本申请要求于2018年7月6日提交的美国临时申请第62/694,829号的权益和优先权，所述美国临时申请的主题通过引用并入本文。
技术领域
所描述的实施例涉及用于对组织样品内的细胞的数字图像进行定量组织形态学分析以确定可行的移植组织候选者的定量方法。
背景技术
通过参考同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品的制备可以理解本发明，但本发明的公开内容和权利要求书并不限于本发明的这种实施例。
已显示同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品可用于治疗由先天性无胸腺症引起的T细胞免疫缺陷(原发性免疫缺陷)，例如用于治疗与22q11.2缺失相关联的完全迪乔治异常(complete DiGeorge Anomaly，cDGA)和与chd7(染色体域-解旋酶-DNA结合蛋白7)基因突变相关联的CHARGE(眼组织缺损、心脏缺陷、胆道闭锁、生长或智力低下、生殖器发育不全和耳朵异常或耳聋)综合征以及用于治疗缺乏叉头盒蛋白N1(FOXN1)的无胸腺症患者。先天性无胸腺症是一种罕见的致命疾病，目前尚无利用经监管批准的药品进行的药物治疗选择。
保留胸腺上皮细胞(TEC)的同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品的实验性移植已成功用于治疗患先天性无胸腺症的儿科患者(Markert ML、Devlin BH、McCarthyEA,2010,“胸腺移植(Thymus transplantation)”《临床免疫学(Clin Immunol.)》,135(2):236-46；Markert ML等人,2004,“具有免疫抑制的出生后胸腺移植用于治疗迪乔治综合征(Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment forDiGeorge syndrome)”《血液学(Blood)》104(8):2574-2581；Markert ML等人,1999,“完全迪乔治综合征中的胸腺组织移植(Transplantation of thymus tissue in completeDiGeorge syndrome)”《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》341(16):1180-1189 27)。
同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品是组织工程化产品，其被制备、培养和储存长达21天以产生部分T细胞耗竭的胸腺组织切片，并且通过预处理过程与天然胸腺相区别。预处理方案从经培养的胸腺组织切片中部分耗尽供体胸腺细胞。根据体外数据(免疫组织化学)，如使用细胞角蛋白抗体所评估的，介于12天与21天之间的培养时间段可以保留上皮网络。优选在37℃下在5％CO
培养过程以以下方式显著改变了供体胸腺组织和其中包含的组成细胞的生物学特性，以优化同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品切片的有效治疗特性。培养过程确保以适合于通过外科手术植入受试者体内的方式获得具有先决生物学特征的培养细胞/组织的确定组成，以使其能够重建受试者的免疫系统。培养过程导致胸腺细胞的损失以及供体胸腺组织切片中胸腺上皮细胞和其它基质细胞的相对富集。培养过程进一步导致胸腺细胞耗竭并维持TEC，以使受体的免疫系统重建，并使受体对供体胸腺中的HLA抗原产生耐受性。总的来说，制造过程被设计成从供体胸腺组织中耗尽胸腺细胞并保留胸腺基质(胸腺上皮细胞和成纤维细胞)的功能结构。
在无胸腺症患者中通过外科手术植入同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品(例如，“RVT-802”)会导致一系列事件，从而导致功能性免疫系统的发展。将同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品通过外科手术放置在受体中后，通过供体TEC和受体树突状细胞(DC)对T细胞进行教育。供体TEC与受体DC结合，使得能够耐受作为经培养的胸腺组织切片而被植入的植入的供体胸腺组织。这与正常胸腺中的耐受性诱导相同。受体TEC与受体DC结合导致对自身的耐受性。
通过同种异体移植物活检和外围存在受体原初T细胞已经证实了胸腺生成(thymopoiesis)(Markert ML,2010；Markert ML等人,2008,“使用同种异体移植物活检评估胸腺移植后的胸腺生成(Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis afterthymus transplantation)”《免疫学杂志》180(9):6354-6364；Markert ML等人,2007,“对54名患有完全迪乔治异常的患者进行的胸腺移植方案的回顾：44次连续移植的结果(Review of 54patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocolsfor thymus transplantation:outcome of 44consecutive transplants)”《血液学》109(10):4539-454728)，所述文献通过引用并入本文。
对接受研究性同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品治疗的儿童的研究显示，混合淋巴细胞反应可耐受供体主要组织相容性复合物(MHC)(Chinn IK、Devlin BH、Li YJ和Markert ML,2008,“完全迪乔治异常中对同种异体胸腺移植物的长期耐受性(Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorgeanomaly)”《临床免疫学》126(3):277-281)。此外，在同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的移植后，患先天性无胸腺症的婴儿能够控制感染，如爱泼斯坦巴尔病毒(Markert ML,2014,“胸腺移植”《斯蒂姆免疫缺陷(Stiehm's Immune Deficiencies)》,编辑者SullivanKE和Stiehm ER(学术出版社),第1版,第1059-1067页)。
历史上，同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品释放标准包含在制造过程的中点对组织的H&E和免疫染色切片进行组织病理学评估，随后将其改进为培养期的第5-9天。这种组织病理学评估已用作效力测定，并已由委员会认证的病理学家执行了定性分析。在切片组织切片之前，通过冷冻或福尔马林固定制备样品以进行评估，然后将其固定在载玻片上。以这种方式制备的样品在很长一段时间内都是稳定的，从而允许执行重新分析。
可以将20多年的开发历史中可用的历史样品与阳性临床结果联系起来，从而为开发用于评估产品质量的定量组织学测定法提供强大的数据集。
开发了一种新的数字组织学测定法，其使用以前临床批次和实验批次的同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品的H&E载玻片的扫描图像。如下所述，分析这些图像以发展成定量释放测定法。
发明内容
本文完全公开的实施例描述了一种用于定量评估在载玻片图像内表示的组织的总体核特性的方法。
所公开的实施例的一个应用是通过训练组织分类器来开发一种能够确定在移植到患者体内之前所述组织的效力或质量的测定法。例如，下文描述的方法可以用于确定用于完全迪乔治综合征(complete DiGeorge Syndrome)患者的同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品切片的效力。所描述的实施例可以用作同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品切片组织表征测定法，所述测定法基于组织学载玻片图像分析来评估胸腺组织效力，并且针对效力将通过的组织与合格分类相关联，将未通过的组织与不合格分类相关联。如下文图1所示，分类器接收未分类的载玻片图像作为输入，并且基于对所述未分类的载玻片图像的分析来确定所述未分类的载玻片图像中的组织是否是移植组织候选者。
如将在下文中更详细地讨论的，所描述的实施例描述了训练阶段，所述训练阶段包含基于载玻片图像的库训练所述分类器，以及分类阶段，所述分类阶段包含在未分类的载玻片图像上利用经训练的分类器来确定在所述未分类的载玻片图像中表示的组织的效力。所述训练阶段通过对与组织组成和细胞生存力相关的核特性的定量评估来训练所述分类器。所述训练阶段包含对通过和未通过的载玻片图像进行分析，以训练所述分类器识别所述通过和未通过的载玻片图像中的相应核特性。所得的分类器执行一项测定，所述测定基于历史数据识别通过和未通过的组成和生存力特性，所述历史数据导致在组织植入后成功进行免疫重建。
在一个实施例中，所述训练阶段包含两个部分。第一部分包含对训练数据集的验证，所述训练数据集用于为适当的元数据值、背景值和组织熵生成适宜性标准，并且可以定义对于定量分析被认为可接受的可接受范围或值。所述训练数据集包含已知具有针对移植的通过或未通过分类的载玻片图像。例如，这些可以是已经由病理学家或其它医学专业人员分析的载玻片图像。第二部分包含将在所述第一部分中生成的所述可接受范围或值应用于对照库中的图像，这将图像聚类为阳性和阴性对照组。如下文的说明书和实例中将进一步讨论的，每个对照组包含基于具有相似特征指纹而分组的载玻片图像。阳性对照组包含经确定可以通过移植标准的具有相似特征指纹的载玻片图像；阴性对照组包含经确定无法通过移植标准的具有相似特征指纹的载玻片图像。
在一个实施例中，所述分类阶段然后基于阳性和阴性对照组分析新的载玻片图像，并基于各自的特征指纹对所述新的载玻片图像进行聚类。然后，所述分类阶段基于所述新的载玻片图像与阳性对照组聚类还是与阴性对照组聚类来确定所述新的载玻片图像的效力。
在一个实施例中，所述特征指纹基于对经培养的胸腺细胞的四个测定结果。这些包含“面积”、“圆度”、“积分密度”和“周长”。如下所述，“面积”测量核面积，胸腺上皮细胞的核面积大于胸腺细胞的核面积。经历凋亡的细胞也可能更小。“圆度”测量细胞的圆形程度。圆度的测量范围是0到1，其中1是一个理想圆。与胸腺上皮细胞相比，胸腺细胞具有增加的圆度。与存活细胞相比，非存活细胞具有降低的圆度。因此，由于两个胸腺细胞都减少并且可以预期在组织切片中观察到更多的非存活细胞，因此可以预期圆度会随着培养时间的进程而降低。预期经降解的样品的圆度也会降低，因为将出现更多的非存活细胞，从而使分布向较低的圆度转移。“积分密度”表示核被染成多深。胸腺细胞的积分密度很高，其表现出均匀的深染色。胸腺上皮细胞具有深染色的边缘，并且大部分核质清晰，带有明显的深色核仁。最后，“周长”表示检测到的核的轮廓。周长与细胞生存力有关；随着细胞降解，核轮廓变得不规则，并且其周长也增加。随着培养的发展，周长也会随着TEC细胞占总细胞的比例增加而增加。随着培养时间以及组织降解，预期周长会发生变化。
所描述的实施例是对当前方法的改进，所述当前方法仅依靠定性人类驱动的分析，通过载玻片图像的免疫组织化学(IHC)以及苏木精和曙红(H&E)组织病理学来确定效力。这些当前方法遭受许多局限性，这些局限性削弱了当前定性分析的功效，包含无法进行半定量或定量的定性分析，并且在人体测定中病理学家无法评估整个组织。相反，病理学家只观察组织的一部分(单个视野)，而不是整个组织切片。
