一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用

摘要

本发明公开了一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒针对LTC4S(A‑444C)、PEAR1(rs12041331)两个基因的多态性血管紧张素II受体抑制剂设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、LTC4S(A‑444C)测序引物、PEAR1(rs12041331)测序引物和阳性对照。本发明采用采用非对称多重PCR一管扩增产生大量的单链DNA，通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链DNA特异捕获单链DNA，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤，简化了测序处理的流程和时间，检测结果判读便捷、明确，能从基因层面指导阿司匹林的用药，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用，属于药物基因组检测领域。

背景技术

阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药，可抑制血小板活化、聚集，防止血栓形成，在心脑血管病的一、二级防治中，起着至关重要的作用。然而，临床发现部分长期服用阿司匹林的患者，心脑血管事件的发生率并未降低，即可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗(Aspirin resistance，AR)现象。有研究报道5％-40％的人存在阿司匹林抵抗。

白三烯C4合成酶(LTC4S)基因多态性rs730012(-444A＞C)是位于LTC4S基因中的一个SNP，LTC4S基因启动区域第一个密码子上游的第444位核酸，形成了A至C的易位，基于rs730012，人群中存在三种基因型，AA/AC/CC。研究显示，LTC4S启动子上的rs730012(-444A>C)多态性与阿司匹林超敏反应的产生有关联，阿司匹林性哮喘患者中C等位基因频率更高，与阿司匹林高敏性有关。AA基因型，使用阿司匹林发生荨麻疹或哮喘的风险较低，AC基因型次之，CC基因型风险最高。

PEAR1(platelet endothelial aggregation receptor 1)基因是近年发现的与血小板聚集密切相关的基因，位于1号染色体，在血小板和内皮细胞均有高度的表达，其编码Ⅰ型膜蛋白，在胞外有多个酪氨酸和脯氨酸残基，在胞内有5个脯氨酸残基和1个NPXY922区域，均为磷酸化酪氨酸的结合位点。该基因可通过调控PI3K/PTEN通路，影响血小板的功能，为非Cox依赖性途径影响血小板聚集。在PEAR1的遗传变异中，rs12041331(A/G)可以改变它的表达。与G携带者相比，A携带者的阿司匹林肾上腺素诱导的血小板聚集显著降低，且AA诱导的血小板聚集不受阿司匹林剂量的影响。因此，rs12041331(A/G)位点多态性的检测有助于提供合理的用药治疗方案。

目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。

不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。

常规焦磷酸测序前处理操作较为复杂和耗时，因此，设计开发一款可以结合不对称PCR技术的快速检测的焦磷酸检测试剂盒是十分必要的。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以非对称多重PCR扩增和优化焦磷酸测序技术为基础，获得一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用的技术方案如下：

本发明的试剂盒针对LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)两个基因的多态性血管紧张素II受体抑制剂设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、LTC4S(A-444C)测序引物、PEAR1(rs12041331)测序引物和阳性对照。

优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：

即，所述LTC4S(A-444C)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述PEAR1(rs12041331)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。

优选的，所述的LTC4S(A-444C)测序引物、PEAR1(rs12041331)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。

更优选的，所述的测序引物，为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物，既充当测序引物又作为捕获探针。该引物与扩增的单链DNA结合以后，经过简单洗涤即可直接用于测序反应。

更优选的，所述的测序引物，其制备过程包括将合成氨基标记的测序引物在结合液的情况下与羧基修饰素琼脂糖凝胶微颗粒混合，洗涤去除游离的测序引物，在保存液中2-8℃保存。

优选的，所述的扩增反应液，包括LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)特异性扩增引物，还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻糖、无核酸酶水；

更优选的，反应液各组分浓度分别为：LTC4S(A-444C)后引物(1.2uM)，LTC4S(A-444C)后引物(0.02uM)，PEAR1(rs12041331)前引物(1.2uM)，PEAR1(rs12041331)后引物(0.02uM)，PCR Buffer(1.5×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，dUTP(0.5mM)、UDG酶(1U)和无核酸酶水(将体系补充至20μL)。

优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。

本发明的另一个目的是公开一种采用上述试剂盒的血管紧张素II受体抑制剂用药相关的基因多态性检测方法，所述检测方法对待测的LTC4S(A-444C)和PEAR1(rs12041331)位点进行焦磷酸测序。所述焦磷酸测序的待测基因采用非对称多重PCR方式扩增获得。

