一种测定噬菌体对抗生素敏感性的方法

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法。本发明评价方法建立了菌液OD600与菌量、菌液用量及噬菌体效价之间的关系，可保证菌液用量满足噬菌体效价的测定，评价结果稳定且可信度高，可用于指导养殖者选择适宜的噬菌体和适宜浓度的抗生素联用，进行科学养殖，进而有效地抑制养殖过程中病原菌的生长，大大降低了人力成本，显著提高了经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及生物分析检测技术领域，尤其涉及一种测定噬菌体对抗生素敏感性的方法。

背景技术

采用抗生素治疗细菌性疾病是公认的有效方式；但抗生素长期使用会打破肠道菌群平衡，破坏肠道屏障，进而影响动物免疫力，导致疾病难以控制。2015年华中农大刘建华教授和中国农大沈建忠教授联名发表关于硫酸粘杆菌耐药性的文章，证明了人类病原菌的耐药性与动物使用促生长抗生素有关。耐药菌可通过食物链从动物传递到人类，每年有超过2万人死于超级细菌，所以我国2016年开启了抗生素禁用之旅。

噬菌体可以感染并裂解相应的宿主菌，具有特异性强、自我增殖快、繁殖能力强等优点，且噬菌体会随着宿主的死亡而死亡，动物体内不会有残留，与抗生素相比更加的安全。近年来，噬菌体在畜禽群细菌性疾病的控制与治疗方面取得许多成果，越来越受到人们的关注。

巴氏噬菌体可用于治疗猪巴氏杆菌病，但实际养殖中，在利用巴氏噬菌体治疗猪巴氏杆菌病的同时存在使用抗生素的现象，故需要评估猪养殖过程抗生素是否会对噬菌体的杀菌效果产生影响，检测噬菌体效价在抗生素的干扰下会发生怎样的变化。

对于噬菌体效价的测定，现有技术多采用双层平板法，即先在培养皿中倒入底层固体培养基，待其凝固，倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。37℃培养一段时间后，统计噬菌斑的数量；或者是将一定体积的菌液与培养基混合后倒在底层固体培养基上，制备双层平板，待其凝固后，滴加2-5μL噬菌体，37℃培养一定时间后统计噬菌斑的数量。如肖迨等(2017)采用双层平板法检测噬菌体JDOO7的效价，但无法保证金黄色葡萄球菌液在平板表面是均匀涂布的，会造成计数误差；钟文诗等(2020)在进行驴源噬菌体效价测定时，铺双层平板时菌液用量仅100μL，且不同批次菌液浓度有异，若定量实验用菌液体积，会造成重复性实验之间较大的误差。双层平板法有以下不足之处：第一，噬菌体活性易受影响。已有实验证明，温度对噬菌体的效价影响较大。在制备双层平板时，将噬菌体与菌液混匀后加入55℃半固体培养基中使其凝固，但此时对于温度的把控难度较大，偏高，易影响噬菌体活性，偏低，会导致培养基结块，细菌与噬菌体分布不均匀；第二，菌液的用量不统一；多数实验会直接加入一定量菌液，比如100μL，但这种操作实验重复性较差；也有以MOI比值为参照加液，但每次实验均要检测细菌和噬菌体的MOI值，实验周期长，操作复杂；第三，噬菌体用量不合理；问题除同第二点所述外，大多还需要对噬菌体进行稀释梯度，梯度设置不合理会造成以下两种情况：噬菌斑较多，连在一起无法计数；或噬菌斑较少，计数差异大。因此，提供一种准确可靠的评估抗生素对噬菌体杀菌效果影响的方法用于指导养殖户安全养殖，有效提高养殖业的经济效益具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法。本发明提供的方法可准确测定噬菌体对抗生素敏感性，可用于指导养殖户安全养殖，提高养殖业的经济效益。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法，包括：

1、一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法，其特征在于，包括：

步骤1：将噬菌体接种至含抗生素的生理盐水中，培养0～72h，分别取0h、24h、48h、72h的培养液，得待测样液；

步骤2：将噬菌体接种至不加抗生素的生理盐水中，培养0～72h，分别取0h、24h、48h、72h的培养液，得对照样液；

步骤3：按照步骤(1)～(3)测定待测样液和对照样液中噬菌体的效价，比较同一培养时间下待测样液和对照样液的噬菌体效价，判定噬菌体对所述抗生素的敏感性高低：

(1)向玻璃平板中加入第一培养基，凝固，得下层平板；

(2)将病原菌接种至第二培养基中，培养至OD

(3)取待测样液和对照样液，分别稀释，取稀释液分别按照双层平板法测定噬菌体的效价；

所述步骤(2)中，病原菌培养液的加入量V以μL计，每8ml第三培养基中所述病原菌培养液的加入量V由以下公式计算得到：

560＝病原菌菌液OD

一些实施方案中，所述待测样液中，噬菌体浓度为7～15亿PFU/ml。

一些实施方案中，步骤1中，所述培养为37℃、100～140rpm恒温振荡培养。一些实施方案中，所述病原菌为巴氏杆菌；所述抗生素为硫酸庆大霉素、恩诺沙星、阿莫西林中的至少一种。