此外，具体地说，所描述的实施例比用于分析复杂组织(例如胸腺)的常规方法更加有效。在复杂的组织中，样品组织的定向可以显著改变结果变化。例如，具有非常不同的形态学(例如皮质髓质比率)的两个单独的切片都可以被认为是具有可接受效力的“良好”样品(即，具有合格分类)。所描述的实施例避免了该限制，因此，在对所有组织进行分类中是有效的。
所描述的实施例通过利用具有已知效力和功效的载玻片图像库来依靠定量分析。库中的载玻片图像包含通过将特定组织与不良或良好的临床结果(例如存活与否)相关联而已知通过或未通过所述特定组织的效力标准的组织的图像。通过的载玻片图像可以与合格分类相关联，而未通过的载玻片图像可以与不合格分类相关联。
所描述的实施例可以在一个或多个处理器上实施。所述一个或多个处理器可以在如LAN、WAN或因特网(例如，云)等网络上共定位或分布。此类处理器中的一个或多个处理器可以是图形处理单元(GPU)。在一个实施例中，GPU可以是处理器，所述处理器是被设计为处理数学密集型应用程序的专用电子电路。GPU可以具有并行结构，所述并行结构对于并行处理大数据块(如计算机图形应用程序、图像、视频等通用的数学密集型数据)有效。所述一个或多个处理器可以耦合到存储器，所述存储器包含一级或多级缓存并且可以具有控制逻辑(例如，计算机软件)和/或存储在其中的数据。
本公开的第一方面提供了一种训练组织分类器以进行定量组织病理学评估的方法，所述方法包括：
将载玻片图像转换为二元载玻片图像，其中所述载玻片图像选自对照图像库，其中所述对照图像库中的每个载玻片图像均与合格分类或不合格分类相关联；
检测所述二元载玻片图像内的一个或多个核；
对于每个检测到的核，从所述检测到的核中提取特征，其中所述特征表示所述二元载玻片图像内所述检测到的核的特性，并且包括以下中的至少一个：所述检测到的核的面积、所述检测到的核的周长、所述检测到的核的积分密度或所述检测到的核的圆度；
对于每个检测到的核，基于所述特征生成与所述二元载玻片图像相关联的特征指纹，其中所述特征指纹是通过处理所述特征而计算出的数值；
将所述二元载玻片图像合并到群集中，其中所述群集包括多个图像，其中第一多个图像中的每个图像与对应的特征指纹相关联，并且其中所述合并基于将所述特征指纹与所述对应的特征指纹进行比较；
将截止高度应用于所述群集以形成多个组，其中所述截止高度基于所述群集的方差分析的多变量分析使所述多个组内的组的数量最小化；
如果所述多个组内的第一组包括与所述合格分类相关联的第一载玻片图像，则将所述第一组分类为阳性对照集；并且如果所述多个组内的第二组包括与所述不合格分类相关联的第二载玻片图像，则将所述第二组分类为阴性对照集。
本公开的第二方面是一种用于对组织的未分类的载玻片图像进行定量组织病理学评估的方法，所述方法包括：
从所述未分类的载玻片图像中检测苏木精通道，其中所述苏木精通道与组织的所述未分类的载玻片图像内的细胞核相关联；
从检测到的苏木精通道中提取特征，其中所述特征表示所述二元载玻片图像内的核的特性，并且包括以下中的至少一个：所述核的面积、所述核的周长、所述核的积分密度或所述核的圆度；
基于所述特征生成与所述未分类的载玻片图像相关联的特征指纹，其中所述特征指纹是通过处理所述特征而计算出的数值；
将所述特征指纹与与一个或多个阳性对照集相关联的第一指纹集和与阴性对照集相关联的第二指纹集共聚类，其中所述一个或多个阳性对照集包括与合格分类相关联的第一载玻片图像集，并且所述阴性对照集包括与不合格分类相关联的第二载玻片图像集；以及
基于所述共聚类确定所述特征指纹与所述合格分类相关联还是与所述不合格分类相关联。
本公开的第三方面是一种用于对组织的数字图像内的对象进行分类的系统，所述系统包括：
用于将载玻片图像转换为二元载玻片图像的装置，其中所述载玻片图像选自对照图像库，其中所述对照图像库中的每个载玻片图像均与合格分类或不合格分类相关联；
用于检测所述二元载玻片图像内的核的装置；
用于从检测到的核中提取特征的装置，其中所述特征表示所述二元载玻片图像内所述检测到的核的特性，并且包括以下中的至少一个：所述检测到的核的面积、所述检测到的核的周长、所述检测到的核的积分密度或所述检测到的核的圆度；
用于基于所述特征生成与所述二元载玻片图像相关联的特征指纹的装置，其中所述特征指纹是通过处理所述特征而计算出的数值；
用于将所述二元载玻片图像合并到群集中的装置，其中所述群集包括多个图像，其中第一多个图像中的每个图像与对应的特征指纹相关联，并且其中所述合并基于将所述特征指纹与所述对应的特征指纹进行比较；
用于将截止高度应用于所述群集以形成多个组的装置，其中所述截止高度基于所述群集的方差分析的多变量分析使所述多个组内的组的数量最小化；
用于在所述多个组内的第一组包括与所述合格分类相关联的第一载玻片图像的情况下将所述第一组分类为阳性对照集的装置；以及
用于在所述多个组内的第二组包括与所述不合格分类相关联的第二载玻片图像的情况下将所述第二组分类为阴性对照集的装置。
本公开的第四方面是一种分类器，所述分类器包括：
用于从所述未分类的载玻片图像中检测苏木精通道的装置，其中所述苏木精通道与组织的所述未分类的载玻片图像内的细胞核相关联；
用于从检测到的苏木精通道中提取特征的装置，其中所述特征表示二元载玻片图像内的核的特性，并且包括以下中的至少一个：所述核的面积、所述核的周长、所述核的积分密度或所述核的圆度；
用于基于所述特征生成与所述未分类的载玻片图像相关联的特征指纹的装置，其中所述特征指纹是通过处理所述特征而计算出的数值；
用于将所述特征指纹与与阳性对照集相关联的第一指纹集和与阴性对照集相关联的第二指纹集共聚类的装置，其中所述阳性对照集包括与合格分类相关联的第一载玻片图像集，并且所述阴性对照集包括与不合格分类相关联的第二载玻片图像集；以及
用于基于所述共聚类确定所述特征指纹与所述合格分类相关联还是与所述不合格分类相关联的装置。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述方法、系统和分类器可以包括组织分类器或组织分类器的用途，所述组织分类器能够确定受试者(优选地，人类受试者)的组织的效力或可移植性。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述组织是胸腺组织，优选为用于植入人类受试者的同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品切片。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述人类可能患有与22q11.2缺失相关联的完全迪乔治综合征；眼组织缺损、心脏缺陷、胆道闭锁、生长或智力低下、生殖器发育不全和耳朵异常或耳聋综合征(CHARGE)或与叉头盒蛋白N1(FOXN1)缺乏相关联的无胸腺症。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述组织分类器通过生成对照库中的载玻片图像内检测到的核的特征指纹并基于其对应的特征指纹聚类所述载玻片图像来确定未知组织(优选地，胸腺组织)的效力。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，在胸腺器官培养基中对所述胸腺组织进行了一段时间的培养过程，以部分耗尽所述胸腺组织中的胸腺细胞。在一些实施例中，所述时间段长达21天。在其它实施例中，所述时间段为约12天到约21天，或约5天到约9天。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述培养过程保留了胸腺基质的功能结构，优选地，所述胸腺基质包括胸腺上皮细胞和成纤维细胞。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述组织选自由以下组成的组：血管组织、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、神经组织、泌尿生殖器组织、胃肠道组织、包含骨和软骨的骨骼组织、脂肪组织、包含肌腱和韧带的结缔组织、羊膜组织、绒毛膜组织、硬脑膜、心包膜、肌肉组织、腺体组织、面部组织、眼科组织。
在本公开的第一到第四方面的某些实施例中，所述特征指纹是根据测量结果生成的，所述测量结果包括所述检测到的核的面积、所述检测到的核的周长、所述检测到的核的积分密度和所述检测到的核的圆度的数值。
应进一步理解，为了清楚起见，在本公开的不同方面的上下文中和/或在单独的实施例中描述的本文所述的某些特征也可以在单个实施例中以组合形式提供。相反，为了简洁起见，在本公开的单个方面的上下文中和/或在单个实施例中描述的各种特征也可以单独提供或以任何适当的子组合形式提供。
附图说明
为了更完整地理解本文所公开的原理和其优点，参考结合附图进行的以下描述，在附图中：
图1是分类器的操作的示意图，所述分类器接收未分类的载玻片图像的输入，并基于对所述未分类的载玻片图像的分析以及与预先建立的接受标准的比较来确定所述未分类的载玻片图像中的组织是否是移植组织候选者。
图2示出了示例性群集和聚类树状图，其中所述群集已被分为不同的组a、b、c、d和e。
下文图3A-3D示出了具有不同量的背景像素的载玻片图像。图3A描绘了在适当数量的背景像素上示出组织样品的载玻片图像。图3B和3C示出了具有过多背景像素的载玻片图像。图3D示出了背景像素数量不足的载玻片图像。
图4A-4C示出了具有不同程度的核分割的载玻片图像。图4A示出了具有正确分割的核的载玻片图像，而图4B和4C示出了具有不正确分割的核的载玻片图像。
图5描绘了分析胸腺组织标本的苏木精图像的图像处理步骤。图5描绘了经苏木精染色的胸腺组织标本，其在框内将要分析的区域标识为轮廓(所述框在中间图像中被放大)，并转换为载玻片图像的红色通道，所述通道已被提取并反转以形成二元图像(在右侧的图像中)。
图6A-6D示出了在一个实施例中的特征提取的示例性结果，在所述实施例中，组织是胸腺组织并且所提取的特征包含面积、周长、积分密度和圆度。图6A示出了面积测定结果。图6B示出了周长测定结果。图6C示出了积分密度测定结果。图6D示出了圆度测定结果。
图7示出了针对载玻片图像生成的指纹的表示。指纹是图像内的核的基础特征的定量表示。
图8示出了来自聚类步骤的原始输出的表示，所述原始输出包含从杜克大学接收的胸腺标本。
图9示出了训练阶段期间分组步骤的结果。图9示出了基于胸腺组织的实验样品的载玻片图像聚类的多个阳性和阴性对照组。
图10示出了对表2的每个分割组内的群体之间的差异进行统计学分析的示例结果。图10显示，每个组内的载玻片图像的群体没有显著变化，这表明那些载玻片图像共享相似的特征指纹。
图11是载玻片图像的示例分析的流程图。在一个实施例中，所述流程图由执行上述处理步骤的分类器实施。可以首先对载玻片图像进行评估，以确定该图像是否适合在分类步骤中进行分析。
图12A-12D是预示性实例，其示出了基于胸腺组织的载玻片图像的某些提取特征的示例特征指纹。图12A示出了在针对核的面积生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。图12B示出了在针对核的周长生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。图12C示出了在针对核的积分密度生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。图12D示出了在针对核的圆度生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。