具体的，所述检测方法包括以下步骤：

a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用非对称多重PCR扩增进行扩增；

b.将10ul反应产物与3ul测序引物分别进行结合；

c.焦磷酸测序；

d.确定LTC4S(A-444C)位点、PEAR1(rs12041331)位点血管紧张素II受体抑制剂位点的基因型。

优选的，所述的反应体积为25ul，扩增条件为：酶处理37℃3min；预变性95℃，5min；

40个循环，95℃15s，60℃25s，72℃25s；最后延伸72℃4min。

本发明还公开了一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法的应用，所述用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒用于同时检测LTC4S(A-444C)和PEAR1(rs12041331)位点，以判断样本源的代谢类型。以从基因层面指导血管紧张素II受体抑制剂的用药。

本发明还公开了一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)进行检测，以从基因层面指导阿司匹林疗效及不良反应预测。

与现有技术相比，本发明采用非对称多重PCR一管扩增LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)，产生大量的单链DNA。通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链DNA特异捕获单链DNA，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤，简化了测序处理的流程和时间，检测结果判读便捷、明确，能从基因层面指导阿司匹林的用药，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

附图说明

图1是本发明提供的LTC4S(A-444C)焦磷酸检测结果示例图；

图2是本发明提供的PEAR1(rs12041331)焦磷酸检测结果示例图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

1、试剂盒的制备

本发明的试剂盒针对LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)设计了特异性扩增引物和测序引物，用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。

本实施例的检测试剂盒包括如下组分：

本实施例的检测试剂盒扩增反应液单人份配置体系如下：

以上引物探针购自生工、dNTP(25mM)购自诺唯赞、10×PCR buffer、HS Taq(5U/μL)购自TAKARA、UNG酶(5U/μL)Thermo Fisher。

本实施例的检测试剂盒测序引物制备过程如下：

(1)MES溶液配置

①100mM MES,pH 4.8(100mL)：

②2.13g MES(2-[N-morpholino]ethane sulfonic acid,MW 213.25).

③pH 4.8

(2)TT Buffer(50mL)

①12.5mL of 1M Tris buffer pH 8

②50ul 10％

(3)封闭液

(4)捕获磁珠制备

1)取500ul磁珠，吸磁1min，去上清；

2)取1000ml 100MES溶液洗涤吸磁1min，去上清，重复洗涤2次；

3)取10mg/ml EDS和10mg/ml NHS各500ul，加入捕获引物10ul。

4)25℃杂家30min

5)取1000ml封闭液混合均匀，吸磁1min，去上清；

6)取1000ml TT Buffer混合均匀，吸磁1min，去上清；重复洗涤3次；

7)加入1ml TE缓冲液溶解。

2、焦磷酸检测

本发明中采用的仪器如下：PCR扩增仪：ABI 2720 PCR仪；

焦磷酸测序仪：武汉菲思特生物科技有限公司。

(1)试剂准备

提前将试剂取出，室温融化，并将各组分涡旋振荡15秒，将试剂盒各组分低速离心待用。确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μL/管分装至PCR反应管中。

(2)加样检测

将样本DNA、阳性对照和空白对照按5μL加样量加入到PCR反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。所加入的待测样本DNA应大于20copies。

(3)PCR扩增

采用PCR仪进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，扩增条件：

(4)焦磷酸测序

1)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒与DNA序列的结合物3ul，再向其中加入PCR产物10μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使测序引物和单链PCR产物充分结合；

2)7,000×g离心1min，弃上清；

3)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7000g离心1min，弃上清；

4)测序管中分别加入3uL测序酶和3uL测序底物；

5)取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入20μldATPαS、20μl dTTP、20μldGTP、20μl dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；

6)根据仪器使用说明进行测序。测序结果如图1和图2所示。

(5)结果判读

1)有效性判定：

本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为LTC4S(A-444C)、PEAR1(rs12041331)型。

2)结果判定标准

a.LTC4S(A-444C)的DNA测序峰值图中，

C的频率≧90％，A的频率≦10％，即为CC型；

40％≦C的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即为CA型；

A的频率≧90％，C的频率≦10％，即为AA型；

b.PEAR1(rs12041331)的DNA测序峰值图中，

A的频率≧90％，G的频率≦10％，即为PEAR1(rs12041331)AA型；

40％≦A的频率≦60％，40％≦G的频率≦60％，即为PEAR1(rs12041331)AG型；

G的频率≧90％，A的频率≦10％，即为PEAR1(rs12041331)GG型；

3、基因检测结果与代谢活性的相关性总结

通过检测结果可以判断样本源的代谢类型，从而进一步指导相应代谢途径的药物的用药剂量。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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