技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及SPINK5基因在制备食管鳞癌诊断和治疗药物中的应用。
背景技术
食管癌是常见的消化道肿瘤,全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一,根据我国国家癌症中心发布的2019年最新癌症报告数据显示,食管癌在我国恶性肿瘤死亡原因中排第四位。
根据病理类型,食管癌分为鳞癌和腺癌,食管鳞癌和腺癌虽然发生在同一器官,但是两者为完全不同的两种疾病,两者的流行病学也大有区别。发生地域上,腺癌为欧美国家的主流类型,占70-80%左右。而食管鳞癌(ESCC)在亚洲非洲国家更为多见,在我国,ESCC约占食管癌的90%左右。
目前食管癌的诊断和预后预测面临三大挑战:临床症状出现较晚,内镜检查的不舒适性和成本较高,生物标志物的不敏感和非特异性。因此,ESCC的诊断和预后迫切需要新的高灵敏度、高性价比的生物标志物。
发明内容
本发明的目的是提供SPINK5基因在制备食管鳞癌诊断和治疗药物中的应用。
本发明的目的是公开了一种人SPINK5基因及其表达产物的应用,用于制备食管鳞癌诊断及治疗的产品。本发明的SPINK5基因及其表达产物,可作为诊断食管鳞癌特异性标志基因,使食管鳞癌诊断更加准确、快速;本发明的SPINK5基因及其表达产物,还可作为制备治疗食管鳞癌的分子药物,提供新的食管鳞癌治疗途径。
附图说明
图1为高通量筛选及样本验证的结果。(A)为5对ESCC癌组织及对应癌旁组织差异基因的聚类热图;(B)为qRCR检测196例ESCC癌和癌旁组织中SPINK5的mRNA水平。
图2为SPINK5与淋巴转移及淋巴管密度的结果。(A)为免疫组化检测3对ESCC原发灶及淋巴结转移灶中SPINK5的表达;(B)为对ESCC病例的SPINK5表达量与临床病理特征进行统计学分析。
图3为SPINK5抑制淋巴管生成及淋巴内皮细胞迁移的结果。(A)为观察SPINK5过表达后对淋巴管生成及淋巴内皮细胞的影响;(B)为qPCR检测SPINK5过表达后VEGF-C的表达。
图4为TLR4通路抑制SPINK5表达的结果。(A-C)为不同的TLRs配体处理ESCC细胞:(A)qPCR检测SPINK5表达水平;(B)ELISA检测LEKTI浓度;(C)qPCR检测VEGF-C的表达水平。(D-F)为分别用LPS和LPS+肉桂醛处理ESCC细胞:(D)qPCR检测SPINK5表达水平;(E)ELISA检测LEKTI浓度;(F)ELISA检测VEGF-C的表达水平。
图5为SPINK5激活NF-κB信号通路的结果。(A)为NF-κB抑制剂BAY 11-7082处理后发现ESCC细胞,qPCR检测SPINK5表达水平。(B-C)为双荧光素酶报告基因技术提示SPINK5表达变化改变NF-κB启动子活性。
图6为SPINK5结合E3泛素连接酶STUB1介导TRAF6的泛素化降解的结果。(A)为Co-IP结果显示SPINK5可以结合TRAF6。(B)为qPCR结果显示敲低SPINK5不影响TRAF6的mRNA水平。(C)为Western blotting检测显示敲低SPINK5后TRAF6表达量下降。(D)为Westernblotting检测显示敲低STUB1后TRAF6表达量上调。(E)为Co-IP实验显示SPINK5可以结合TRAF6和STUB1。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件;所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
高通量筛选及样本验证确定SPINK5为研究对象
采用北京博奥生物有限公司的晶芯mRNA芯片,对5组ESCC癌和对应癌旁组织新鲜样本进行检测,结果提示有3600余个基因表达差异达2倍以上,其中低表达者1660个。对表达差异相对比较大的基因进行聚类分析。其中SPINK5基因在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁组织(差异倍数=41.22倍,P<0.01)(如图1A所示)。
进一步qPCR法检测196例原发性ESCC癌组织和其相应的癌旁组织的SPINK5 mRNA的表达水平。
引物:SPINK5-F:5’-ATAGCCACAGTGTCA GTGCTT-3’(SEQ ID NO.1)
SPINK5-R:5’-TGCCTGAAATTCATGGCACAT-3’(SEQ ID NO.2)。