图13A-13F示出了由将分类器示例性应用于具有阳性和阴性对照组的皮质胸腺细胞的示例载玻片图像而得到的特征指纹。图13A是与阳性对照组相关联的胸腺组织的示例性载玻片图像。图13B是与阴性对照组相关联的胸腺组织的示例性载玻片图像。图13C示出了与圆度测定结果相关联的特征指纹。图13D示出了与面积测定结果相关联的特征指纹。图13E示出了与积分密度测定结果相关联的特征指纹。图13F示出了与周长测定结果相关联的特征指纹。
图14A-14D描绘了临床的和降解的经培养的胸腺组织的核。图14A-14C表示三批经培养的胸腺临床组织样品。图14D表示降解的胸腺组织。
图15示出了针对组织面积归一化的每天细胞数量的趋势。
图16A-16B是在培养过程的第0天的胸腺组织的图像。图16A是在第0天的经培养的H&E染色的胸腺组织的照片。图16B是在40倍放大率下的经培养的H&E染色的胸腺组织的一部分的特写放大。
图17A-17B是在培养过程的第5天的胸腺组织的图像。图17A是在第5天的经培养的H&E染色的胸腺组织的照片。图17B是在40倍放大率下的经培养的H&E染色的胸腺组织的一部分的特写放大。
图18A-18B是在培养过程的第9天的胸腺组织的图像。图18A是在第9天的经培养的H&E染色的胸腺组织的照片。图18B是在40倍放大率下的经培养的H&E染色的胸腺组织的一部分的特写放大。
图19A-19B是在培养过程的第12天的胸腺组织的图像。图19A是在第12天的经培养的H&E染色的胸腺组织的照片。图19B是在40倍放大率下的经培养的H&E染色的胸腺组织的一部分的特写放大。
图20A-20B是在培养过程的第21天的胸腺组织的图像。图20A是在第21天的经培养的H&E染色的胸腺组织的照片。图20B是在40倍放大率下的经培养的H&E染色的胸腺组织的一部分的特写放大。
图21A-21E是在第0天、第5天、第9天、第2天和第21天的H&E染色的经培养的胸腺组织的图像，其描绘了在第0天、第5天、第9天、第12天和第21天的核外观变化。图21A示出了具有较高积分密度的高比例的核，这表明胸腺细胞数量高。当从组织中洗去胸腺细胞时，第5天(图21B)、第9天(图21C)、第12天(图21D)天和第21天(图21E)的组织显示出积分密度的显著降低，并且轮廓更类似于胸腺上皮细胞的轮廓。
图22是示出来自同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品的技术批次的积分密度测定结果的时间进程的图。当从组织中洗去胸腺细胞时，第5天的组织显示出积分密度的显著降低，并且轮廓更类似于胸腺上皮细胞的轮廓。误差条是均值的一个标准差。
图23是示出圆度的测量结果的图。在整个培养过程中，具有极高圆度的细胞的数量会随着时间而减少。这可能是由于细胞凋亡导致核的圆形程度降低以及非常圆形的胸腺细胞被洗出。对于第0天的圆度较低的样品，这可能是由于胸腺细胞的凝集，所述胸腺细胞被测量为圆度低于单个核的单个实体。误差条是均值的一个标准差。
图24是示出周长的测量结果的图。在第0天在第0天，有很大比例的细胞具有高周长，这可能是由于在程序中将细胞块读取为单个形状而导致了较大的周长值。周长的增加很可能是胸腺细胞洗出和细胞在培养时间内经历凋亡的组合，以及由此事件导致的周长增加。误差条是均值的一个标准差。
图25是示出面积的时间进程的图。这项技术在考虑所检查的所有四个变量的情况下，使用了欧氏距离(Euclidean distance)(样品与大质心之间的误差总和的平方根)来测量两个样品之间的相似度。作为参考，欧氏距离越小，两个样品彼此之间越相似。误差条是均值的一个标准差。
图26是数据的主要效果图和相互作用图。图26中所示的数据证实了经培养的胸腺组织随时间表现出相似的行为。
图27是示出每天胸腺距质心的距离的95％置信区间的图。
图28A和28B是胸腺上皮细胞的示例性图像，所述胸腺上皮细胞已经由病理学家用红色勾勒出轮廓。
图29是病理学家用红色勾勒出轮廓的胸腺上皮细胞(TEC)的图像。胸腺细胞以蓝色勾勒出轮廓。
图30是来自H&E载玻片的TEC与细胞总数的比率的绘图。
图31是针对所选组织面积归一化的TEC与细胞总数的比率的绘图。
图32是聚类树状图，其示出了第“C”组和第“D”组之间的距离作为实例。突出显示的绿色框和红色框表示单个分组。这基于0.43的截止y轴高度。在此实例中，第C组和第D组的距离为0.6，并且因此被视为两个单独的组。每组中的样品在统计学上被认为是相似的，而不同组中的样品在统计学上被认为是不同的。
图33是示出具有所有临床上良好的和经确认不良的样品的训练集的图。带框的群集是强制降解的样品。
图34描绘了最终样品库。这些组从左到右分别被称为第4组、第3组、第2组和第1组。第1组、第2组和第3组与合格分类相关联，而第4组与不合格分类相关联。
图35A-35D描绘了最终样品库中每个群集组的代表性图像。第1组(图35A)、第2组(图35B)和第3组(图35C)由具有阳性临床结果的样品构成。第4组(图35D)由经确认已降解的样品构成。第1组样品来自LOT-345，第2组样品来自LOT-160，第3组样品来自LOT-194，并且第4组样品来自FD.SP17-40348-C1.1(降解方法：在-20℃下冷冻)。
图36A-36D是按组分解的不同参数的图形表示。图36A是基于面积测定结果的数据群集的图形表示。图36B是基于圆度测定结果的数据群集的图形表示。图36C是基于积分密度测定结果的数据群集的图形表示。图36D是基于周长测定结果的数据群集的图形表示。
图37是第1组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
图38是描绘第1组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图39是描绘第1组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图40是描绘第1组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图41是描绘第1组中的细胞的周长测量结果的直方图。
图42是第2组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
图43是描绘第2组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图44是描绘第2组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图45是描绘第2组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图46是描绘第2组中的细胞的周长测量结果的直方图。
图47是第3组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
图48是描绘第3组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图49是描绘第3组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图50是描绘第3组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图51是描绘第3组中的细胞的周长测量结果的直方图。
图52是第4组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
图53是描绘第4组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图54是描绘第4组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图55是描绘第4组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图56是描绘第4组中的细胞的周长测量结果的直方图。
图57是在组之间和在组内基于逐个选区的变异性分析的绘图。数据在x轴上首先按组显示，然后按参数选区显示。每个参数的顶部图形是个体，而底部是该组的标准差。两者都可以用于将数据的传播可视化。
具体实施方式
本文提供的标题、标题和子标题不应被解释为限制本公开的各个方面。因此，通过整体参考说明书，更完整地定义了在下文中定义的术语。本文所引用的所有参考文献均通过引用整体并入。
除非另外定义，否则本文所使用的科学术语和技术术语应该具有与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应该包含复数含义，并且复数术语应该包含单数含义。在本申请中，除非另外说明，否则“或者”的使用是指“和/或”。在多个从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅是指替代方案中的一个以上的独立于先前的权利要求或从属的权利要求。
还应注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一/一个(a/an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用均包含复数指示物，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所用，术语“包含”和其语法变型旨在是非限制性的，使得列表中项目的叙述不排除可以替换或添加到所列项目的其它相似的项目。
参考以下定义，最清楚地理解本发明：
本文使用的术语“约”是指大约、在某一范围内、大致上或周围。当结合数值范围使用时，术语“约”通过扩展所阐述的数值以上和以下的界限来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于通过+/-10％的方差来修改高于和低于所述值的数值。如本文所使用的，术语约是指数值，包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语约通常是指本领域的普通技术人员认为等同于所列举的值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所列举范围的+/-5-10％)。当如至少和约等术语在数值或范围的列表之前时，所述术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包含四舍五入到最接近的有效数字的数值。
如本文中所使用的，术语“包括(comprising)”(和任何形式的包括，如“comprise”、“comprises”和“comprised”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，如“have”和“has”)、“包含(including)”(以及任何形式的包含，如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有，如“contains”和“contain”)是包容性的或开放性的，并且不排除其它未列举的元素或方法步骤。另外，与术语“包括”结合使用的术语也被理解为能够与术语“由……组成”或“基本上由……组成”结合使用。
如本文所使用的，术语“组织”是指人或动物中的任何类型的组织，并且包含但不限于血管组织、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、神经组织、泌尿生殖器组织、胃肠道组织、包含骨和软骨的骨骼组织、脂肪组织、包含肌腱和韧带的结缔组织、羊膜组织、绒毛膜组织、硬脑膜、心包膜、肌肉组织、腺体组织、面部组织、眼科组织。
