作为立体限定的寡核苷酸合成中的活化剂的吡啶鎓盐

摘要

本发明涉及使用吡啶鎓的酸盐作为偶联活化剂来制备具有高收率的立体限定的硫代磷酸寡核苷酸、尤其是锁定的立体限定的硫代磷酸寡核苷酸的方法。

说明书

本发明涉及用于制备立体限定的寡核苷酸的新方法。

在过去的几十年中，使用合成的寡核苷酸作为治疗剂已取得了令人瞩目的进展，导致通过多种机制起作用的分子的开发，包括激活RNase H的gapmer、剪接转换寡核苷酸，microRNA抑制剂、siRNA或适体(S.T.Crooke,Antisense drug technology:principles,strategies,and applications,第2版.编辑，Boca Raton,FL:CRC Press,2008)。

LNA(锁核酸)单体的合成首先由Wengel等人报道(Singh,S.K.；Nielsen,P.,Koshkin,A.A.和Wengel,J.Chem.Commun.,1998,455。

Nathsuhisa Oka等人在Org.Lett.,第11卷,第4期,2009中描述了硫代磷酸寡核苷酸的合成。Oka等人描述的合成在固体支持物上测试不同的偶联活化剂而进行。Oka等人证实，N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐为最佳活化剂。遗憾的是，Oka等人未探究立体限定的硫代磷酸修饰的寡核苷酸或例如锁核酸(LNA)的合成。

MaoJun Guo等人在Bioorg.Med.Chem.Lett.8(1998)2539-2544中描述了使用1H-四唑作为活化剂合成2’-O-甲基-硫代磷酸寡核苷酸。遗憾的是，Guo等人未提供合成立体限定的硫代磷酸寡核苷酸的指导。

综述文献表明，对于立体限定的修饰的寡核苷酸的合成仍然很少见。然而，发明人认为，立体限定的寡核苷酸将产生具有更好的药理学特性的寡核苷酸。根据其化学结构，寡核苷酸固有地具有许多立体中心，尤其是在其核苷间键合的磷酸原子上。这些立体中心意味着给定的寡核苷酸实际上是寡核苷酸立体异构体的混合物。发明人已经观察到，通过选择混合物中具有比其他异构体更好的药理学特性的那些立体异构体，可以改善给定的寡核苷酸立体异构体混合物的药理学特性。因此，发明人对合成和/或选择具有比其他异构体更有利的药理学性质的立体异构体感兴趣。

然而，尽管进行了各种尝试以进一步合成寡核苷酸，但仍需要合成立体限定的硫代磷酸寡核苷酸，尤其是具有高收率的立体限定的锁定的硫代磷酸寡核苷酸，例如LNA(锁核酸)。

发明人惊讶地发现了使用吡啶鎓的酸盐作为偶联活化剂以高收率制备立体限定的硫代磷酸寡核苷酸、尤其是锁定的硫代磷酸寡核苷酸的新方法。在下文中将概述本发明的方法相对于现有技术的进一步的关键改进。

发明概述

在一个方面，本发明涉及使用吡啶鎓的酸盐作为偶联活化剂制备具有相对高收率的立体限定的硫代磷酸寡核苷酸、尤其是锁定的立体限定的硫代磷酸寡核苷酸的方法。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含吡啶鎓的酸盐活化剂、溶剂和用于使用吡啶鎓的酸盐活化剂制备立体限定的硫代磷酸寡核苷酸的单体。

在另一个方面，本发明涉及吡啶鎓的酸盐作为偶联活化剂在制备修饰的立体限定的硫代磷酸寡核苷酸中的用途。

定义

术语“烷基”单独地或以组合方式表示具有1至8个碳原子的直链或支链烷基，特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C

术语“环烷基”单独地或以组合方式表示具有3至8个碳原子的环烷基环，尤其是具有3至6个碳原子的环烷基环。环烷基的实例是环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基，更特别是环丙基和环丁基。“环烷基”的具体实例是环丙基。

术语“烷氧基”单独地或以组合方式表示式烷基-O-的基团，其中术语"烷基"具有上文所给出的含义，例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基。具体的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基为“烷氧基烷氧基”的具体实例。

