一种自预染荧光蛋白Marker制备方法

摘要

本发明涉及生物工程技术领域，尤其为一种自预染荧光蛋白Marker制备方法，其方法包括如下步骤：制备亚基混合物：将1毫克发光蛋白沉淀置于离心管中，4℃条件下高速离心5分钟，得到上清液和沉淀物，用移液枪完全吸走上清液，仅保留沉淀部分。本发明的荧光蛋白Marker是将天然提取的荧光蛋白，其分子量为20‑300kDa，与能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG和能被二抗结合的抗体Fc区蛋白或肽共价偶联，由于荧光蛋白自带颜色，从而实现蛋白即是预染蛋白，又是荧光蛋白的目的，无需转膜染色或X光片成像，使电泳更为简单，由于荧光信号非常强，即使微量的蛋白，也能实现电泳检测，得到理想的电泳图。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种自预染荧光蛋白Marker制备 方法。

背景技术

蛋白质marker作为一种蛋白质分子量大小的标准被广泛应用于蛋白质电 泳中。它是由已知的不同分子量大小的蛋白或多肽组成的混合物。

现有的蛋白Marker研发经历了普通Marker、预染Marker、曝光Marker 和荧光蛋白Marker四个个发展阶段。其中，普通蛋白Marker由于没有附带 染料分子或者是标记分子，所示分子量大小正好是蛋白原本的大小，在早期 可精确判断蛋白大小。但因为电泳过程中完全看不到普通Marker，要和目标 蛋白一起最后染色才能看见，无法对实验过程起预示参照作用。

预染Marker是将普通蛋白marker中的每个蛋白(或多肽)经过化学修饰， 与一种蓝色或其他颜色的染料共价偶联而成。预染蛋白marker的出现给 Western Blot带来了极大便利，研究者在转膜后，可根据膜上蓝色(或其他颜 色)蛋白marker的大小来确定目的条带的大概位置，从而对膜进行剪切等处 理。

曝光Marker是将将发光蛋白marker与预染蛋白marker按不同的比例混 合，可特异性结合一抗或者二抗，使得最终的Marker条带会和检测目标蛋白 会一同出现在显色的图片中，避免将照片和膜进行比对时出现偏差，其制备 过程变得繁琐。可曝光预染蛋白marker是将融合蛋白与活性染料雷玛素 (remazol)共价偶联，从而实现同一蛋白即是发光蛋白，又是预染蛋白的目的， 可结合来源于人、大鼠、小鼠、兔等物种的IgG或抗兔和小鼠的二抗，在电 泳过程中和转膜后指示蛋白的大致位置，而且能在X胶片上指示蛋白的位置。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自预染荧光蛋白Marker制备方法，扩大了荧 光蛋白的应用领域，能够实现蛋白即是预染蛋白，又是荧光蛋白，且无需转 膜染色或X光片成像，使电泳更为简单，其荧光信号非常强，即使微量的蛋 白，也能实现电泳检测，得到理想电泳图的优点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种自预染荧光蛋白Marker 制备方法，其方法包括如下步骤：

步骤一、制备亚基混合物：

1.1、将1毫克发光蛋白沉淀置于离心管中，4℃条件下高速离心5分钟， 得到上清液和沉淀物，用移液枪完全吸走上清液，仅保留沉淀部分；

1.2、向沉淀部分中添加200微升缓冲液充分进行溶解，然后在4℃条件 下高速离心10分钟后，去除沉淀，得到上清溶液；

1.3、将上清溶液用快速脱盐柱或透析袋脱去盐和保护剂，将脱盐后的发 光蛋白溶液中加入二硫苏糖醇(DTT)，得到终浓度为20-50微摩尔/升的混 合物，然后常温反应90分钟后，得到亚基混合物；

步骤二、制备衍生化的融合蛋白：

2.1、将1毫克融合蛋白溶解于200微升0.1M PBS(PH7.2-7.4)缓冲溶 液中，配制成5毫克/毫升的溶液；

2.2、将双功能试剂溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升 的母液，每毫克的融合蛋白添加20微升的SMCC，铝箔封好后于室温旋转反 应60分钟，使融合蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的融合蛋 白；