如本文所述，除非另外说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包含所述范围内的任何整数的值，以及在适当时包含其分数(如，整数的十分之一和百分之一)。范围是近似值，并且可能相差超过一个整数。
用国际单位制(SI)接受的形式表示单位、前缀和符号。数值范围包括定义该范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测量值应被理解为近似值。
应进一步理解，本文所描述的、为了清楚起见在单独实施例的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施例中以组合形式提供。相反，为简洁起见在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或以任何适当的子组合提供。
“面积”–以μm
“圆度”–测量细胞的圆形程度。圆度的测量范围是0到1，其中1是一个理想圆。与胸腺上皮细胞相比，胸腺细胞具有增加的圆度。与存活细胞相比，非存活细胞具有降低的圆度。因此，由于两个胸腺细胞都减少并且可以预期在组织切片中观察到更多的非存活细胞，因此可以预期圆度会随着培养时间的进程而降低。预期经降解的样品的圆度也会降低，因为将出现更多的非存活细胞，从而使分布向较低的圆度转移。
“积分密度”–表示核被染成多深。胸腺细胞的积分密度很高，其表现出均匀的深染色。胸腺上皮细胞具有深染色的边缘，并且大部分核质清晰，带有明显的深色核仁。
“周长”–表示检测到的核的轮廓，以μm为单位。周长与细胞生存力有关；随着细胞降解，核轮廓变得不规则，并且其周长也增加。随着培养的发展，周长也会随着TE细胞占总细胞的比例增加而增加。随着培养时间以及组织降解，预期周长会发生变化。
所开发的定量组织学方法是基于图像的算法，所述算法基于被确定为与同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品具有统计学和生物学相关性的特性来对类似图像进行聚类。已创建了经扫描的H&E组织学载玻片。将载玻片以SCN或TIFF图像的形式上传到经过验证的胸腺组织分析软件中。如果上传的文件是SCN图像，则算法会将其转换为TIFF图像以进行分析。提取图像的红色通道，然后将其反转，以使曙红染色突出显示的核现在在白色背景上呈黑色形状。
然后，针对每个核测量面积、周长、积分密度(形状有多暗)和圆度。然后，可以将这些属性中每个属性的频率分布与数据库中已知的良好样品和不良样品进行比较。然后对属性执行统计学聚类比较，以确定新输入样品在统计学上是否类似于已知样品，从而可以根据先前鉴定的标准确定为“通过”或“未通过”。
以40x或20x放大率扫描同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品的临床和R&D H&E载玻片的选择。然后将图像上传以开发定量组织学方法。
为了对载玻片进行，首先分析图像，使得可以从图像中提取属性数据。为此，将图像转换为TIFF FGP格式，然后通过ImageJ通过图像处理算法进行处理，其中将图像校准为1μm/像素，提取红色通道，然后将红色通道反转，使得深染色的核导致更高的像素强度。对该分析的描述，请参见图5A-C。
确定阈值并将其设置为用于选择核的适当值，以确保图像之间的图像分析是一致的。分析图像中的颗粒(细胞核)，此处定义为像素的连续区域，面积超过10μm
通过主成分分析在最初分析的组织群体中被确定为具有统计学意义的特征是面积、周长、积分密度和圆度。发现其它特征无法帮助区分样品，因此不再进行分析。
图14A-14D描绘了三批临床经培养的胸腺组织样品(图14A-14C)和经降解的胸腺组织样品。图14A中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝11.34；圆度＝0.696；周长＝14.310并且积分密度＝1889.2。图14B中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝11.41；圆度＝0.993；周长＝11.982并且积分密度＝1912.4。图14C中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝10.53；圆度＝0.846；周长＝12.510并且积分密度＝1707.4。图14D中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝13.0；圆度＝0.352；周长＝21.556并且积分密度＝1786.0。每个图像中的单个核由一个圆圈标识。
一旦已经针对每个核记录了四个参数，则针对每个参数创建频率分布，以显示整个载玻片上的核分布。每个载玻片通常有100,000个以上的数据点。通过选择仍显示载玻片之间变异性的最少选区来确定分布内每个参数的选区宽度和截止值。确定每个选区中核的比例，并将这些值用于聚类分析。
本文描述的定量分析是数字病理学的无偏/新兴方法。训练阶段和分类阶段均包含计算机化的特征提取，以针对每个图像生成特征指纹。在一个实施例中，特征指纹表示每个图像的基础核特征。利用细胞特征提取能够定量表征每个载玻片图像中所表示的组织内的基础细胞群体。这两个阶段还包含统计学分层凝聚聚类技术，以通过描述载玻片图像内的每个细胞的定量特征对组织学切片进行分类。聚类分析基于针对每个载玻片图像生成的指纹之间的相似性，将载玻片图像分为不同的组。在一个实施例中，在图像分析的上下文中使用分层凝聚聚类来训练组织分类器和利用经训练的组织分类器来确定未知组织的效力。下文在说明书、附图和实例中阐述了本公开的聚类实施例的实例。例如，但不限于，结合图2、7-9、32等以及随附的文字和表格描述的聚类技术。
在组织分类的上下文中，分层凝聚聚类包含直接从数据中组装群集，以揭示基础数据集的新兴特性。在分类阶段中，根据一个实施例，聚类技术允许基于未知组织的所生成的特征指纹与已知组织的先前聚类的特征指纹(例如，来自载玻片图像库)的相似性来对所述未知组织进行分类。聚类技术还依赖于对聚类树状图的相对高度的分析(见图2)，该图指示群集中心点之间的距离。相对高度通常与群集的数值特征之间的差异成正比(在下文中进一步讨论)。
图2示出了示例性群集和聚类树状图，其中所述群集已被分为不同的组a、b、c、d和e。在生成群集和/或聚类树状图之后，可以应用统计学分析技术来确定统计学上彼此显著不同的组。统计学分析技术的一个实例是方差多变量分析或MANOVA，这是一种用于确定具有两个或多个(即，多个)变量的数据集之间的方差的程序。
训练和分类阶段可以包含以下步骤中的一个或多个：适宜性确定、图像处理、特征提取和聚类。
适宜性确定是指评估载玻片图像的特性以确定所述载玻片图像是否适合于进一步定量分析，如所公开实施例中所述。可以针对图像的训练集以及针对新的载玻片图像执行适宜性确定。在一个实施例中，载玻片图像的适宜性确定包含元数据分析、背景像素分析(例如，检查载玻片图像中存在的背景像素的数量)和组织熵(和核分割)分析(例如，检查载玻片图像中的熵的数量)。
载玻片图像的元数据分析确定载玻片图像是否具有用于定量分析的适当的元数据特性。可以考虑的元数据的实例包含但不限于：文件名(例如，文件名是否唯一)、上次修改日期(上次修改文件的日期)、文件大小(例如，以字节为单位的文件大小)、格式(例如，文件类型，如TIF)、图像宽度(例如，以像素为单位的含有载玻片图像的宽度的值)、图像高度(例如、以像素为单位的含有载玻片图像的高度的值)、位深度(载玻片图像中颜色通道的总位数)、颜色类型(图像的颜色类型，如RGB)、x分辨率(例如，表示载玻片图像在X方向上的分辨率的值)、y分辨率(例如，表示载玻片图像在Y方向上的分辨率的值)、分辨率单位(例如，含有x分辨率和y分辨率特性的单位的字符串)、图像背景比率(背景像素的数量占像素总数的比率)、背景标签(描述图像中的背景像素数量的标签)、组织熵(仅描述被分割的组织像素的熵)和核分割标签(描述核分割分析的成功的标签)。
在一个实施例中，基于对上述一个或多个元数据特性的分析，可以认为载玻片图像适合于定量分析。例如，在一个实施例中，如果在载玻片图像的标题内存在上述所有字段并且可读，并且载玻片图像的x分辨率介于0.8μm-1.2μm之间且y分辨率介于0.8μm-1.2μm之间，则所述载玻片图像适合于定量分析。在另一个实施例中，如果任何字段丢失或损坏，则可以将所述载玻片图像排除在定量分析之外。
背景像素的分析是确保组织的图像适合于进一步分析的步骤，所述分析需要在背景上观察待分析的组织。在一个实施例中，定量分析利用载玻片图像中的标准化量的背景像素，以确保在组织分割和核分割期间进行准确的分割。背景像素过多的图像(空图像)或背景像素不足的图像(裁剪的图像)在分割分析中表现较差(如下所述)，因此，必须确定背景像素的范围，以便在继续所公开的实施例的定量分析之前将超出此范围的图像筛选出来。
背景分析的结果可能导致将背景标签(例如，合格或不合格)与载玻片图像相关联。例如，图3A-3D示出了具有不同量的背景像素的载玻片图像。图3A描绘了在适当数量的背景像素上示出组织样品的载玻片图像。在一个实施例中，具有适当数量的像素的载玻片图像被认为适合于进一步分析。这种类型的图像可以被认为是第一背景类别。
图3B和3C示出了具有过多背景像素的载玻片图像。在一个实施例中，具有过多背景像素的载玻片图像被认为不适合进一步分析。这种类型的图像可以被认为是第二背景类别。
图3D示出了背景像素数量不足的载玻片图像。在一个实施例中，此类载玻片图像被认为不适合进一步分析。这种类型的图像可以被认为是第三背景类别。
现在将讨论背景分析的示例性步骤。将基于背景像素数量与像素总数之比，使用分类区间对载玻片图像的图像背景进行分类。例如，空图像(例如，图3B，3C)表现出非常高的图像背景比率(例如，95％)；裁剪后的图像表现出非常低的图像背景比率(例如，5％)(例如，图3D)，并且具有正常量的背景像素和组织的图像表现出中等的图像背景比率(例如，20％到80％)(例如，图3A)。这些值仅是示例性的，并且可以基于对训练集内的图像的分析来动态地确定。
对训练集内的图像执行背景分析(例如，以生成被认为适合于定量分析的值的适当范围)、对对照集中的图像执行背景分析(例如，以确定对照集中的图像的背景值是否落在所生成的适当范围内)并对新的未指定图像执行背景分析。在一个实施例中，确定载玻片图像的图像背景比率分类包含但不限于以下步骤。
在一个实施例中，针对训练集确定载玻片图像的图像背景比率分类包含但不限于以下步骤：
1.计算训练集中的所有图像的图像背景比率。
a.计算归一化的图像直方图计数。
b.在红色通道中的所有图像像素上使用反函数，以从背景像素中分割组织像素(例如，应用程序ImageJ中的otsu_dark函数)
c.用N个选区从所有图像像素中生成直方图计数，其中N＝2
d.将所有直方图计数除以图像中的像素总数，即可对数据进行归一化。
e.计算大于阈值的像素比例。该比例代表图像背景比率。
2.计算被认为具有适当背景像素数量(例如，合格)的图像的图像背景比率的分类区间。
a.计算第一、第二和第三背景类别的平均图像背景比率和标准差。
b.计算分类范围的上限。
i.计算第一和第二背景类别的平均图像背景比率之间的中点。该值可以被指定为可接受的分类区间的范围上限。
c.计算分类范围的下限。
ii.计算第一、第二和第三背景类别的平均图像背景比率之间的中点。该值被指定为可接受的分类区间的范围下限。