一些具体实施例中，所述待测样液中硫酸庆大霉素的浓度为12mg/ml；所述待测样液中恩诺沙星的浓度为30mg/ml；所述待测样液中阿莫西林的体积百分含量为0.75％。

本发明中，所述第一培养基和第三培养基均以液态形式加入。在本发明具体实施中，加入时培养基的温度优选为50℃左右。

一些实施方案中，步骤(2)中，所述第一培养基与第三培养基的体积比优选为20:8。

一些实施例方案中，所述第一培养基为TSA培养基；所述第二培养基为5％(v/v)马血清的TSB培养基；所述第三培养基为TSA+TSB培养基。

一些具体实施例中，所述第三培养基中，TSA培养基与TSB培养基的质量比为25：15。

一些实施方案中，步骤(3)中，所述稀释倍数为10

一些实施方案中，所述双层平板法具体为：在双层平板背面画九宫格，在每小格右下角标选定的注稀释倍数，每个梯度设置两个重复；取各梯度稀释样液加入对应小格内，超净台内晾干；将晾干的平板倒置放在37℃恒温培养箱内静置培养8～10h；选取可清晰计数空斑的梯度方格统计噬菌斑个数，获得噬菌体的效价。

一些具体实施例中，步骤3中，比较72h待测样液和对照样液的噬菌体效价，判定噬菌体对所述抗生素的敏感性高低。

本发明中，所述判定方法为：若相同培养时间下待测样液和对照样液的噬菌体效价存在数量级差异，则判定该噬菌体对该抗生素敏感性较高；反之，则判定所述噬菌体对所述抗生素不敏感。

本发明噬菌体对抗生素敏感性的评价方法经申请人多年研究、优化获得，评价结果稳定且可信度高；实验结果用于指导养殖者选择适宜的噬菌体和适宜浓度的抗生素进行联用，进行科学养殖；该方法用于指导养殖者养殖猪、牛、羊等牲畜已有多年，可有效地突出噬菌体在畜牧养殖过程中抑制病原菌的生长、大大降低人力成本且在一定范围内不受抗生素影响的特点，显著提高了经济效益。本发明评价方法至少还具有具有如下有益效果之一：

(1)噬菌体将在双层平板凝固后滴加，保证噬菌体活性不受温度影响；

(2)建立菌液OD

(3)建立菌液OD600与菌量、菌液用量及噬菌体效价之间的关系，可保证噬菌体效价检测更加合理，使实验结果稳定，减小差异；

(4)可实现同一平板四个样品稀释液梯度点样，且每个梯度两个重复，保证空斑计数的可信度及重复性；

(5)可丰富噬菌体对抗生素敏感性测定方面的经验；

具体实施方式

本发明提供了一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

术语解释：

抗生素(antibiotic)：由某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制/杀死另一些微生物的物质或人工合成的类似物；

噬菌体(phage)：是寄生于细菌、支原体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等的一类病毒，亦称细菌病毒。在自然界分布极广，凡是有上述各类微生物的地方，都有相应种类噬菌体的存在；

噬菌斑(plaque)：噬菌体侵染细胞，导致宿主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑，或称负菌落；

巴氏杆菌病(pasteurellosis):由多杀性巴氏杆菌引起的以出血性败血症或传染性肺炎为主要症状的动物传染病；

效价(titr etiter)：指每毫升试样中所含侵染性噬菌体的粒子数，即噬菌斑形成单位数。

双层平板法(two layer plating method)：双层平板法，先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。