术语“氧基”单独地或以组合方式表示-O-基团。

术语“烯基”单独地或以组合方式表示包含烯键和至多8个、优选至多6个、特别优选至多4个碳原子的直链或支链烃基。烯基的实例是乙烯基，1-丙烯基，2-丙烯基，异丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基和异丁烯基。

术语“炔基”单独地或以组合方式表示包含叁键和最多8个、尤其是2个碳原子的直链或支链烃基。

术语“卤素”或“卤代”单独地或以组合方式表示氟、氯、溴或碘，特别是氟、氯或溴，更特别是氟。术语“卤代”与另一基团结合表示所述基团被至少一个卤素，特别是1-5个卤素，特别是1-4个卤素，即1、2、3或4个卤素取代。

术语“卤代烷基”单独地或以组合方式表示被至少一个卤素，特别是被1-5个卤素，特别是1-3个卤素取代的烷基。卤代烷基的实例包括一氟-、二氟-和三氟-甲基、-乙基或-丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。氟甲基、二氟甲基和三氟甲基为具体的“卤代烷基”。

术语“卤代环烷基”单独地或以组合方式表示如上所定义的被至少一个卤素，特别是1-5个卤素，特别是1-3个卤素取代的环烷基。“卤代环烷基”的具体实例是卤代环丙基，特别是氟环丙基、二氟环丙基和三氟环丙基。

术语“羟基”单独地或以组合方式表示-OH基团。

术语“硫醇基”和“巯基”单独地或以组合方式表示-SH基团。

术语“羰基”单独地或以组合方式表示-C(O)-基团。

术语“羧基”单独地或以组合方式表示-COOH基团。

术语“氨基”单独地或以组合方式表示伯氨基(-NH

术语“烷基氨基”单独地或以组合方式表示被一个或两个如上所定义的烷基所取代的如上所定义的氨基。

术语“磺酰基”单独地或以组合方式是指-SO

术语“亚磺酰基”单独地或以组合方式表示-SO-基团。

术语“硫烷基”单独地或以组合方式表示-S-基团。

术语“氰基”单独地或以组合方式表示-CN基团。

术语“叠氮基”单独地或以组合方式表示-N

术语“硝基”单独地或以组合方式表示NO

术语“甲酰基”单独地或以组合方式表示-C(O)H基团。

术语“氨基甲酰基”单独地或以组合方式表示-C(O)NH

术语“脲基”单独地或以组合方式表示-NH-C(O)-NH

术语“芳基”单独地或以组合方式表示包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环或双环系统，其任选地被1-3个独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基的取代基所取代。芳基的实例包括苯基和萘基，特别是苯基。

术语“杂芳基”单独地或以组合方式表示由5至12个环原子组成的单价芳族杂环单环或双环系统，其包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，其余的环原子为碳，其任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂卓基、二氮杂卓基、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、咔唑基或吖啶基。

术语“杂环基”单独地或以组合方式表示4至12、特别是4至9个环原子的单价饱和或部分不饱和的单环或双环系统，其包含1、2、3或4个选自N、O和S的环杂原子，其余的环原子为碳，其任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。单环饱和杂环基的实例是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、1,1-二氧代-硫吗啉-4-基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧杂氮杂环庚烷基。双环饱和杂环烷基的实例是8-氮杂-双环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛基、9-氮杂双环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂双环[3.3.1]壬基或3-硫杂-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基。部分不饱和的杂环烷基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢-噁唑基、四氢-吡啶基或二氢吡喃基。

术语“甲硅烷基”是指-SiH

术语“药学上可接受的盐”是指保留了游离碱或游离酸的生物学有效性和性质的那些盐，它们在生物学上或其他方面都不是不期望的。所述盐是由无机酸和有机酸形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，特别是盐酸；所述有机酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰半胱氨酸。另外，这些盐可以通过将无机碱或有机碱加到游离酸中来制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下碱的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺树脂。本发明的寡核苷酸也可以两性离子的形式存在。本发明特别优选的药学上可接受的盐是钠、锂、钾和三烷基铵盐。

术语“保护基”单独地或以组合方式表示这样的基团，其选择性地阻断多官能化合物中的反应位点，从而可在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应。保护基可以除去。示例性的保护基是氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。

“磷酸酯保护基”为磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的实例为2-氰基乙基和甲基。磷酸酯保护基的具体实例为2-氰基乙基。

