙率，有利于提高固定化酶的载酶量和提高固定化酶的催化效率。

本发明的技术方案如下：

1)配制二维纳米片溶液：以含羧基官能团的酸为调节剂，四水合醋酸镥(III)与中-四(4-羧基苯基)卟啉(H2TCPP)自组装得到二维纳米片，将二维纳米片溶于磷酸缓冲盐溶液中制备含二维纳米片的磷酸缓冲盐溶液，即二维纳米片溶液。

2)配制纤维素酶酶液：将纤维素酶粉溶于磷酸缓冲盐溶液中，2℃～7℃下搅拌均匀后，以12000r/min～15000r/min的转速离心3min～5min，将上清液转移到容量瓶中，用磷酸缓冲盐溶液定容后得到酶促合成β-葡萄糖苷酶纤维素酶，即纤维素酶酶液；

其中，选择5℃下搅拌均匀后，以12000r/min的转速离心3min。

3)纤维素酶的固定化：将二维纳米片溶液与纤维素酶酶液混合，抽滤后加入去离子水溶解，并用磷酸盐缓冲液洗去多余的纤维素酶，定容、冷冻干燥得到二维纳米片固定化的纤维素酶。

其中，所述的磷酸缓冲盐溶液的pH值为6.8～7.4；选择pH值为7.0。步骤(1)的中-四(4-羧基苯基)卟啉与四水合醋酸镥(III)的质量比为1:1～4，调节剂与中-四(4-羧基苯基)卟啉(H2TCPP)的摩尔比为0.6～1.5:1；选择四水合醋酸镥(III)为22mg，中-四(4-羧基苯基)卟啉为10mg，甲酸为9mg。步骤(1)的调节剂为甲酸、4,4-联苯二羧酸、乙酸、苯甲酸、三氟乙酸中的一种或二种以上；选择甲酸。制备步骤(1)中二维纳米片的反应温度为120℃～200℃，反应时间为8h～24h；选择反应温度为160℃，反应时间为16h。步骤(2)的纤维素酶粉是从动物、植物或微生物中提取的一种。步骤(2)的酶促合成β-葡萄糖苷酶纤维素酶的活性为500U/g，加酶量为30mg/g～35mg/g；选择加酶量为30mg/g。

其中，步骤(3)的固定化时间为12h～16h，固定化温度为25℃～28℃，固定化pH为6.8～7.4。固定化时间优选12h，固定化温度优选27℃，固定化pH优选7.0。通过发明人研究发现：

1、固定化时间对固定化的影响

固定化时间过短，固定化不完全，导致固定化酶的活性过低，固定化时间过长，酶的活性会下降，间接导致固定化酶的活性下降。因此，二维纳米片的固定化时间小于12h时，随着固定化时间的增加，固定化酶的活力有所增加。而酶与载体的固定化时间大于12h后酶活力开始下降，可能原因是固定化时间延长，导致酶活力的下降，反而不利于固定化酶活力的提高。综上所述，固定化载体二维纳米片对纤维素酶的最佳固定化时间为12h。

2、固定化温度对固定化的影响

选择合适的固定化温度，对固定化酶的活力是至关重要的。低温条件下，有利于酶活力的保持，但分子交换的速度变慢，会使固定化时间延长；而提高温度，不利于酶活力的保持，但固定化时间会相对降低，提高固定化的效率。固定化温度在5℃到27℃之间时，随着温度的增加，固定化酶的活力增加，可能是温度上升，有利于酶的吸附；温度超过27℃，固定化酶的活力开始下降，可能是温度上升导致酶的活力有所下降，固定化载体二维纳米片对纤维素酶的最佳固定化温度为27℃。

3、pH对固定化的影响

pH直接影响酶的活力，过高过低都不利于固定化酶活性的提高。纤维素酶在pH＝7.0的缓冲液中，活力最高。因此，固定化载体二维纳米片对纤维素酶的最佳固定化pH为7.0。

由上所述，本发明提供一种纤维素酶的固定化方法中的最佳固定化条件：固定化时间为12h，固定化温度为27℃，固定化pH为7.0。

4、固定化纤维素酶和游离酶的热稳定性

研究固定化纤维素酶和游离纤维素酶在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下作用3h，测定不同温度作用后的活力变化，以最高酶活数据为100％酶活力，结果表明：游离纤维素酶活性在80℃加热3h后剩余26.7％，固定化纤维素酶的酶活性保持在82.4％。二维纳米片固定化纤维素酶的活性相对游离酶有了很大的提高，酶的热稳定性在固定化后增强，因为固定化载体为酶分子的保持提供了额外的保护骨架。

5、固定化纤维素酶的重复使用性及光学纯

将固定化纤维素酶按照纤维素酶测定条件(35℃，10min)测定酶活，用pH＝7的磷酸盐缓冲液洗两次，测定合成β-葡萄糖苷酶所需固定酶的重复使用性和光学纯，重复该过程10次。计算每次剩余的固定化酶酶活和光学纯。结果表明，重复使用6次后，固定化载体二维纳米片固定化纤维素酶保留其活性的92％，光学纯保持在97％以上。在重复使用性过程中，固定化纤维素酶是紧密附着在载体上，从而保持活性。在重复使用10次后，二维纳米片修饰的纤维素酶的活性保持在82.6％，光学纯保持在96％以上。