基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR‑dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，该方法包括：选取lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计向导sgRNA序列；获取用于系统使用的Oligo；切割慢病毒载体，利用连接酶将修改后sgRNA序列对应的Oligo连接到慢病毒载体上；针对标靶细胞系，利用慢病毒包装试剂盒包装慢病毒及dcase9载体，分别制备红色荧光慢病毒以及蓝色荧光慢病毒并转染标靶细胞系，分选双重阳性细胞；筛选获得稳定转染慢病毒及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。本发明旨在解决现有的基因敲减技术无法稳定敲减核内lncRNA的技术问题。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法。

背景技术

长链非编码IncRNA(long non-coding RNA)是一类长度超过200nt的RNA分子，位于细胞核或胞质内；其只转录不翻译的RNA分子，其参与细胞分化、凋亡、免疫应答、生长发育、糖脂代谢、炎症以及肿瘤等多种生命过程。长链非编码RNA按照其来源可分为AntisenselncRNA(反义长非编码RNA)，Intronic tran(内含子非编码RNA)，Long intergencnoncoding RNA(lincRNA)，Promoter-associated lncRNA(启动子相关lncRNA)，UTRassociated lncRNA(非翻译区lncRNA)五种类型。lncRNA在转录前、转录水平与转录后水平上均具有重要作用。在整个基因组转录产物中，lncRNA所占的比例远远超过编码RNA所占的比例，与人类和动物相比，植物lncRNA研究仍处于起步阶段，植物lncRNA的研究可能揭示控制植物生长和分化的未知新机制，lncRNA在植物开花、雄性不育、营养代谢、生物和非生物胁迫等多种生物过程中起着调节因子的作用。核内lncRNA(HoxBlinc)具有调控白血病发生发展过程中重要的转录因子HoxB系列基因的功能。

研究长链非编码LncRNA常规操作是功能获得(过表达)以及功能缺失(干扰或敲除)，RNAi技术是常用的敲减手段，RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。但是现有的基因敲减技术无法稳定敲减主要位于核内的lncRNA，具体的，shRNA(短发夹RNA)主要作用位点在于细胞质，针对主要位于细胞核内的lncRNA敲减存在不稳定性，往往造成后续实验多次重复的不稳定性，同时针对shRNA的设计显的尤其重要并且具有很高的不确定性，这往往导致实验资源的浪费，并且造成实验结果的不稳定性，以及难重复性。另外，ASO(反义寡核苷酸)跟siRNA(小干扰RNA)设计原理类似，只是化学成分上有区别，siRNA是反义RNA，而ASO则是反义RNA、DNA的杂合物，胞浆定位的lncRNA由RNA-RNA形成的二元复合物以RISC的形式被Dicer酶降解，而核定位lncRNA则形成DNA-RNA复合物被RNAse H分解(核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA)。ASO是多能选手，但是化学合成的ASO只适合常规的细胞学实验，只能瞬时转染的特性导致其不能构建稳定转染细胞株以进行长期研究，更不适合动物水平的基因功能研究。

发明内容

本发明的主要目的在于提出一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，旨在解决现有的基因敲减技术无法稳定敲减主要位于核内的lncRNA的技术问题。

CRISPRi系统是在DNA水平实现基因的转录抑制，dCas9(失去切割活性的cas9)与转录抑制域KRAB融合，表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区，并通过KRAB蛋白抑制真核生物启动子PolII与启动子的结合，从而抑制基因的转录。CRISPRi是在转录前发挥作用，所以不必考虑lncRNA本身的特质，CRISPRi系统可以在细胞系里稳定表达，同时弥补了RNAi以及ASO技术的缺点。

为了解决上述技术问题，基于上述原理，本发明提供了一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，该方法包括：

选取所述lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列；

获取用于所述CRISPRi系统使用的sgRNA核苷酸链Oligo；

切割慢病毒lenti-sgRNA载体，利用T4-DNA连接酶将修改后所述sgRNA序列对应的所述Oligo连接到所述慢病毒sgRNA载体上；

针对标靶细胞系，利用慢病毒包装试剂盒包装所述慢病毒sgRNA及dcase9载体，分别制备红色荧光lenti-dcase9-mcherry慢病毒以及蓝色荧光lenti-sgRNA-BFP慢病毒；