“羟基保护基”为羟基保护基并且也用于保护硫醇基。羟基保护基的实例为乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或二-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对-甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)的醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基的具体实例为DMT和TMT，特别是DMT。

“硫醇基保护基”为硫醇基基团的保护基。硫醇基保护基的实例为“羟基保护基”的那些。

如果本发明的起始原料或化合物之一包含一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或具有反应性的官能团，则应在使用本领域众所周知的方法的关键步骤之前引入适当的保护基(例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts在“Protective Groups inOrganic Chemistry”第3版,1999,Wiley,New York中所述)。可以使用文献中描述的标准方法在合成的后期去除此类保护基。保护基的实例是叔丁氧基羰基(Boc)，氨基甲酸9-芴基甲基酯(Fmoc)，氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基乙酯(Teoc)，苄氧羰基(Cbz)和对甲氧基苄氧羰基(Moz)。

本文所述的化合物可以包含几个不对称中心，并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物(例如外消旋体)、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体的混合物的形式存在。

寡核苷酸

如本文所用，将术语“寡核苷酸”定义为技术人员通常理解为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这种共价结合的核苷也可以称作核酸分子或寡聚体。通常在实验室中通过固相化学合成、然后纯化来制备寡核苷酸。当提及寡核苷酸的序列时，涉及共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分的序列或顺序，或其修饰物。本发明的寡核苷酸是人造的并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。

反义寡核苷酸

如本文所用，将术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同的寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要内部或链间自我互补性的程度低于寡核苷酸全长的50％即可。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸的区域。该术语在本文中与术语“连续的核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可以互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，例如F-G-F'gapmer区，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可用于使官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可以与靶核酸互补或可以不与之互补。

核苷酸

核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸例如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以互换地称作“单元”或“单体”。

修饰核苷

如本文所用，术语“修饰核苷”或“核苷修饰”是指通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而与等效的DNA或RNA核苷相比被修饰的核苷。在一个优选的实施方案中，修饰核苷包含修饰的糖部分。术语修饰核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称作DNA或RNA核苷。如果它们允许沃森-克里克碱基配对，则通常仍将在DNA或RNA核苷碱基区域中具有修饰的核苷称作DNA或RNA。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，它们在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在本文背景下，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤、以及非天然存在的变体。此类变体例如在Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页，和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1中描述。

在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶来修饰核碱基部分，例如取代的嘌呤或取代的嘧啶，例如选自下述的核碱基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑基(thiozolo)-胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑基尿嘧啶、2-巯基尿嘧啶、2'-巯基胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。

核碱基部分可以由用于每个相应的核碱基的字母代码，例如A、T、G、C或U表示，其中每个字母可以任选地包括等同功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmer，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

5’-羟基保护的核苷

核苷的常规化学命名如下所示。在表述“5’-羟基保护的核苷”中，其所指的5’位置如下所示，其中PGO为羟基保护基，且B为核碱基。

应当理解，以上表示仅用于示例5'位置的目的。许多不同的核苷落入表述“5’-羟基保护的核苷”范围，包括本文所述的修饰核苷，例如糖-修饰的核苷。

修饰的寡核苷酸

术语修饰的寡核苷酸描述包含一个或多个糖-修饰核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸为文献中用于描述具有修饰核苷的寡核苷酸的术语。

立体限定的寡核苷酸

立体限定的寡核苷酸为寡核苷酸，其中核苷间键的至少一个为立体限定的核苷间键。

立体限定的硫代磷酸寡核苷酸为寡核苷酸，其中核苷间键的至少一个为立体限定的硫代磷酸核苷间键。

互补性

术语“互补性”描述核苷/核苷酸的沃森-克里克碱基配对的能力。沃森-克里克碱基配对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可以包含带有修饰的核碱基的核苷，例如5-甲基胞嘧啶通常被用来替代胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的沃森-克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页，和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1)。

如本文所用，术语“互补性％”是指在给定位置上与在另外的核酸分子(例如目标核酸)的给定位置上的连续核苷酸序列互补(即，形成沃森-克里克碱基配对)的核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中的核苷酸比例。通过计数两个序列之间形成配对的比对碱基数(当比对目标序列5'-3'和寡核苷酸序列的3'-5'时)、除以寡核苷酸中的核苷酸的总数并且乘以100来计算百分比。在这种比较中，未匹配(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称作错配。优选地，在计算连续核苷酸序列的互补性的百分比时不允许插入和缺失。