2.3交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的融合蛋白过柱，收集融合蛋 白峰，并调节浓度；

步骤三、交联制备：

3.1将亚基混合物逐滴加入到衍生化的融合蛋白中，边加边用混匀器轻轻 混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟(或4℃过夜)，即可实现共价 交联而得到自预染荧光蛋白Marker制品。

优选的，所述步骤一的1.1中，发光蛋白包括藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白其中的一种。

优选的，所述步骤一的1.3中，亚基混合物还可以使用脱盐柱或透析袋 去除混合溶液中多余的DTT后备用。

优选的，所述步骤二的2.2中，双功能试剂包括琥珀酰亚胺-4-(N-甲基 马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯(SMCC)。

优选的，所述步骤三的3.1中，在混匀器轻轻混匀后，还可以通过铝箔 封好后在4℃下过夜，实现共价交联得到自预染荧光蛋白Marker制品。

优选的，所述步骤二包括融合蛋白的巯基化:

预制：将1毫克proteinAGL融合蛋白溶解于200微升0.1M PBS (PH7.2-7.4)缓冲溶液中，配制成5毫克/毫升的溶液，得到融合蛋白纯品， 具体的包括以下步骤：

A、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于无水二甲 基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升的母液；

B、取融合蛋白纯品，浓度调整到5毫克/毫升以上为宜，按照每毫克融 合蛋白加入SPDP溶液，轻轻混匀，在室温下搅拌反应0.5-1.5小时。用离心 式脱盐柱，去除多余SPDP，收集液为SPDP-融合蛋白；

C、三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶于0.1MPBS(pH值7.4，0.1M NaCl)，配 成2毫克/毫升的溶液。按每毫克的SPDP-融合蛋白加入20微升的TCEP溶液， 轻轻混匀，在室温下反应10-15分钟；

D、上PD-10柱分离出巯基化的，并调节浓度至3mg/ml。

优选的，所述融合蛋白纯品纯度大于90％。

优选的，所述SPDP溶液包括不少于15μl。

优选的，所述步骤三的3.1还包括将活化的融合蛋白逐滴加入到巯基化 的融合蛋白中，边加边用混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120 分钟(或4℃过夜)，使巯基与马来酰亚胺基实现共价交联而得到自预染荧 光蛋白Marker制品。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的荧光蛋白Marker是将天然提取的荧光蛋白，其分子量为 20-300kDa，与能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG和能被二抗结合的 抗体Fc区蛋白或肽共价偶联，由于荧光蛋白自带颜色，从而实现蛋白即是预 染蛋白，又是荧光蛋白的目的，无需转膜染色或X光片成像，使电泳更为简 单，由于荧光信号非常强，即使微量的蛋白，也能实现电泳检测，得到理想 的电泳图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：荧光藻红蛋白(Phycoerythrin)亚基与proteinA共价偶联制 备自预染荧光蛋白Marker

需要说明的是，藻红蛋白是从红藻中分离纯化的，能发出强烈的荧光， 分子结构为通过硫醚键连接的载体蛋白与开链线性延展的四咯化合物。分子 量:约240,000道尔顿,蛋白的亚基组成为(alpha-beta)6gamma。每个 alpha-亚基和beta-亚基约20,000道尔顿，每个gamma亚基约30,000道 尔顿。

步骤一、制备藻红蛋白α、β、γ亚基的混合物：

1.1、将1毫克藻红蛋白沉淀置于离心管中，4℃条件下高速离心5分钟， 用移液枪小心的完全吸走上清液，仅保留沉淀部分；

1.2、向沉淀用200微升缓冲液充分溶解，4℃条件下高速离心10分钟后， 去除沉淀，得到上清溶液；

1.3、将上清橙红色溶液用快速脱盐柱或透析袋脱去盐和保护剂，然后在 脱盐后的藻红蛋白容易中加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为20-50微摩 尔/升的混合物，常温反应90分钟后，得到溶液为藻红蛋白α、β、γ亚基 的混合物，并用脱盐柱或透析袋去除混合溶液中多余的DTT后备用。