所述lenti-dcase9-mcherry慢病毒和所述lenti-sgRNA-BFP慢病毒转染所述标靶细胞系，分选红色荧光蛋白mcherry、蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞；

筛选转染后的标靶细胞以获得稳定转染的所述慢病毒sgRNA及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。

进一步的，所述选取所述lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列的步骤之前，所述方法还包括：

获取目标细胞核内长链非编码lncRNA全长DNA序列。

进一步的，所述切割慢病毒sgRNA载体，利用T4-DNA连接酶将修改后所述sgRNA序列对应的所述Oligo连接到所述慢病毒sgRNA载体上的步骤之前，所述方法包括：

根据所使用的慢病毒sgRNA载体修改所述sgRNA 5’端及3’端序列；

进一步的，所述SgRNA的Oligo是根据以下sgRNA核心序列片段以及所连接载体修饰后所得的：

sgRNA核心序列1:GAAACCGAAGGCCCGAGCGGAGG；

sgRNA核心序列2:CCAGCCGGCCTGCGCACCGGCGG；

sgRNA核心序列3:CTGGGGACTCGCCTCCGCTCGGG；

sgRNA核心序列4:GCCGGTGCGCAGGCCGGCTGGGG；

sgRNA核心序列5:GCTGGGGACTCGCCTCCGCTCGG；

sgRNA核心序列6:GCCGGCCTGCGCACCGGCGGCGG。

进一步的，所述设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列的步骤具体包括：

使用网络sgRNA预测数据库平台设计长度为20bp左右的所述sgRNA序列。

进一步的，所述慢病毒包装试剂盒是lipo2000转染试剂盒、lipo3000转染试剂盒、磷酸钙转染试剂盒的其中一种。

进一步的，所述慢病毒lenti-sgRNA载体是慢病毒sgRNA表达载体Addgene 60955、Addgene 118650、Addgene 65656的其中一种。

进一步的，所述筛选转染后的标靶细胞以获得稳定转染的所述慢病毒sgRNA及dcase9载体的单克隆标靶细胞系具体为：

利用96孔板筛选转染后的标靶细胞以获得稳定转染的所述慢病毒sgRNA及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。进一步的，所述分选红色荧光蛋白mcherry、蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞的步骤包括：

利用流式细胞仪分选所述红色荧光蛋白mcherry、所述蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞。

进一步的，所述分选红色荧光蛋白mcherry、蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞的步骤包括：

根据所述慢病毒lenti-sgRNA载体的抗生素抵抗靶点获取对应的筛选药物，用于分选所述红色荧光蛋白mcherry、所述蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞。

具体的，CRISPRi系统利用慢病毒转染体系构建稳定表达细胞系解决ASO无法稳定转染及无法利用稳定转染细胞系进行动物体内实验的弊端。同时CRISPRi系统的作用原理是在核内转录起始位点通过dcase9结合sgRNA精准招募KRAB蛋白从而影响标靶基因的转录以达到表达抑制的目的。

本发明技术方案的有益效果：

本发明技术方案提供的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，CRISPR-dCase9系统可在不进行双链DNA切割的情况下，靶向上调或下调基因或者lncRNA的转录水平，从lncRNA转录水平抑制核lncRNA的表达同时保留其可能的发挥功能调控的序列，从而为后续基因功能研究或临床基因治疗提供平台。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法流程框图；

图2是本发明实施例涉及的SgRNA设计原理示意图；

图3是本发明实施例涉及的其中一种SgRNA构建结构模型；

图4是本发明实施例涉及的红色荧光蛋白mcherry转染观测图；

图5是本发明实施例涉及的蓝色荧光蛋白BFP转染观测图；

图6是本发明实施例涉及的阳性细胞转染观测图；

图7是本发明实施例涉及的HoxBlinc表达水平对比图；

图8是本发明实施例涉及的HoxBlinc调控HoxB locus的基因表达水平对比图；

图9是本发明实施例涉及的基因表达改变影响稳定转录细胞系生长图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在后续的描述中，使用用于表示元器件的诸如“模块”、“部件”或“单元”的后缀仅为了有利于本发明的说明，其本身没有特定的意义。因此，“模块”、“部件”或“单元”可以混合地使用。