本发明噬菌体对抗生素敏感性的评价方法，包括：

步骤1：将噬菌体接种至含抗生素的生理盐水中，37℃、140rpm恒温振荡培养0～72h，分别取0h、24h、48h、72h的培养液，制得待测样液；

步骤2：将噬菌体接种至不加抗生素的生理盐水中，制得对照样液；

步骤3：按照步骤(1)～(3)测定待测样液和对照样液中噬菌体的效价，比较同一培养时间下待测样液和对照样液的噬菌体效价，判定噬菌体对所述抗生素的敏感性高低：

(1)向玻璃平板中倒入20ml TSA培养基，凝固，得下层平板；

(2)将病原菌接种至第二培养基中，培养至OD

(3)取待测样液和对照样液，分别稀释，取稀释液分别按照双层平板法测定噬菌体的效价；

所述步骤(2)中，病原菌培养液的加入量V以μL计，每8ml第三培养基中所述病原菌培养液的加入量V由以下公式计算得到：

560＝病原菌菌液OD

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(1)巴氏杆菌A种子液培养

①向100mL含5％马血清的TSB培养基中接入0.3～0.7mL巴氏A甘油菌，置于37℃恒温培养箱中振荡孵育12～14h；

②检测菌液OD

③取适量菌液进行革兰氏染色后镜检，确保菌液无污染及巴氏杆菌形态正常；

④根据公式：560＝菌液OD

该公式是公司研究人员通过多次试验探索发现，当菌液OD

(2)实验体系构建

①取4只无菌的250mL锥形瓶，分别加入90mL(pH＝7.0～7.2)0.9％无菌生理盐水，编号1、2、3、4；

②本次选取的抗生素是生产常用的硫酸庆大霉素(齐鲁安欣，可溶性粉)、恩诺沙星(齐鲁安欣，注射液)和阿莫西林(华北制药，可溶性粉)。根据养猪生产实际，硫酸庆大霉素的用量为1～4g/头份，恩诺沙星的用量为0.8～2.5mL/头份，阿莫西林的用量为1.5～4g/头份；故本实验三种抗生素的用量分别为：硫酸庆大霉素1.2g，恩诺沙星0.75mL，阿莫西林3.0g；

在超净台内分别依次称取硫酸庆大霉素、恩诺沙星、阿莫西林如上所述用量，分别加入编号2、3、4的生理盐水中，轻轻摇匀，使抗生素完全且均匀的溶于生理盐水；对照组为1，生理盐水内不加抗生素；

③依次向1、2、3、4瓶内加入10mL巴氏A噬菌体种毒，轻轻摇匀；该噬菌体效价为70～150亿PFU/mL)，故本实验中每组噬菌体的用量均为700～1500亿PFU；

④用耐高温组培封口膜(比克曼生物，16×16cm)和橡皮筋将瓶口密封；

⑤将锥形瓶放入恒温摇床内37℃，140rpm振荡培养；

⑥分别在0h、24h、48h、72h用10mL离心管量取5mL检测样液中噬菌体效价；

(3)双层平板制备

①配置TSA(Tryptone Soya Agar)培养基：称量30g TSA，溶于1000mL纯水中，115℃高压蒸汽灭菌20min；

②配置TSA+TSB培养基：向1000mL纯水中分别加入25g TSA和15g TSB，充分溶解后115℃高压蒸汽灭菌20min；

③玻璃平板中倒入约20mL TSA培养基，待其凝固即可得下层平板；

④用10mL离心管量取8mLTSA+TSB培养基，待其温度降至50℃左右时(可用手腕处肌肤感受温度，温热即可)备用；

⑤根据菌液OD

⑥向⑤中培养基内加入等体积的(466.7μL)马血清，上下颠倒混匀；

⑦迅速均匀倒在③中下层平板上，待其凝固，即可得双层平板；

(4)稀释样液

①在设定的时间节点从1、2、3、4中各取5mL样液；

②取100μL样液加入900μL 0.9％生理盐水(pH＝7.0～7.2)中，涡旋30S混匀即可获得10

③照此依次稀释得到10

④在双层平板背面画九宫格，然后在每小格右下角标选定的注稀释倍数，每个梯度两个重复；

⑤取10μL各梯度稀释样液加入对应小格内，超净台内晾干；

⑥将晾干的平板倒置放在37℃恒温培养箱内静置培养8～10h；

⑦选取可清晰计数空斑的梯度方格统计噬菌斑个数，以此来显示噬菌体效价；

通过对比各时间段噬菌体的效价，以此获得在抗生素作用下，噬菌体受影响的程度。结果见表1。

表1

由表1结果可知，噬菌体在37℃无病原存在条件下不会增殖，会自然衰亡，72h降低一个数量级。温度对噬菌体存活影响较大；试验的三种抗生素(硫酸庆大霉素、恩诺沙星(液体)、阿莫西林)对巴氏噬菌体均有一定影响，但与对照组相比，影响不显著，未造成数量级影响，按照本发明判定方法可判定试验所用的噬菌体对以上三种浓度的抗生素不敏感性，因此，可将该噬菌体与以上三种浓度的抗生素联合用于牲畜养殖中。其中，所述噬菌体对以上三种抗生素的敏感性：恩诺沙星>阿莫西林>硫酸庆大霉素。

本发明噬菌体对抗生素敏感性的评价方法经申请人多年研究、优化获得，评价结果稳定且可信度高，用于指导养殖者选择适宜的噬菌体和适宜浓度的抗生素进行联用，进行科学养殖，该方法用于指导养殖者养殖猪、牛、羊等牲畜已有多年，可有效地抑制养殖过程中病原菌的生长，大大降低人力成本，显著提高了经济效益。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。