步骤二、制备衍生化的金黄色葡萄球菌免疫球蛋白G结合蛋白 A(proteinA)：

2.1、将1毫克proteinA溶解于200微升0.1M PBS(PH7.2-7.4)缓冲溶 液中，配制成5毫克/毫升的溶液。

2.2、将双功能试剂琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸 酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升的母液，每毫 克的proteinA添加20微升的SMCC，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟， 使proteinA蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的proteinA蛋白。

2.3、交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的proteinA蛋白过柱，收 集proteinA蛋白峰，并调节浓度至5mg/ml。

步骤三、自预染荧光蛋白Marker的交联制备：

3.1、将藻红蛋白α、β、γ亚基的混合物逐滴加入到琥珀酰亚胺-4-(N- 甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的proteinA蛋白中，边加 边用混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟(或4℃过夜)， 使藻红蛋白α、β、γ亚基分子上的巯基与马来酰亚胺基实现共价交联而得 到自预染荧光蛋白Marker制品。

实施例二：荧光藻蓝蛋白(Phycocyanin)亚基与proteinAG共价偶联制备 自预染荧光蛋白Marker

需要说明的是，藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离纯化的，能发出强烈的荧光， 分子结构为通过硫醚键连接的载体蛋白与开链线性延展的四咯化合物。分子 量为260,000道尔顿，蛋白的亚基组成为(alpha-beta)6，每个alpha-亚基 和beta-亚基约20,000道尔顿。

步骤一、制备巯基化藻蓝蛋白α、β亚基的混合物：

1.1、将1毫克藻蓝蛋白沉淀置于离心管中，4℃条件下高速离心5分钟， 用移液枪小心的完全吸走上清液，仅保留沉淀部分；

1.2、向沉淀用200微升缓冲液充分溶解，4℃条件下高速离心10分钟后， 去除沉淀，得到上清溶液；

1.3、上清蓝色溶液用快速脱盐柱或透析袋脱去盐和保护剂。然后在脱盐 后的藻蓝蛋白容易中加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为20-50微摩尔/ 升的混合物，常温反应90分钟后，使大分子藻蓝蛋白溶液分解为藻蓝蛋白α、 β亚基组成的混合物，用脱盐柱或透析袋去除混合溶液中多余的DTT后备用。

步骤二、制备衍生化的融合蛋白AG(proteinAG)：

2.1、将1毫克proteinAG融合蛋白溶解于200微升0.1M PBS(PH7.2-7.4) 缓冲溶液中，配制成5毫克/毫升的溶液。

2.2、将双功能试剂琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸 酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升的母液，每毫 克的proteinAG添加20微升的SMCC，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟， 使proteinAG蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的proteinAG蛋 白。

2.3、交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的proteinAG蛋白过柱，收 集proteinAG蛋白峰。

步骤三、自预染荧光蛋白Marker的交联制备：

3.1、将藻蓝蛋白α、β亚基的混合物逐滴加入到琥珀酰亚胺-4-(N-甲基 马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的proteinAG蛋白中，边加边用 混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟(或4℃过夜)，使 藻蓝蛋白α、β亚基分子上的巯基与马来酰亚胺基实现共价交联而得到自预 染荧光蛋白Marker制品。

实施例三：荧光别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)与proteinAGL共价偶 联制备自预染荧光蛋白Marker

需要说明的是，别藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离纯化的，能发出强烈的荧 光，分子结构为通过硫醚键连接的载体蛋白与开链线性延展的四咯化合物。 分子量为104,000道尔顿，蛋白的亚基组成为(alpha-beta)3，每个alpha- 亚基和beta-亚基约17,000道尔顿。