在一个实施例中，对载玻片图像的训练类别执行的前述步骤的结果产生可接受的背景范围。具有在该可接受的背景范围内的背景值的载玻片图像可以被认为适合于进一步的定量分析。然后可以将可接受的背景范围应用于对训练类别之外的新图像(如对照库内的图像)进行分类。例如，经确定背景比率在针对具有第一背景类别的图像所计算的背景范围内的新载玻片图像(例如，图3A)被分类为具有适当数量的背景像素，并被接受用于下一步分析。相反，在针对具有第一背景类别的图像所计算的背景范围之外的新载玻片图像(例如，图3B-D)将被拒绝，并且将不会进行进一步的分析。
核分割分析确保载玻片图像中的核像素与其它像素适当地分开。载玻片图像的特征指纹部分基于核特征，因此在实施例中进行定量分析需要正确分割的核像素。核分割分析的结果可能导致将核分割标签(例如，合格或不合格)与载玻片图像相关联。
核分割分析包含评估组织像素的熵以确保存在足够的熵，使得将发生准确的核分割。像热力学熵一样，图像熵对应于系统中的状态数。具有均匀分布在图像中的许多不同像素值的图像具有高数量的状态，因此具有高熵。像素值不均匀分布在图像中的图像将具有较少数量的状态，因此，其熵也较低。评估载玻片图像中组织像素的熵可确保图像中存在适当的对比度和清晰度，这有助于对载玻片图像进行定量分析。与具有正常量的组织对比度的图像相比，具有较低组织对比度的图像将具有较低的熵。每个核的像素数量和排列方式与其“特征”相对应，并用于生成用于对组织样品进行聚类的特征指纹。这些特征在载玻片图像中的每个核之间都将有所不同。在一个实施例中，已经通过了先前两个步骤(元数据分析、图像背景)的图像将进行该组织熵分析。
当应用于训练集时，组织熵分析为图像内的可接受组织熵创建一个范围。在一个实施例中，组织熵分析可以包含但不限于以下步骤：
1.从背景像素中分割所有组织像素。
i.在红色通道中的所有图像像素上使用反函数，以从背景像素中分割组织像素(例如，应用程序ImageJ中的otsu_dark函数)。
ii.使用熵方程计算所有组织像素的熵，并保存相应的值。熵方程的实例如下所示，其中ET是所有组织像素的组织熵，p是选区i中组织像素的归一化直方图计数，并且N是直方图中使用的直方图选区数：
iii.创建载玻片图像内所有经分割的核的二元掩膜(例如，对所有组织像素应用函数otsu_dark)。二元掩膜对应于特定图像，并指向将要使用的像素。通常在执行分割时创建二元掩膜。例如，与H&E图像相对应的二元掩膜将是具有与原始图像相同尺寸的矩阵，其中核掩膜仅为1位，并且仅含有预定值(例如，0或1)。与原始图像中的核位置匹配的像素位置将具有预定值(例如，1)，其中非核像素将具有预定值(例如，0)。
2.为所有图像创建核分割标签。该标签描述了在上述关于组织熵分析的图像处理程序中执行的核分割的成功。核分割是将原始载玻片(例如，H&E)图像中的核像素与所有其它像素分开。执行核分割，因此仅对图像中的细胞核执行对象分析。
i.确定核分割的准确性。例如，可以使用应用程序执行此步骤，并将其与提供准确和不准确分割实例的图像键进行比较。
1.使用一定的不透明度值在红色通道图像上覆盖二元核掩膜(下文图4A-C)。
2.检查预定数量的核(例如，50个)以进行正确的分割，所述正确的分割被定义为将掩膜正确地覆盖在核的顶部。
a.如果正确地分割了预定数量的核中的大于或等于一定数量的核(例如，45个)，则可以赋予图像第一核分割标签(例如，“0”)(图4A)。
b.如果少于一定数量的核被正确地分割，则可以图像图像第二核分割标签(例如，“1”)(图4B，C)。
3.计算具有第一核分割标签的图像的组织熵的分类区间。
i.计算具有第一和第二核分割标签的图像中每个图像的平均组织熵和标准差。
ii.计算分类范围的下限。
1.计算第一和第二核分割标签的平均组织熵之间的中点。该值被指定为组织熵范围的下限。
2.组织熵的可接受范围可以从步骤3.ii.1中计算的范围的下限到无穷大。
在一个实施例中，对载玻片图像的训练类别执行的前述步骤的结果针对载玻片图像中的组织熵产生可接受的分类范围。然后可以将可接受的分类范围应用于对新的载玻片图像进行分类。组织熵值大于分类范围下限的载玻片图像(请参阅步骤3.ii.1)被分类为具有适当数量的组织熵，并被接受使用此方法进行分析。组织熵值小于分类范围下限的载玻片图像将被拒绝，并且不会继续进行进一步的定量分析。
图4A-4C示出了具有不同程度的核分割的载玻片图像。图4A示出了具有正确分割的核的载玻片图像，而图4B和4C示出了具有不正确分割的核的载玻片图像。
图像处理特征在下文关于分析载玻片图像的苏木精通道进一步讨论，因为该通道描绘了每个细胞的核特征。在一个实施例中，苏木精图像与曙红图像分开。在一个实施例中，图像处理步骤还可以包含，如下文图5A-C所示，将载玻片图像转换为二元图像以进行分析。在一个实施例中，使用相同的分辨率和比例来分析载玻片图像(图5A)。然后从二元图像中提取像素的连续区域，以便检测核和所述核的相应特征(如图5B所示)。在一个实施例中，提取载玻片图像的红色通道并反转，以形成如图5C所示的二元图像。在一些系统中，图像的红色通道可提供载玻片图像内的核的最佳图像。
在一个实施例中，特征提取步骤包含针对在载玻片图像中检测到的每个核提取特征，并针对每个提取的特征生成指纹。在一个实施例中，特征被表示为数字特征值。下表1列出了例如但不限于可检测并因此能够针对每个核进行提取的特征。可以针对每个核提取一个或多个特征。例如，出于不同效力应用的目的，某些特征可能更相关。即，可以确定某些特征在通过和未通过的组织之间显著变化。
在一个实施例中，当待分类的组织是胸腺组织(其可以或可以是测定法的一部分)时，所提取的相关特征是每个检测到的核的面积、每个检测到的核的周长、每个检测到的核的积分密度以及每个核的圆度。关于面积，胸腺上皮细胞的核面积大于胸腺细胞的核面积。周长与细胞生存力有关；随着细胞降解，核轮廓变得不规则，并且其周长也增加。胸腺细胞的积分密度很高，其表现出均匀的深染色。胸腺上皮细胞具有深染色的边缘，并且大部分核质清晰，带有明显的深色核仁。与胸腺上皮细胞相比，胸腺细胞具有增加的圆度。与存活细胞相比，非存活细胞具有降低的圆度。
在一个实施例中，积分密度由检测到的核的大小以及与检测到的核相关联的暗度值表示。圆度表示对检测到的核的圆形形状的评估，并且在一个实施例中，圆度可以由范围(例如，0.0到1.0，其中1.0表示正圆)表示。
现在讨论根据实施例的针对载玻片图像的特征指纹的确定。最初，针对每个提取的特征创建一个数字指纹。例如，在上述实施例中，针对载玻片图像内的核的面积、周长、积分密度和圆度分别生成特征指纹。在一个实施例中，针对每个提取的特征(例如，面积、周长、积分密度和圆度)生成直方图。每个直方图均显示特征的特定范围(选区)中结果的频率。从每个载玻片图像的组合直方图中生成特征指纹。聚类(在下文和下文的实例中讨论)基于对所提取特征的统计学分析。直方图示于图6A-6D中。图6A-D示出了在一个实施例中的特征提取的示例性结果，在所述实施例中，组织是胸腺组织并且所提取的特征包含面积、周长、积分密度和圆度。图6A示出了面积测定结果。图6B示出了周长测定结果。图6C示出了积分密度测定结果。图6D示出了圆度测定结果。
在一个实施例中，聚类可以包含基于载玻片图像的特征指纹来组装群集。在一个实施例中，将用于所生成的特征指纹的欧氏距离矩阵制成表格。然后，通过寻找载玻片图像的最佳排列，可以将距离矩阵用于分层凝聚聚类，以使载玻片图像的组内方差最小。
在一个实施例中，特征指纹可以由从如上所述提取的特征的组合直方图中生成的每个载玻片图像的数值来表示。在训练阶段，将分层凝聚聚类应用于来自对照图像库的载玻片图像的特征指纹，所述对照图像库带有已知数据集，如杜克(Markert Lab)、强制降解(CT2)和制造(CT2)标本载玻片。在一个实施例中，聚类还包含执行统计学分析以确定截止高度，在所述截止高度下将群集分割成组，以确保每组内的载玻片图像之间的统计学显著性。在分类阶段，通过与来自库的载玻片图像进行共聚类，对未知样品进行分类。然后，基于群集中未知样品发生共聚类的组，对未知样品进行分类。
下文图7示出了针对载玻片图像生成的指纹的示例性表示。如上所述，指纹是图像内的核的基础特征的定量表示。
下文图8示出了来自聚类步骤的原始输出的示例性表示，所述原始输出包含来自杜克大学提供的组织样品的数据。
在一个实施例中，聚类步骤可以包含将群集分割成组。必须计算出一个截止高度，通过所述截止高度可以以统计学上显著的方式进行分割。在一个实施例中，通过系统地增加截断高度并在分组之间进行相应的方差多重分析(MANOVA)来计算截止高度，并且选定的截止高度可最大程度地减少组数，同时使各组群体之间特征指纹差异的统计学显著性最大化。在组织为胸腺组织且所提取的特征包含面积、周长、积分密度和圆度的示例实验测试中，确定了分割群集的截止高度(例如0.4)，这导致将群集分割成一定数量的组(例如，9个)。
在示例实验测试中，在组形成之后，如果组内的样品群体由先前经确定已经通过效力标准的样品(即，具有合格分类的“良好”样品)的载玻片图像组成，则将该组指定为阳性对照组。这些组的实例包含杜克和制造数据集。如果组内的样品群体由先前经确定未通过效力标准的载玻片(即，具有不合格分类的“不良”样品)组成，则将该组指定为阴性对照组。这些组的实例包含强制降解数据集。
下文图9示出了训练阶段期间分组步骤的示例结果。
图9示出了基于胸腺组织的载玻片图像聚类的多个阳性和阴性对照组。在此类实施例中，可能没有针对效力的单个合格/不合格标准。相反，多个特征可以区分样品并且可以被考虑用于效力。基于载玻片图像中的变化(如，从中获取切片的区域和组织的大小)，阳性对照组之间可能会有更多的变化。例如，从更复杂的组织(如胸腺)的不同区域获取的切片将具有不同的皮质髓质比率(例如，胸腺细胞、上皮网状细胞的分布和胸腺小体的数量)，但仍可以满足效力的合格标准。
在一个实施例中，对图9中的对照组的以下描述仅是示例性的，并且旨在示出导致形成各个对照组的载玻片图像的可能的共同特征。可以基于其它特征或其中包含的载玻片图像内的特征组合来形成对照组。在图9的实例中，基于胸腺小体的存在、髓质和皮质区域的定义不清以及广泛的坏死和纤维化，对图9中的第一个阴性对照组(“neg.ctrl.1”)进行分组。基于胸腺小体、纤维化和坏死的最小存在或不存在以及髓质和皮质区域定义不清，对图9中的第二个阴性对照组(“neg.crtl.2”)进行分组。基于胸腺小体、纤维化和坏死的最小存在或不存在以及髓质和皮质区域定义不清，对图9中的第三个阴性对照组(“neg.crtl.3”)进行分组。
关于图9中所示的阳性对照组，在此实例中，基于缺乏定义的皮层或髓质区域、胸腺小体的存以及低至正常量的淋巴细胞，对图9中的第一个阳性对照组(“pos.crtl.1”)进行分组。基于正常上皮细胞的存在、正常皮层和髓质区域、胸腺小体的存在以及具有正常成熟T细胞变化的淋巴细胞，对图9中的第二个阳性对照组(“pos.crtl.2”)进行分组。基于正常上皮细胞的存在、正常皮层和髓质区域、胸腺小体的存在以及具有正常成熟T细胞变化的淋巴细胞，对图9中的第三个阳性对照组(“pos.crtl.3”)进行分组。基于少量的淋巴细胞、不同程度的髓质和皮质区域、一些组织从髓质延伸到皮层中的坏死的存在以及上皮细胞从无到有变化，对图9中的第四个阳性对照组(“pos.crtl.4”)进行分组。基于正常的皮层和髓质区域、胸腺小体的存在、正常的胸腺细胞分布以及具有正常成熟T细胞变化的淋巴细胞，对图9中的第五个阳性对照组(“pos.crtl.5”)进行分组。基于胸腺小体的最小存在或不存在、缺乏对皮层和髓质区域的鉴定以及高度的纤维组织，对图9中的第六个阳性对照组(“pos.crtl.6”)进行分组。本公开的替代性聚类技术可以在本说明书的实例中找到。