术语“完全互补”是指100％互补性。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指在给定位置上与在另外的核酸分子(例如目标核酸)的给定位置上的连续核苷酸序列相同(即，其与互补核苷形成沃森-克里克碱基对的能力)的核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中以百分比表示的核苷酸数目。通过计数两个序列之间相同的比对碱基数、除以寡核苷酸中的核苷酸总数再乘以100来计算百分比。同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区长度。优选地，在计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。

杂交

如本文所用，术语“杂交”应理解为在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体的两条核酸链(例如寡核苷酸和目标核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。它通常用解链温度(T

糖修饰

本发明的寡聚体可以包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷，即当与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时糖部分的修饰。

已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，其主要目的是改善寡核苷酸的某些特性，例如亲和力和/或核酸酶抗性。这种寡核苷酸称作糖修饰的核苷酸。

所述修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些，例如用己糖环(HNA)或双环替代，它们通常在核糖环上的C2与C4碳之间具有双基团桥(LNA)，或未连接的核糖环，其通常在C2与C3碳之间缺乏键(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如双环己糖核酸(WO 2011/017521)或三环核酸(WO 2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为非氢的基团或改变DNA和RNA核苷中天然存在的2'-OH基团而进行的修饰。例如，可以在2’、3’、4’或5’位引入取代基。

2’糖修饰的核苷

2’糖修饰的核苷为核苷，其在2'位上具有除H或-OH以外的取代基(2’取代的核苷)或包含能够在核糖环的2'碳与另一个碳之间形成桥连的2'连接的双基，例如LNA(2’-4’双基桥连的)核苷。

实际上，人们已经很关注开发2'修饰的核苷，并且发现许多2'修饰核苷在掺入寡核苷酸时都具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加寡核苷酸对核酸酶的抗性。2'取代的修饰核苷的实例是2'-O-烷基-RNA，2'-O-甲基-RNA，2'-烷氧基-RNA，2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)，2'-氨基-DNA，2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。进一步的实例可在例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213，以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937中找到。以下是一些2'取代的修饰核苷的示例。

其中上述结构中的“Base”是指碱基。

与本发明相关的是，2’修饰不包括2’桥连的分子如LNA。

锁核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”为2’-修饰核苷，其包含双基桥连所述核苷的核糖环的C2’和C4’(也称作“2’-4’桥”)，其限制或锁定了核糖环的构象。这些核苷在文献中也称作桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入寡核苷酸中用于互补RNA或DNA分子时，核糖构象的锁定与杂交亲和力增强(双链体稳定化)相关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度测定。

非限制性的示例LNA核苷公开在如下文献中：WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729，Morita等人Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76，Seth等人，J.Org.Chem.2010,第75卷(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人Nucleic Acids Research 2009,37(4),1225-1238。

所述2’-4’桥包含2-4个桥连原子，特别是具有式-X-Y-，Y连接至C4’，且X连接至C2’，

其中

X为氧、硫、-CR

Y为氧、硫、-(CR

条件是-X-Y-不为-O-O-、Si(R

J为氧、硫、＝CH

R

或两个孪位R

或两个孪位R

其中取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基是被1-3个独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基的取代基所取代的烷基、烯基、炔基和亚甲基；

X

R

n为1、2或3。

在本发明的另一个具体的实施方案中，X为氧、硫、-NR

在本发明的另一个具体的实施方案中，Y为-CR

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-(CR

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个实施方案中，R

有利地，-X-Y-的R

在本发明的另一个具体的实施方案中，R

在本发明的另一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CR

在一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH

所述2’-4’桥可以位于核糖环的平面下方(β-D-构型)，也可以位于环的平面上方(α-L-构型)，分别如式(A)和式(B)所示。

本发明的LNA核苷特别地具有式(B1)或(B2)

其中

W为氧、硫、-N(R

B为核碱基或修饰的核碱基；

Z为与相邻核苷或5'-末端基团的核苷间键；

Z*为与相邻核苷或3'-末端基团的核苷间键；

R

X、Y、R

在一个具体的实施方案中，在-X-Y-的定义中，R

在另一个具体的实施方案中，在X的定义中，R

在另一个具体的实施方案中，在Y的定义中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的另一个特别有利的实施方案中，R