步骤二、制备衍生化的荧光别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)蛋白分子：

2.1、将1毫克proteinAGL融合蛋白溶解于200微升0.1M PBS(PH7.2-7.4) 缓冲溶液中，配制成5毫克/毫升的溶液。

2.2、将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶 解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成5毫克/毫升的母液。按每毫克的别藻蓝 蛋白添加9微升的SMCC，铝箔封好后将反应混合物在室温下搅拌温浴30分钟 或在4℃搅拌反应2小时，使别藻蓝蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成 衍生化的别藻蓝蛋白。

2.3、交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的别藻蓝蛋白过柱，收集别 藻蓝蛋白峰，并调节浓度至5mg/ml。

融合蛋白AGL(proteinAGL)的巯基化：

预制：将1毫克proteinAGL融合蛋白溶解于200微升0.1M PBS (PH7.2-7.4)缓冲溶液中，配制成5毫克/毫升的溶液，得到融合蛋白纯品， 具体的包括以下步骤：

A、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于无水二甲 基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升的母液。

B、取proteinAGL纯品(纯度>90％)，浓度调整到5毫克/毫升以上为宜， 按照每毫克proteinAGL加入15μl SPDP溶液，轻轻混匀，在室温下搅拌反 应0.5-1.5小时。用离心式脱盐柱，去除多余SPDP，收集液为 SPDP-proteinAGL。

C、三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶于0.1MPBS(pH值7.4，0.1M NaCl)，配 成2毫克/毫升的溶液。按每毫克的SPDP-proteinAGL加入20微升的TCEP溶 液，轻轻混匀，在室温下反应10-15分钟。

D、上PD-10柱分离出巯基化的，并调节浓度至3mg/ml。

步骤三、自预染荧光蛋白Marker的交联制备：

3.1、将活化的别藻蓝蛋白混合物逐滴加入到巯基化的proteinAGL蛋白 中，边加边用混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟(或4℃ 过夜)，使巯基与马来酰亚胺基实现共价交联而得到自预染荧光蛋白Marker 制品。

实施例四：表达荧光蛋白：绿色荧光蛋白(GFP)(或黄色荧光蛋白(YFP)、 或红色荧光蛋白(RFP)等)与proteinG-抗体Fc区融合蛋白共价偶联制备自 预染荧光蛋白Marker；

需要说明的是绿色萤光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)， 是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发 出绿色萤光。

绿色萤光蛋白(GFP)的巯基化

预制：将1毫克绿色萤光蛋白(GFP)溶解于200微升0.1M PBS(PH7.2-7.4) 缓冲溶液中，配制成5毫克/毫升的溶液，得到融合蛋白纯品，具体的包括以 下步骤：

A)、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于无水二 甲基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升的母液。

B)、按照每毫克绿色萤光蛋白(GFP)加入20μl SPDP溶液，轻轻混匀， 在室温下搅拌反应0.5-1.5小时，用离心式脱盐柱，去除多余SPDP，收集液 为SPDP-GFP。

C)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶于0.1MPBS(pH值7.4，0.1M NaCl)， 配成2毫克/毫升的溶液。按每毫克的SPDP-GFP加入20微升的TCEP溶液， 轻轻混匀，在室温下反应10-15分钟。

D)、上PD-10柱分离出巯基化的GFP，并调节浓度至5mg/ml。

步骤二、制备衍生化的融合蛋白proteinG-Fc：

2.1、将1毫克融合蛋白溶解于200微升0.1M PBS(PH7.2-7.4)缓冲溶 液中，配制成5毫克/毫升的溶液。

2.2、将双功能试剂琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸 酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成50毫克/毫升的母液，每毫 克的融合蛋白添加20微升的SMCC，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟， 使融合蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的融合蛋白。

2.3、交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的融合蛋白过柱，收集融合 蛋白峰，并调节浓度至5mg/ml。

步骤三、自预染荧光蛋白Marker的交联制备：

3.1、将活化的融合蛋白逐滴加入到巯基化的绿色萤光蛋白(GFP)蛋白中， 边加边用混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟(或4℃过 夜)，使巯基与马来酰亚胺基实现共价交联而得到自预染荧光蛋白Marker制 品。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来 将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示 这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。