下表2和3示出了在进行共聚类分析之后对形成组进行统计学分析的示例结果。在一个实施例中，执行MANOVA分析。表2说明，基于共聚类分析的组导致聚类分组之间的群体彼此显著不同。
表2
通过共聚类分析的群集分组
表3
通过随机选择样品进行合成分组
图10进一步示出了对表2的每个分割组内的群体之间的差异进行统计学分析的示例结果。图10显示，每个组内的载玻片图像的群体没有显著变化，这表明那些载玻片图像共享相似的特征指纹。
表3显示，随机生成的组的组(即，不执行共聚类)导致每个组的群体之间不存在统计学显著性。
在一个实施例中，在训练阶段之后，分类器已经建立了来自库的载玻片图像的分割分组。将这些分组分为阳性对照组和阴性对照组，其中阳性对照组包含先前经确定为移植候选者的载玻片图像(即，合格分类)，而阴性对照组包含先前经确定不适合移植的载玻片图像(即，不合格分类)。
在分类阶段，对待分类的样品载玻片图像进行分析，以评估载玻片图像中的组织的效力。处理载玻片图像以准备分析。在一个实施例中，这包含将图像转换成二元图像。接下来执行功能检测。在一个实施方案中，从载玻片图像中提取苏木精通道(即，核)。确定所提取的通道的特征。基于所提取的通道的特征来生成特征指纹。在一个实施例中，特征指纹可以由上文图8所示的直方图表示。在另一个实施例中，根据所提取的通道的面积、周长、积分密度和圆度特征生成特征指纹。
然后可以将所生成的特征指纹与在训练阶段期间生成的阳性和阴性对照组的特征指纹进行比较。在一个实施例中，比较步骤包含将所生成的特征指纹与阳性和阴性对照组的特征指纹共聚类。
在共聚类后，可以执行统计学分析(例如，MANOVA)以评估所形成的群集，从而确定所生成的特征指纹群集是否以统计学上显著的方式与阳性或阴性对照组中的任何一个相关。如果统计学分析的结果表明缺乏统计学上显著的聚类或所生成的特征指纹与阴性对照组聚类，则认为载玻片图像未通过效力标准且可能与不合格分类相关联，或者可以对所述载玻片图像进行定性评估以进行处置。如果统计学分析的结果表明与阳性对照组的聚类，则认为载玻片图像已通过效力标准且可能与合格分类相关联。
下文图11是表示载玻片图像的示例分析的流程图。在一个实施例中，所述流程图由执行上述步骤的分类器实施。可以首先对载玻片图像进行评估，以确定该图像是否适合在分类步骤中进行分析。如果不适合，则排除所述载玻片图像，并将其确定为未满足分析的适宜性要求。如果载玻片图像满足必要的适宜性要求，则不排除所述载玻片图像并对其进行分析。所述分析包含上文讨论的图像处理、特征提取和聚类步骤中的至少一个。测试结果的结果可能导致确定载玻片图像的特征指纹是否与阳性对照组或阴性对照组之一聚类。如下文图11所示，如果与阳性对照组聚类，则认为载玻片图像符合效力标准，并因此可能与合格分类相关联。如果与阴性对照组聚类，则认为载玻片图像不符合效力标准，并因此可能与不合格分类相关联。
下表4描述了当将分类阶段应用于胸腺组织的载玻片图像库时，在实验实施例中来自阴性对照组和阳性对照组的载玻片图像的组织的相应定性特征。
表4
表5示出了阴性对照组(标记为阴性1-5)和阳性对照组(标记为阳性1-6)之间的对应特征。
表5
在一个实施例中，聚类基于载玻片图像内所有细胞的核的组成和特征。对于胸腺细胞，胸腺细胞可能是分析的一个重要因素，因为胸腺细胞占核的大部分。基于用于指纹的特征，髓质和皮质胸腺细胞对特征指纹的贡献不同。细胞群体的数量差异导致特征指纹的数量差异，从而导致聚类差异。胸腺细胞的组成描绘了组织的健康状况，因为组成的显著变化表明坏死、纤维化和总体降解。聚类将共享相似的指纹模式并因此共享其细胞群体的相似特征的样品分组。指纹统计学差异显著的样品图像将位于不同的组中。
所公开的用于定量分析和特征指纹生成的实施例使分类器能够检测细胞群体的转移，因为特征指纹评估了载玻片图像中的每个可检测核。在培养过程中，组织中胸腺细胞的总数应减少。然而，皮质与髓质胸腺细胞的相对比例应保持一致。这些比例的显著变化可能表明组织降解不均匀或效力下降。随着定量特征指纹的转移，将检测到细胞群体的显著变化。皮质髓质胸腺细胞比率的显著变化(增加或减少)将导致特征指纹向阴性对照组转移，因此样品将与阴性对照样品聚类。
图12A-12D是预示性实例，其可以示出基于胸腺组织的载玻片图像的某些提取特征的示例特征指纹。图12A示出了在针对核的面积生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。图12B示出了在针对核的周长生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。图12C示出了在针对核的积分密度生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。图12D示出了在针对核的圆度生成的特征指纹方面与阳性和阴性对照组相关联的载玻片图像之间的差异。
图13示出了由将分类器示例性应用于与阴性对照组相关联的胸腺组织的示例载玻片图像和与阳性对照组相关联的胸腺组织的示例载玻片图像而得到的特征指纹。特征指纹(包含面积和积分密度特征的特征指纹)示出了阴性对照组载玻片图像和阳性对照组载玻片图像之间的皮质胸腺细胞的差异。
在本发明的优选实施例中，可以以下列示例性方式来执行对组织的未分类的载玻片图像进行定量组织病理学评估的方法以及训练组织分类器执行定量组织病理学评估的方法。
基于在植入期望的组织工程化产品之后构成性阳性临床结果的结果，为待检查的组织选择培养时间段。对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品，所述培养时间段允许组织通过将胸腺细胞从组织中洗出和/或通过凋亡来耗尽胸腺细胞。在整个培养时间内，基本上保持了经培养的胸腺组织中的TEC。
一种测定法检查了在培养的第5-9天之间采集的样品，以评估经培养的胸腺组织对于释放和可移植性的适宜性。为帮助更好地了解产品并更好地评估所述测定法的辨别能力，从第1天到第21天以及之后的时间取样，可以评估所述样品的数据以确定明显的趋势。
例如，可以检查一批临床培养的胸腺组织样品和降解的胸腺组织样品的组织病理学特征，如面积、周长、积分密度和圆度。检查了检测到的核的数量的总体趋势，预期随着胸腺细胞从组织中洗出或经历凋亡，这种趋势会随着时间的推移而减少。然后将这些数据针对组织面积进行归一化，因为在不同的日期检查了多个批次的不同切片。组织切片的大小在切片之间可能会有所不同，并且可能导致数据集中的变异性，但是随着培养天数的增加，可以看到总体呈负趋势，并且第10天左右的数据会出现可视变化。以前的数据表明，与细胞总数的减少相比，大多数胸腺细胞在培养期中更早地被耗尽。然后可以在时间进程研究中分析经培养的组织样品，以评估例如组织间的变异性。出于说明的目的，将描述用于评估胸腺组织间的变异性的过程。这将包含对胸腺上皮细胞和胸腺细胞的评估。将对在胸腺间变异性步骤中获得的数据进行分层聚类分析。将建立训练数据集，然后将对经培养的胸腺组织进行逐组分析。这些数据将与在组织的强制降解研究中获得的数据和/或通过将逐组测定结果与一组临床结果呈阴性的与不合格标本相关联的数据进行比较而获得的数据进行比较。
对于经培养的胸腺组织，组织的总体外观(并且因此，组织学载玻片)在所选培养期的进程中变化，例如，在第0天、第5天、第9天、第12天和第21天。同样，在经培养的胸腺组织的图示中，将胸腺细胞从经培养的胸腺组织中洗出。第5天、第9天、第12天和第21天的组织显示出积分密度的显著降低，并且轮廓更类似于胸腺上皮细胞的轮廓。在整个培养过程中，具有极高圆度的细胞的数量会随着时间而减少。这可能是由于细胞凋亡导致核的圆形程度降低以及非常圆形的胸腺细胞被洗出。对于第0天的圆度较低的样品，这可能是由于胸腺细胞的凝集，所述胸腺细胞被测量为圆度低于单个核的单个实体。在第0天，有很大比例的细胞具有高周长，这可能是由于在程序中将细胞块读取为单个形状而导致了较大的周长值。周长的增加很可能是胸腺细胞洗出和细胞在培养时间内经历凋亡的组合，以及由此事件导致的周长增加。总体而言，在整个培养时间的进程中，核特性与理论上对趋势的期望是一致的。数据中的大多数明显转移都在该批次预期的释放日期之前。这表明许多变化发生在培养的最初几天，此后环境可以维持长达21天。这支持了检测细胞群体中的真实趋势及其随时间变化的测定法。
检查了胸腺间变异性，以更好地了解胸腺之间的样品是否相似。胸腺间变异性可以通过与胸腺内变异性相似的方式进行评估，在这种情况下，所检查的样品来自一天，但评估不限于单个胸腺，所述评估包含多个批次的样品。可以计算每个样品到孤立数据集内所有样品的中心点的欧氏距离。然后对胸腺到中心的距离执行ANOVA。在第5天和第9天对样品执行这种分析。可以检查胸腺间变异性，以更好地了解胸腺之间的样品是否相似。每个胸腺每天产生百分之九十五的置信区间。仅对胸腺上皮细胞执行了更具体的分析，以帮助表征同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品。据推测，胸腺上皮细胞对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源产品的作用机制至关重要。病理学家为被识别为胸腺上皮细胞的细胞选择核。胸腺上皮细胞的核不同于组织群体中的其它细胞。TEC通常较大，并具有核仁，其在浅紫色外核的中心内显示为深紫色的点。然后从软件中提取已知的经标记的细胞作为单独的数据点。使用此数据，可以设计一个过滤器使得以下步骤可以按顺序执行。在缀合的细胞分裂之前和分裂之后，两个大小过滤器均可移除大小范围窗口之外的任何细胞。进行了以下过滤步骤。
通过定义最暗像素以下的包含阈值，将最暗的细胞从数据集中移除。然后移除面积小于50μm
计算组之间的距离。距离是组之间相似性的量度。计算加入两个组的成本。此处成本是加入这些组会增加多少错误。加入合并成本最低的组。重复该过程，直到将所有数据合并为一组为止。所得数据集实质上示出了样品彼此之间“相关”或相似程度的族谱。分支之间的高度显示了两组彼此之间的相关程度。在绘制图形时，水平x轴上的距离并不表示任何更紧密的关系。每组中的样品在统计学上被认为是相似的，而不同组中的样品在统计学上被认为是不同的。
为了确定切割高度在不同组之间的何处，可以使用Scree Plot来检查组之间的距离最显著的地方。这样可以确保样品之间的最小差异不会过度影响算法。差异太小将导致将来的样品更有可能分裂成独立的组，因为样品必须非常相似才能聚类在一起，而这对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品来说是不现实的。可替代地，组必须有适当的界限以确保样品之间有区别。对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品，由于组织的性质和批次之间的变异性，很可能会产生异质性。通过检查显示先前阳性临床结果(此处定义为生存率)的样品，并将其与已降解的组织进行比较，可以确定适当的差异化水平。
可以选择含有与临床结果有关的最多信息的训练集。最初，样品来自各种代表性R&D研究以及多种强制降解条件和临床样品。这些数据可以被聚类为良好组和不良组。如果训练集被限制为已知的“良好”和“不良”样品(代表将来待进行批次释放检查的过程中样品)，则该训练集可以被视为是最有用的。该步骤以以下方式限制样品。
如果样品并非来自培养期的中点或第5-9天，则可以将其移除。在同种异体经培养的胸腺组织来源的组织的实例中，这是当可以采集基于定量组织学的用于批次释放的过程中样品时。如果样品来自被认为具有代表性的R&D批次，但没有相关的临床结果需要检查，则也可以将其移除。此外，如果样品与阴性临床结果相关联，则可以将其移除。如果正交方法无法确认降解，则也可以从强制降解臂中移除样品。