CRISPR(

CRISPR通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现、切除并取代DNA的特定部分，该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN(转录激活因子类感受器核酸酶)等其他基因编辑技术更高。CRISPR-Cas9系统的简约和高效使其迅速成为重要的基因研究工具。除了基因编辑，它还作为功能基因组筛选工具，帮助人们在全基因组范围内开展功能丧失研究。近来，CRISPR-Cas9工具箱已经大大扩展，新增了CRISPRi和CRISPRa这两种工具。

CRISPRi技术能抑制指定目标的转录，不论是编码还是非编码的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9(dCas9)，dCas9能到达引导RNA指定的位点，但无力对DNA进行剪切(Cell,152:1173-83,2013)。当dCas9结合到基因组的时候，会阻断转录机器的结合，阻止这一过程的进行。

另外，CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子(KRAB)的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展，使其难以得到转录。虽然它作用于比较大的位点，但抑制效果也更强，更容易被我们观察到。dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此，dCas9蛋白的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进入基因组的能力。dCas9蛋白可以与效应器(如阻遏蛋白和激活剂结构域)形成融合蛋白，这样，dCas9可以将这些效应器带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤；可用于研究转录因子或辅助转录因子对特定基因的影响。

实施例1

如图1所示，本发明实施例提供了一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，该方法包括：

S101、选取所述lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列；

具体的，所述选取所述lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列的步骤之前，获取目标细胞核内长链非编码lncRNA全长DNA序列。

具体的，sgRNA(small guide RNA简称)，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guide RNA，由两部分组成—tracRNA和crRNA,两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。

如图2所示，SgRNA设计大体原则如下：

(1)对于sgRNA的长度，一般应为20nt左右；

(2)对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC％含量最佳为40％～60％；

(3)sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低；

(4)如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，以提高其转录效率；

(5)对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子；

(6)检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；

(7)如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；

(8)全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区等，另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。

另外，sgRNA的活性与CRISPR系统的突变效率直接相关，好的sgRNA靶点，会带来更高的突变效率，更多的阳性克隆，在后期筛选和鉴定时都能事半功倍，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到有活性的靶点至关重要。通常在设计特异性靶点后，需要进行体外细胞活性筛选，筛选出有效的靶点用于后续实验。

如何设计特异性好的sgRNA:

如果软件中有你需要的物种基因组序列，可以在下列网站中设计。

1、http://crispr.mit.edu/

2、http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/

3、http://spot.colorado.edu/～slin/cas9.html

4、http://www.e-crisp.org/E-CRISP/

5、http://flycrispr.molbio.wisc.edu/

6、http://www.flyRNAi.org/crispr/,Drosophila

7、http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp

8、http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php

9、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx

10、http://cas9.wicp.net/

11、http://crispr-era.stanford.edu/

12、http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR植物

用于敲降的SgRNA设计靶序列选择：

根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因的启动子区域，通过网络数据库如:UCSC Genome Browser(https://genome.ucsc.edu/)获取基因转录起始位点上下游100bp序列。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。

选择100bp的转录起始位点上下游序列输入到在线设计sgRNA的软件Input框中(http://crispr.mit.edu/)，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。

如图3所示，其中一种sgRNA的构建模型。根据设计的sgRNA靶点序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG合成一对序列互补的DNA Oligos。

根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点Oligo如下(BbsI酶切)：

5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3‘-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5’

测序引物：U6-CRISP/Cas9-promoter：gggcctatttcccatgattc

根据需要，设计好的靶点可以用于载体构建，或体外转录sgRNA，进行细胞转染或受精卵注射。

本申请实施例中，使用网络sgRNA预测网站基于人类Grch38参考基因组设计长度为20bp左右的sgRNA。其中，hg38是指人参考基因组，相似的还有hg19基因组等等。

本具体实施方式采用的操作方式为：

预测网站如下：

https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgRNA-design

利用网站输入标靶lncRNA启动子转录起始位点上下游100bp序列来预测sgRNA序列，后根据具体sgRNA载体添加核心序列5’及3’端的突出端修饰序列，使其更易与载体连接。