结果显示:SPINK5 mRNA在其中148例(75.5%)癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,差异具有统计学意义(如图1B所示)。
实施例2
SPINK5与淋巴转移及淋巴管密度呈负相关:
相对于ESCC原发灶,淋巴结转移灶中SPINK5表达显著下降(n=3)(如图2A所示)。进一步对ESCC病例分析发现SPINK5低表达与ESCC淋巴结转移呈负相关,差异有统计学意义(如图2B所示)。
实施例3
SPINK5抑制淋巴管生成及淋巴内皮细胞迁移:
收集对照组及SPINK5稳定过表达组的ESCC细胞的条件性培养液孵育人淋巴管内皮细胞HLECs,发现过表达SPINK5有效抑制淋巴管生成及淋巴内皮细胞迁移(如图3A所示)。同时,过表达SPINK5后,VEGFC-C表达显著下降(如图3B所示)。
实施例4
TLR4通路抑制SPINK5表达,促进淋巴管生成:
用多种TLRs配体对ESCC细胞株进行处理。配体包括poly(I:C)(TLR3配体,10μg/ml)、LPS(TLR4配体,5ng/ml)、未甲基化的CpG DNA(TLR9配体,2μM)。对细胞及其培养液进行qRT-PCR和ELISA检测,结果发现LPS处理后SPINK5 mRNA及其编码的LEKTI蛋白的表达量显著降低,而VEGF-C表达显著增加(如图4A-C所示)。由于LPS为TLR4的天然配体,表明TLR4的激活能使SPINK5的表达下调。进一步,分别用LPS和LPS+肉桂醛(LPS抑制剂)处理ESCC细胞。结果发现,LPS+肉桂醛组阻断了LPS介导的SPINK5 mRNA和LEKTI表达量下降,同时VEGF-C表达增加(如图4D-F所示)。进一步说明TLR4的激活能下调SPINK5的表达。
实施例5
SPINK5激活NF-κB信号通路;
用NF-κB抑制剂BAY 11-7082处理后发现ESCC细胞中VEGF-C表达下降(如图5A所示)。双荧光素酶报告基因技术检测HEK293T细胞中SPINK5敲减和过表达后NF-κB启动子的活性。结果显示,SPINK5的表达下调使NF-κB启动子的活性增加;SPINK5过表达则使NF-κB启动子的活性降低(如图5B-C所示)。
实施例6
SPINK5结合E3泛素连接酶STUB1介导TRAF6的泛素化降解。
Co-IP结果显示SPINK5可以结合TRAF6(如图6A所示)。过表达SPINK5并不影响TRAF6的mRNA水平,但TRAF6的蛋白水平显著下调(如图6B、C所示)。STUB1敲低后,TRAF6表达显著上调(如图6D所示)。Co-IP结果显示SPINK5可以结合STUB1和TRAF6(如图6E所示)。
本发明证明SPINK5基因在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁组织,并且SPINK5过表达可以有效抑制淋巴管生成及淋巴内皮细胞迁移,因此SPINK5基因及其表达产物可作为诊断食管鳞癌的标志物和用于食管鳞癌治疗的药物靶点。
序列表
<110> 江阴市人民医院
<120> SPINK5基因在制备食管鳞癌诊断和治疗药物中的应用
<130> 20210507
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atagccacag tgtcagtgct t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcctgaaat tcatggcaca t 21
机译: 制备方法应用该方法,作者获得了具有有价值特性的Erengan系列不规则和卤素类固醇。拟议的获得式I = 2t L的pregan系列卤素15甾族化合物的方法•其中Z为两个脂族,芳族或芳脂族烃残基,或基团〜.C == Z-环烷基/ /和X是氟或氯原子,其原因在于在式II的化合物中存在'dH.FCHoF20,其中RI和Rj各自为游离或醚化的:1-或为氧基或R2的醚与R2-基团2530,其中R 1和R 2具有指示的值,环氧化物裂解的卤代基奥多洛达HX,其中X具有上述含义,或使用释放该高代基奥多洛德的试剂和所得的卤素-nd德林同时或通过用氢钾钾处理而顺次脱水。
机译: CCDC157基因及突变基因在诊断中的分子标志物在雄性不孕症诊断中的应用
机译: 一种新的多态性在高血压的HSGKI基因中的应用和SGK家族的基因在扩展Q / T综合征的诊断和治疗中的应用