可以对基础数据进行分组，以更好地理解哪些基础特征导致了各种群集。组可能与阳性临床结果相关联，而强制降解的样品和/或组织与阴性临床结果相关联。不同的参数可能会驱动具有阳性临床结果(例如中等大小的面积、高圆度和高周长)的组与强制降解的样品和/或阴性临床结果有差异。
例如，一个组的特征可能是较大比例的周长较大、积分密度较高、面积较高而圆度较低的核。这可能是由于存在无法通过软件读取为独立细胞的核块。这很可能发生在培养初期的胸腺细胞数量仍然较多的组织中。
可以定义具有阳性临床结果的另外的组。例如，当与其它组和/或中等范围的积分密度相比时，可以通过具有大量具有高圆度值和/或较高面积的细胞来指定组。这些值是针对培养期中期的健康活组织预期的。可以根据数据构建面积、圆度、积分密度和周长的测量结果的直方图。
为进行比较，可以进行强制降解研究，在所述研究中，将样品放回胸腺器官培养基(TOM)中，然后在第5天和第9天移除样品。这表明了同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品对工艺条件的变化有多困难。并非所有的培养条件都可以通过所使用的任何一种量度来检测到降解。据信，这些条件不会将组织永久性破坏到不能起作用或不能存活的程度。如针对经降解的样品所预期的那样，存在较大比例的圆度较低、面积较小且周长较高的细胞。这表明细胞不再能够保持生存力，因此细胞形态发生了变化，并随着皱缩的边缘而收缩。为了显示组内的相似性，检查了每个组的变异性分析；可以确定“良好”和“不良”(合格与不合格)分类。使用上述步骤，可以评估与合格和不合格特性相关联的组织标本的分析。
同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品(例如，“RVT-802”)通常在植入受体之前12到21天进行培养。历史上证明，该培养时间段在植入组织工程化产品后可产生阳性临床结果。不受理论的束缚，据信，该培养时间段允许组织通过将胸腺细胞从组织中洗出或通过凋亡来耗尽胸腺细胞。胸腺上皮细胞在整个培养时间内得以维持。
经验证的测定法检查了在培养的第5-9天之间采集的样品，以评经估培养的胸腺组织对于释放的适宜性。为帮助更好地了解产品并更好地评估所述测定法的辨别能力，将从第1天到第21天以及之后采集的样品通过软件程序运行，并将所得数据进行相互比较以评估明显的趋势。
图14A-14D描绘了三批临床经培养的胸腺组织样品(图14A-14C)和经降解的胸腺组织样品。图14A中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝11.34；圆度＝0.696；周长＝14.310并且积分密度＝1889.2。图14B中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝11.41；圆度＝0.993；周长＝11.982并且积分密度＝1912.4。图14C中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝10.53；圆度＝0.846；周长＝12.510并且积分密度＝1707.4。图14D中所描绘的样品的四个特征面积、周长、积分密度和圆度是：面积＝13.0；圆度＝0.352；周长＝21.556并且积分密度＝1786.0。每个图像中的单个核由一个圆圈标识。
还检查了检测到的核的数量的总体趋势，随着胸腺细胞从组织中洗出或经历凋亡，预期这种趋势会随着时间的推移而减少，如图15所示。将这些数据针对组织面积进行了归一化，因为在不同的日期检查了多个批次的不同切片；切片之间的组织切片大小可能会有所不同，并可能导致数据集中的变异性，但是随着培养天数的增加，通常会出现负向趋势，并且第10天左右的数据会出现可视变化。以前的数据表明，与细胞总数的减少相比，大多数胸腺细胞耗竭出现在培养期中更早的时候，如下所示。
组织的总体外观(并且因此，组织学载玻片)在培养期的进程中变化。图16A-B、17A-B、18A-B、19A-B和20A-B中显示的图像示出了在不同时间间隔(即第0天、第5天、第9天、第12天和第21天)，H&E染色的载玻片中经培养的胸腺组织的外观差异。以40倍放大率显示图像。从制造过程的角度来看，为这些图像选择的日期和进一步分析的日期均已被确定为重要的日期。第0天表示进入的组织。在第0天进行组织学检查是为了进行身份识别。对第0天和第5-9天的组织学样品进行福尔马林固定，并送至病理实验室进行石蜡包埋和切片。将切片染色并由委员会认证的病理学家评估。
图21A-21E是在第0天、第5天、第9天、第2天和第21天的H&E染色的经培养的胸腺组织的图像，其描绘了在第0天、第5天、第9天、第12天和第21天的核外观变化。图21A示出了具有较高积分密度的高比例的核，这表明胸腺细胞数量高。当从组织中洗去胸腺细胞时，第5天(图21B)、第9天(图21C)、第12天(图21D)天和第21天(图21E)的组织显示出积分密度的显著降低，并且轮廓更类似于胸腺上皮细胞的轮廓。
图22示出了来自同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品的技术批次的积分密度测定结果的时间进程。当从组织中洗去胸腺细胞时，第5天的组织显示出积分密度的显著降低，并且轮廓更类似于胸腺上皮细胞的轮廓。误差条是均值的一个标准差。
图23示出了圆度的测量值。在整个培养过程中，具有极高圆度的细胞的数量会随着时间而减少。这可能是由于细胞凋亡导致核的圆形程度降低以及非常圆形的胸腺细胞被洗出。对于第0天的圆度较低的样品，这可能是由于胸腺细胞的凝集，所述胸腺细胞被测量为圆度低于单个核的单个实体。误差条是均值的一个标准差。
图24示出了周长的测量值。在第0天，有很大比例的细胞具有高周长，这可能是由于在程序中将细胞块读取为单个形状而导致了较大的周长值。周长的增加很可能是胸腺细胞洗出和细胞在培养时间内经历凋亡的组合，以及由此事件导致的周长增加。误差条是均值的一个标准差。
图25示出了在考虑所检查的所有四个变量的情况下用于测量两个样品之间的相似度的欧氏距离(样品与大质心之间的误差总和的平方根)。作为参考，欧氏距离越小，两个样品彼此之间越相似。误差条是均值的一个标准差。
图26是数据的主要效果图和相互作用图。图26中所示的数据证实了经培养的胸腺组织随时间表现出相似的行为。
总体而言，在整个培养时间的进程中，核特性与理论上对趋势的期望是一致的。数据中的大多数明显转移都在该批次预期的释放日期之前。这表明许多变化发生在培养的最初几天，此后环境可以维持长达21天。这支持了检测细胞群体中的真实趋势及其随时间变化的测定法。
检查了胸腺间变异性，以更好地了解胸腺之间的样品是否相似。通过与胸腺内变异性相似的方式评估了胸腺间变异性，在这种情况下，所检查的样品来自一天，但评估不限于单个胸腺，其包含多个批次的样品。计算了每个样品到孤立数据集内所有样品的中心点的欧氏距离。然后对胸腺到中心的距离执行ANOVA。在第5天和第9天对样品执行了这种分析。
检查了胸腺间变异性，以更好地了解胸腺之间的样品是否相似。通过与胸腺内变异性相似的方式评估了胸腺间变异性，在这种情况下，所检查的样品来自一天，但评估不限于单个胸腺，其包含多个批次的样品。计算了每个样品到孤立数据集内所有样品的中心点的欧氏距离。然后对胸腺到中心的距离执行ANOVA。在第5天和第9天对样品执行了这种分析。
根据下表6，在第9天在批次之间没有可检测到的差异。在第5天，胸腺之间在统计学上存在细微的差异。很难确定这些差异是否产生导致产品质量差异的实际差异。为了以不同的方式对此进行评估，每个胸腺每天产生95％的置信区间。如图27所示，批次MFG-058在第5天不重叠其它组织的置信区间，但在第9天时重叠。该批次与其它批次相比具有代表性，并且在任一天的总体组织学检查中均未观察到差异。因此，这很可能是该方法对组织之间的核分布略有不同的敏感性的伪像。
表6
胸腺间变异性的ANOVA分析，通过胸腺到当天组的中心点执行分析
仅对胸腺上皮细胞执行了更具体的分析，以帮助表征同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品。据推测，胸腺上皮细胞对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源产品的作用机制至关重要。已将图像发送给病理学家。病理学家为被识别为胸腺上皮细胞的细胞选择了核(参见图28A-B)。胸腺上皮细胞的核不同于组织群体中的其它细胞。TEC通常较大，并具有核仁，其在图28A-B的浅紫色外核的中心内显示为深紫色的点。
从软件中提取了已知的经标记的细胞作为单独的数据点。使用此数据，设计了一个过滤器使得以下步骤可以按顺序执行。在缀合的细胞分裂之前和分裂之后，两个大小过滤器均可移除大小范围窗口之外的任何细胞。进行了以下过滤步骤。
通过定义最暗像素(包含介于100-130到150-180像素强度之间的像素，取决于染色强度)以下的包含阈值，从数据集中移除了最暗的细胞。
移除了面积小于50μm
将孔填满，将分水岭应用于分裂缀合的细胞。
将超出30-250μm
前述过滤器允许对具有生成并限制为表征TEC细胞的数据集的图像进行分析。在培养期间进程中检查组织中细胞的总比例时，TEC普遍增加。TEC的增加是因为随着将胸腺细胞从组织中洗出，剩余细胞中的大量是TEC。这种变化可以可视化在图30中：来自H&E载玻片的TEC与细胞总数的比率。这些测定结果还表明，TEC在整个培养期间都得到了维持，这是产品功效所必需的。当针对组织面积进行归一化时，可以看到相同的趋势，如图31所示。每天对一个样品进行数据分类并从分析集中提取TEC，并使其经历样品间变异性。
实施例3的TEC分析还给出了在整个培养期间胸腺细胞从组织中洗出的趋势的更好视图。对于胸腺细胞没有执行类似的分析，但是可以根据上述数据推断出，在培养进程期间，胸腺细胞的数量随着TEC比率的增加而减少。这种变化也可以在H&E染色的载玻片的图像中以多个放大率可视化(例如，参见图16到21)。这些图像中的胸腺细胞是较小的深紫色核。在图16A和16B的第0天图像中，胸腺细胞很多，并且到第5天，胸腺细胞显著减少，如图17A和17B所示。在许多病理学报告以及胸腺细胞标志物L-选择素(REP-016)的细胞因子和趋化因子分析中已经注意到了这一点。总体数据趋势也与使用前面讨论的定量分析的此测定法相吻合。
实例1-4中显示的数据示出了如图32所示分成4组的样品。图32中描绘的组是通过分层聚类分析生成的。所述分析通过基于相似性对数据进行迭代分组来系统地和统计地识别具有相似特征的样品，从而得到具有相似特性的有意义的数据群集(被称为“组”)。用于对细胞进行分组的过程需要以下步骤：
计算组之间的距离。距离是组之间相似性的量度。
计算加入两个组的成本。此处成本是加入这些组会增加多少错误。
加入合并成本最低的组。
重复该过程，直到将所有数据合并为一组为止。
所得数据集实质上示出了样品彼此之间“相关”或相似程度的族谱。分支之间的高度显示了两组彼此之间的相关程度。水平x轴上的距离并不表示任何更紧密的关系。有关于此的说明，请参见图32。图32是聚类树状图，其示出了第“C”组和第“D”组之间的距离作为实例。突出显示的绿色框和红色框表示单个分组。这基于0.43的截止y轴高度。在此实例中，第C组和第D组的距离为0.6，并且因此被视为两个单独的组。每组中的样品在统计学上被认为是相似的，而不同组中的样品在统计学上被认为是不同的。