S102、获取用于所述CRISPRi系统使用的sgRNA核苷酸链Oligo；具体的，所述Oligo是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。本发明实施例中核苷酸链Oligo是根据以下sgRNA核心序列片段设计：

sgRNA核心序列1:GAAACCGAAGGCCCGAGCGGAGG；

sgRNA核心序列2:CCAGCCGGCCTGCGCACCGGCGG；

sgRNA核心序列3:CTGGGGACTCGCCTCCGCTCGGG；

sgRNA核心序列4:GCCGGTGCGCAGGCCGGCTGGGG；

sgRNA核心序列5:GCTGGGGACTCGCCTCCGCTCGG；

sgRNA核心序列6:GCCGGCCTGCGCACCGGCGGCGG。

可选的，sgRNA核苷酸链Oligo不限于上述核心片段序列，利用Blast工具(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/)针对本申请的sgRNA获取：

PAM:NGG

Target site length:20

Target site 5'limitation:NN

Target site 3'limitation:NN

Core length:12

Core MM:2

Total MM:3

Blast，全称Basic Local Alignment Search Tool，即"基于局部比对算法的搜索工具"。Blast能够比较两段核酸或者蛋白序列之间的同源性，它能够快速的找到两段序列之间的同源序列并对比对区域进行打分以确定同源性的高低。

其中，Oligo(dT)的功能：因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来，属于亲和层析技术。

反转录(RT-PCR)：因绝大多数真核细胞mRNA 3'端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4％，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物所得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。但是在反转录从mRNA获得cDNA时，也可以用随机六聚体引物和特异性引物。

随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96％来源于rRNA。

特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

其中，Hox基因(Hox genes)全名同源基因(英语:homeotic genes)或同源异型基因。是生物体中一类专门调控生物形体的基因，一旦这些基因发生突变，就会使身体的一部分变形。其作用机制，主要是调控其他有关于细胞分裂、纺锤体方向，以及硬毛、附肢等部位发育的基因。Hox基因属于同源异型盒(homeobox)家族的其中一员，在大多数Hox基因中，会含有一段约180个核苷酸的同源异型盒，可以转录出含有约60个氨基酸序列，称为同源蛋白质区段(homeodomain)。人类的Hox基因可分成4个基因群集，分别位在不同的染色体上，这些染色体分别是7号、17号、12号与2号。人类的Hox基因在书写时以全大写表达，例如HOXA、HOXB、HOXC与HOXD。此外，这些基因可分成13个平行同源家族(paralogous family)，以数字表示，例如HOXA4，HOXB4，HOXC4与HOXD4。这些家族成员的DNA序列与转录出来的蛋白质序列类似。

LincRNA即Long intergenic non-coding RNA。人类细胞中仅有少数转录生成的RNAs可作为蛋白质合成的模板。其余的RNA被称为非编RNAs(ncRNAs)它们位于编码蛋白的基因之间，其中长度超过200bp的ncRNAs称为lincRNAs。尽管细胞中存在大量的lincRNAs，然而长期以来它们被人们视为是转录RNAs中的"暗物质"，对其功能及机制均知之甚少。LincRNA序列的获取有以下两种途径:①可参考LncRNA(Long non-coding RNA)序列的获取，只是在获得LncRNA的序列后需确认该LncRNA为LincRNA；②通过检索LincRNA的研究论文获取其序列，很多LincRNA的序列会在附件中包含或者文章提供链接地址。

S103、根据sgRNA载体利用载体特定限制性内切酶切割慢病毒lenti-sgRNA载体，利用T4-DNA连接酶将修改后所述sgRNA序列对应的所述Oligo连接到所述慢病毒sgRNA载体上。

T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺口(single-strand nicks)。T4DNA连接酶在分子生物学中有广泛的应用。T4DNA连接酶是经原核表达，柱层析纯化获得的高纯T4DNA接酶，SDS-PAGE显示为一条62kD的蛋白条带。本品附带10xLigationBuffer含有ATP；适用于DNA片断接、克隆等各种反应。

