一种利用干式恒温器高效生产蛋白质预染marker的新方法

摘要

蛋白质印迹法是利用蛋白质与其相对应的抗体发生特异相互作用来研究蛋白质、抗原、抗体等的一种重要技术，被广泛运用于生物化学、微生物学、免疫学、分子生物学生物医学等领域。在蛋白印迹法技术中，由于不能从聚丙烯酰氨凝胶中直接感知蛋白分子所在的准确位置给研究者增加了很大的困难，预染蛋白质marker的运用能有效解决这一难题。 在碱性条件下，蛋白质亲核性基团能与活性染料的活性基团发生亲核加成反应或者亲核取代反应，从而使蛋白质染色；于是肉眼不可见的蛋白质就呈现出色彩鲜明的颜色，人们就能直观感知蛋白质的存在。由数条不同大小的标准分子量的预染蛋白质条带组成的预染蛋白质marker，有指示不同蛋白质分子量的作用。因此，预染蛋白质marker被广泛运用于蛋白质印迹法中去帮助研究者确定目的蛋白质所在的位置，估算未知蛋白的大小，甚至还能对实验进行监控等。 在本研究中，我们通过对比水浴、微波、干式恒温器三种不同加热方式对活性染料与蛋白质反应产生的影响，确定了一种利用干式恒温器作为促进蛋白质和活性染料反应的工具的新方法。 我们通过将干式恒温器的温度从75℃升高到95℃去研究温度对活性染料与蛋白质反应产生的影响，得出较95℃更能提高反应效率；而且利用从pH7.95到pH11.92的一系列pH梯度去研究pH对于反应产生的影响，得出pH10.38最有利用反应的进行，pH再高便会导致蛋白质发生降解，最后，通过调整反应时间来使反应达到最佳的条件。在最佳的条件下，我们将生产彩色预染蛋白质marker所需的时间从至少4小时降低到35分钟，大幅降解反应时间，提高了反应效率；而且反应的效果还得到了改善。 为了确保蛋白质完全反应，过量活性染料被添加在反应体系中，但过量活性染料会与预染色蛋白质marker条带发生混淆，特别是当活性染料分子大小与预染蛋白质条带分子大小比较接近时。为了将过量的活性染除去，人们利用脱盐、丙酮沉淀、尺寸排阻色谱、离心过滤等方法将预染蛋白质与多余的活性染料分开，但是这些方法或多或少存在一定的缺陷。凝胶切胶回收技术是一种能选择性将凝胶中的目标蛋白质、目标核酸进行回收的技术，经过该技术回收到的蛋白质和核酸具有单一性。蛋白质与活性染料反应后便带有颜色，故能利用凝胶切胶回收技术将凝胶中预染蛋白质的目标条带进行回收，这不仅能将多余的活性染料完全除去还能将预染蛋白质条带中的杂带完全除去。通过联合蛋白质切胶回收技术、脱盐技术、真空冻干技术，一种用于除掉多余的活性染料和蛋白质杂带对的可靠方法就能用来对预染蛋白质进行纯化以到达预染蛋白质都是凝实的和单一的目的。 为满足指示不同大小蛋白质的需求，我们选择了七种不同大小的蛋白质来与不同颜色活性染料反应；在对它们进行纯化后，调节七种不同大小的预染蛋白质的浓度并将它们混合，这样具有一系列分子梯度且带有不同的颜色的彩色预染蛋白质marker就能形成。最后，将七种不同大小的预染蛋白质和它们的混合物转移到PVDF膜上，这些条带在PVDF膜上仍然保持完美的效果。

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摘 要

Abstract

1.1.活性染料

1.1.1活性染料的产生

1.1.2.染料分子与颜色的关系

1.1.3.活性染料及其分类

1.2 活性染料与蛋白质反应的原理

1.2.1.亲核取代反应

1.2.2.亲核加成反应

1.3 活性染料与蛋白质反应

1.4 不同加热方式对比选择

1.4.2.干式恒温器

1.5 蛋白回收方法

1.5.1沉淀法

1.5.2透析法

1.5.3脱盐法

1.5.4离心过虑法

1.5.5变性聚丙烯酰氨凝胶切胶回收法

2.引言

3.材料与方法

3.1 实验材料和仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂及仪器

3.2 有关试剂的配制

3.2.1. 蛋白质表达和纯化相关溶液的配制

3.2.2 蛋白质电泳相关试剂

3.2.3.蛋白质与活性染料反应的相关溶液配制

3.3 实验方法

3.3.1测试两种加热工具对BSA与RBBR反应的影响

3.3.2.反应缓冲液的选择和pH梯度研究

3.3.3.干式恒温器温度对BR缓冲液反应的影响

3.3.4.最佳反应条件的确定

3.3.5.不同的活性染料与多种蛋白质反应

4.结果与分析

4.1微波加热与干式恒温器对反应的影响

4.2较高的pH值对反应较好，随着温度的升高，所需时间显着减少

4.3最佳反应条件的确定

4.4用不同活性染料对多种蛋白质进行染色及预染蛋白的纯化

4.5多条彩色预染色蛋白质梯度生成和转移到PVDF膜上

5.结论和讨论

6.Acknowledgments

补充数据:用于生产预染蛋白质的蛋白质纯化

致谢

在读期间发表的论文