为了确定切割高度在不同组之间的何处，可以使用Screen Plot来检查组之间的距离最显著的地方。这样可以确保样品之间的最小差异不会过度影响算法。差异太小将导致将来的样品更有可能分裂成独立的组，因为样品必须非常相似才能聚类在一起，而这对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品来说是不现实的。可替代地，组必须有适当的界限以确保样品之间有区别。对于同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品，由于组织的性质和批次之间的变异性，很可能会产生异质性。通过检查显示先前阳性临床结果(此处定义为生存率)的样品，并将其与已降解的组织进行比较，可以确定适当的差异化水平。
在优选的实施例中，选择了含有与临床结果有关的最多信息的训练集。最初，样品来自各种代表性R&D研究以及多种强制降解条件和临床样品。这导致了一个包含许多良好组和不良组的聚类分析(参见图33)。在对所述测定法进行进一步开发之后，经决定，如果训练集被限制为已知的“良好”和“不良”样品(代表将来待进行批次释放检查的过程中样品)，则认为该训练集将提供最多的信息。这以以下方式限制样品。
如果样品并非来自培养期的中点或第5-9天，则将其移除。在这种情况下，将采用基于定量组织学的用于批次释放的过程中样品。
如果样品来自被认为具有代表性的R&D批次，但没有相关的临床结果需要检查，则将其移除。
如果样品与阴性临床结果相关联，则将其移除。根据使用中的定性组织学测定法，这些样品从设施中释放后，被认为并非是“不良”的，并且在任何情况下都不认为批次本身是临床结果的原因。这些案例被移除，因为没有确切的证据证明它们确实起作用。
如果正交方法无法确认降解，则从强制降解臂中移除样品。这些样品(以及进行了细胞因子和趋化因子检查的用过的培养基样品)由病理学家进行检查，并且通过另一种方法未被确认为“不良”的任何样品均被排除在最终训练集之外。已显示，同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品在各种条件下均具有抵抗力，并且分析不应偏向于检测仍然可能导致“良好”组织的案例。分析集中保留的条件来自在-20℃下冷冻的样品，或为10XPBS替代培养基的样品。有关降解条件和结果的完整列表，请参见表7。
表7
通过三种方法分析强制降解的组织
最终训练集中使用的其余样品是来自显示1年生存率的临床病例的样品，或来自经确认为降解的R&D组织的病例的样品。所得群集描绘于图33中。
最初产生了五个群集，四个群集具有临床上良好的样品，一个群集具有经确认的不良样品。良好群集中的一个群集只含有两个样品；所述样品自身内部不具有高变异性，因此会导致对模型的杠杆作用，从而导致转移。因此，当要检查新样品时，这两个样品将更有可能导致其它群集来回移动，以允许将这些样品适当地分组。为了测试这一点，检查了每个样品的系统移除和随后的重新聚类。已经发现，如果分离出这些样品中的任一个，将导致所得样品转移。因此，移除了这些样品。已确定，尽管这可能会导致类似于这两个组织的另外的样品独立地聚类，但总体结果将是一个更强大的算法和训练集，以进行比较。这些样品可以与将来的样品结合使用，以便以后在可以扩展数据集时重新评估存储桶。在软件中验证的最终训练库如图34所示。
检查了图34中描绘的四个组的基础数据，以尝试并更好地理解哪些基础特征导致了各种群集。将这些组称为第1组、第2组、第3组和第4组。上图32中的树状图已映射了哪个组名称属于每个群集，但作为另外的参考，第1组、第2组和第3组来自具有阳性临床结果的样品而第4组由强制降解的样品构成。来自每个组的组织的代表性图像显示在图35A-35D中。图35A-35D描绘了最终样品库中每个群集组的代表性图像。第1组(图35A)、第2组(图35B)和第3组(图35C)由具有阳性临床结果的样品构成。第4组(图35D)由经确认已降解的样品构成。第1组样品来自LOT-345，第2组样品来自LOT-160，第3组样品来自LOT-194，并且第4组样品来自FD.SP17-40348-C1.1(降解方法：在-20℃下冷冻)。
在图36A-36D中示出了彼此相邻的所有群集的图形表示。图36A是基于面积测定结果的数据群集的图形表示。图36B是基于圆度测定结果的数据群集的图形表示。图36C是基于积分密度测定结果的数据群集的图形表示。图36D是基于周长测定结果的数据群集的图形表示。
图36A-36D描绘了最终样品库中每个群集组的代表性图像。第1组、第2组和第3组由具有阳性临床结果的样品构成。第4组由经确认已降解的样品构成。第1组样品来自LOT-345，第2组样品来自LOT-160，第3组样品来自LOT-194，并且第4组样品来自FD.SP17-40348-C1.1(降解方法：在-20℃下冷冻)。
从图36A-36D中绘制的数据可以看出，不同的参数驱动具有阳性临床结果(例如中等大小的面积、高圆度和高周长)的组的差异化。强制降解的样品在许多方面也与其它组明显不同，如图中红色条所示。该数据表明存在多个可产生良好临床结果的数据集。样品可能通过其它方式看起来良好或不良，所述样品当前未在数据集中捕获，因此无法以任何组聚类在一起。
第1组。第1组是最大的群集。其由19个不同的组织构成，具有阳性临床结果。第1组的特征是较大比例的周长较大、积分密度较高、面积较高而圆度较低的核。这可能是由于存在无法通过软件读取为独立细胞的核块。这很可能发生在培养初期的胸腺细胞数量仍然较多的组织中。进行盲法研究时，来自第0天组织的样品聚类成第1组，从而为上述理论提供了支持。尽管所述测定法似乎不会排斥存在大量胸腺细胞的组织，但在培养期末植入时，第1组中的样品具有阳性临床结果。
图37是第1组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
图38是描绘第1组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图39是描绘第1组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图40是描绘第1组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图41是描绘第1组中的细胞的周长测量结果的直方图。
第2组。
第2组含有10批具有阳性临床结果的组织。第2组和第3组都具有很大比例的圆度高的细胞。与第3组和第4组相比，第2组似乎具有面积更大的细胞，并且具有中等范围的积分密度。这些值是针对培养期中期的健康活组织预期的，如通过来自第2组的样品所示。面积、圆度、积分密度和周长的测量结果的直方图显示在图43-46中。
图42是第2组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
图43是描绘第2组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图44是描绘第2组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图45是描绘第2组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图46是描绘第2组中的细胞的周长测量结果的直方图。
第3组。
第3组由6个显示出阳性临床结果的批次构成。像第2组一样，第3组中很大比例的细胞都具有高圆度，这显示出胸腺细胞和整体细胞生存力。第3组中面积最小且在较低的积分密度范围内(第2和第3个选区)的细胞的比例最高。
图47是第3组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
面积、圆度、积分密度和周长的测量结果的直方图显示在图48-51中。
图48是描绘第3组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图49是描绘第3组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图50是描绘第3组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图51是描绘第3组中的细胞的周长测量结果的直方图。
第4组。
第4组由4个强制降解的样品构成。此处显示的降解条件适用于在-20℃下冷冻4小时的样品，以及用10X PBS替代培养基24小时的样品。根据定性组织学，这两种情况均显示出明显的降解，并且当检查CCL21(TEC健康的生物标志物)时，这两种情况均发生了显著变化。下文包含了列出所有强制降解的条件以及每种方法的结果的表。
图52是第4组的图像，其中突出显示了面积-10(红色)、圆度-0.9(绿色)、周长-18(蓝色)和积分密度-1500(黄色)内的特征。这些组通常在组之间显示最大的差异。
面积、圆度、积分密度和周长的测量结果的直方图显示在图53-56中。
图53是描绘第4组中的细胞的面积测量结果的直方图。
图54是描绘第4组中的细胞的圆度测量结果的直方图。
图55是描绘第4组中的细胞的积分密度测量结果的直方图。
图56是描绘第4组中的细胞的周长测量结果的直方图。
实例8：强制降解研究。
进行了强制降解研究，在所述研究中，将样品放回胸腺器官培养基(TOM)中，然后在第5天和第9天移除样品。这表明了同种异体经培养的出生后胸腺组织来源的产品对工艺条件的变化有多困难。有趣的是，传统的组织学方法无法检测到将样品加热至55℃。这可能是因为从组织病理学的角度上加热组织基本上将组织固定。然而，通过CCL21分析，降解是明显的。许多测试条件都无法通过所使用的任何一种量度来检测到降解。据信，这些条件未将组织永久性破坏到不能起作用或不能存活的程度。存在过程控制以确保产品绝不会暴露于上述条件中的任何一种条件下。如针对经降解的样品所预期的那样，存在较大比例的圆度较低、面积较小且周长较高的细胞。这表明细胞不再能够保持生存力，因此正在改变细胞形态，并随着皱缩的边缘而收缩。此项研究的强制降解条件显示在表7中。
为了显示组内的相似性，检查了每个选区的变异性分析。第4组通常在其中所有样品的选区中显示最高的标准差。这可能是由于该组内的样品较少，但这对于组织来说也不是意外的，因为所述样品降解得不太均匀(参见图57)。
图57是在组之间和在组内基于逐个选区的变异性分析的绘图。数据在x轴上首先按组显示，然后按参数选区显示。每个参数的顶部图形是个体，而底部是该组的标准差。两者都可以用于将数据的传播可视化。
缩写：
AE1/AE3：与所有细胞角蛋白反应以识别上皮细胞的2种抗体的混合物。
CD3：与T细胞(包含胸腺细胞)反应的抗体。CK14：一种仅检测细胞角蛋白14(被认为具有再增殖潜力的上皮细胞子集中的细胞骨架成分)的抗体。
FFPE：福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片。
H&E：苏木精和曙红，一种组织学染色，最常用于哺乳动物组织切片的光学显微镜检查。
Ki-67：识别Ki-67抗原(与细胞增殖相关联的蛋白质)Ki-67抗体。
TEC：胸腺上皮细胞。
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前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践实施例。前述描述和实例详述了某些实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，实施例可以以多种方式实践，并且应该根据所附权利要求和其任何等同物来解释。
参考文献
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机译： 通过定量组织分析测定组织效力测定
机译： 通过定量组织分析测定组织效力测定
机译： 通过定量组织分析测定组织效力测定