S104、针对标靶细胞系，利用慢病毒包装试剂盒包装所述慢病毒sgRNA载体，分别制备红色荧光lenti-dcase9-mcherry慢病毒以及蓝色荧光lenti-sgRNA-BFP慢病毒；

S105、所述lenti-dcase9-mcherry慢病毒和所述lenti-sgRNA-BFP慢病毒转染所述标靶细胞系，分选红色荧光蛋白mcherry、蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞。

具体的，如图4、5、6所示，利用流式细胞仪分选所述红色荧光蛋白mcherry、所述蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞。

或者，根据所述慢病毒lenti-sgRNA载体的抗生素抵抗靶点获取对应的筛选药物，用于分选所述红色荧光蛋白mcherry、所述蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞。

其中，mCherry是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定位等。不同于其它从维多利亚水母中分离的GFP蛋白和其它绿色荧光蛋白变体，mCherry以及其它大多数红色荧光蛋白是从珊瑚(Discosoma)中分离出来的蛋白。mCherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm。

S106、筛选转染后的标靶细胞以获得稳定转染的所述慢病毒sgRNA及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。

具体的，利用96孔板筛选转染后的标靶细胞以获得稳定转染的所述慢病毒sgRNA及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。

具体的，所述切割慢病毒sgRNA载体，利用T4-DNA连接酶将修改后所述sgRNA序列对应的所述Oligo连接到所述慢病毒sgRNA载体上的步骤之前，所述方法包括：根据所使用的慢病毒sgRNA载体修改所述sgRNA 5’端及3’端序列。目的是增加sgRNA序列及载体的链接匹配程度。

可选的，所述慢病毒包装试剂盒是所述慢病毒包装试剂盒是lipo2000转染试剂盒、lipo3000转染试剂盒、磷酸钙转染试剂盒的其中一种。

可选的，所述慢病毒lenti-sgRNA载体是慢病毒sgRNA表达载体Addgene 60955、Addgene 118650、Addgene 65656的其中一种，或者其他用于进行目的sgrna分子克隆及后续构建稳定转染的慢病毒载体。

因此，CRISPRi系统利用慢病毒转染体系构建稳定表达细胞系解决ASO无法稳定转染及无法利用稳定转染细胞系进行动物体内实验的弊端。同时CRISPRi系统的作用原理是在核内转录起始位点通过dcase9结合sgRNA精准招募KRAB蛋白从而影响标靶基因的转录以达到表达抑制的目的。

现提供其中一个具体实施方式，如图7、8、9所示，取sgScramble(就是作为对照的sgRNA)以及sgHoxblinc(针对本实施例目的lncrna-hoxblinc的sgRNA)细胞系(两个单克隆重复)提取RNA,逆转录cDNA。Realtime-qPCR测定三个细胞系中HoxBlinc表达量以确定CRISPRi系统的敲降效率。敲降的效率一般根据转染之后的单克隆细胞株检测目的基因表达，以qPCR实验结果相比对照组计算出下降的百分比作为CRISPRi系统的敲降效率。

其中，RealTime PCR(qPCR)，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，是一种利用荧光染剂检测每次PCR循环后产物总量的方法技术，是常规PCR的衍生反应。主要是通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。因其具有灵敏、特异、精确以及使用简便等优点，现已发展成为分子生物学研究中的重要工具。

试验结果表明：CRISPRi系统针对核内lncRNA进行稳定的敲降弥补了RNAi技术的缺陷。CRISPRi系统可以构建稳定转染细胞系，方便后续细胞系研究的开展以及体内实验验证的开展。CRISPRi系统在不剪切dna的情况下调控基因表达，为临床基因治疗提供了更安全的选择。

本发明实施例提供的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，CRISPR-dCase9系统可在不进行双链DNA切割的情况下，靶向上调或下调基因或者lncRNA的转录水平，从lncRNA转录水平抑制核lncRNA的表达同时保留其可能的发挥功能调控的序列，从而为后续基因功能研究或临床基因治疗提供平台。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员可以清楚地了解到上述实施例方法可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现，当然也可以通过硬件，但很多情况下前者是更佳的实施方式。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质(如ROM/RAM、磁碟、光盘)中，包括若干指令用以使得一台终端设备(可以是手机，计算机，服务器，空调器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述的方法。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。