在本发明的另一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-S-CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-NH-CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CR

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CHR

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CR

在本发明的另一个具体的实施方案中，-X-Y-为-S-CHR

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-C(＝CH

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-N(OR

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-N(R

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-N(CH

在本发明的一个具体的实施方案中，R

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-CR

在本发明的一个具体的实施方案中，-X-Y-为-O-CR

应当认识到，除非指定，否则所述LNA核苷可以为β-D或α-L立体亚型。

本发明LNA核苷的具体实例如方案1中所示(其中B如上所定义)。

方案1

具体的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA，例如(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和ENA。

RNase H活性和募集

反义寡核苷酸的RNase H活性是指当在与互补RNA分子的双链体中时其募集RNaseH的能力。WO01/23613提供了用于测定RNaseH活性的体外方法，其可以用于确定募集RNaseH的能力。典型地，认为寡核苷酸能够募集RNaseH，条件是当提供了互补靶核酸序列时，所述寡核苷酸具有在使用具有与所测试的修饰的寡核苷酸相同碱基序列、但仅包含在寡核苷酸所有单体之间具有硫代磷酸键的DNA单体的寡核苷酸，并使用WO01/23613(其通过引用并入本文)的实施例91-95提供的方法时所测定的初始速率的至少5％，例如至少10％或超过20％的初始速率(以pmol/l/min计)。为了用于测定RHase H的活性，可从Lubio ScienceGmbH,Lucerne,瑞士得到重组人RNase H1。

固定在固体支持物上的核苷

核苷的常规化学命名如下所示。在表述“固定在固体支持物上的核苷”中，核苷通常通过其3’位连接至固体支持物。

应当理解，以上表示仅用于说明核苷可以在什么位置连接至固体支持物的目的。许多不同的核苷涵盖于该表示形式的范围，包括修饰的核苷，例如糖修饰的核苷和具有如本文所述的羟基保护基团的核苷。

用于寡核苷酸合成的合适的固体支持物是本领域已知的。这些固体支持物的实例可在许多论文中找到，例如在Solid-Phase Supports for Oligonucleotide SynthesisCurrent Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)3.1.1-3.1.28中。

通过其3’位连接至式1a或1b的氧原子

核苷的常规化学命名法如下所示。在表述“通过其3'位连接至式1a或1b的氧原子”的表述中，其所指的3'位如下所示。

本文给出了如何与式1a或1b进行连接的非限制性示例，例如与式4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a、7b、8a、8b、8c、8d、9a、9b、9c、9d等。

应当理解，以上表示仅用于说明核苷可以在哪个位置连接至式1a或1b的单体的目的。许多不同的核苷涵盖于该表示形式的范围，包括修饰的核苷，例如糖修饰的核苷和具有如本文所述的羟基保护基团的核苷。

氧杂氮杂磷杂环戊烷(Oxazaphospholidine)

本发明的方法包含使氧杂氮杂磷杂环戊烷偶联至核苷或核苷酸上的步骤。立体中心是以L位，如式1a所示。在一些实施方案中，立体中心是以D位，如式1b所示：

如式1a所示，包含由R和R

当取代时，R可以被选自如下的基团取代：C

当取代时，R可以被选自如下的基团取代：被一个或多个C

在一些实施方案中，R选自芳基、杂芳基、取代的芳基、取代的杂芳基、硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、取代的甲硅烷基、砜、取代的砜(芳基取代的砜)、芴和取代的芴。

在一些实施方案中，R为被一个或多个C

在一些实施方案中，R选自芳基、杂芳基、取代的芳基和取代的杂芳基。

在一些实施方案中，R为芳基，例如苯基。

在一些实施方案中，当R为取代的芳基时，R可以被卤素取代，例如碘化物、氟化物、溴化物或氯化物，例如被卤素取代的苯基，例如碘化物、氟化物、溴化物或氯化物。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R为芳基，例如苯基，且R

在一些实施方案中，R为被一个或多个C

在一些实施方案中，R为芳基，例如苯基，且R

在一些实施方案中，R为:

其中G

在一些实施方案中，R为

其中G

在一些实施方案中，R为

其中G

在一些实施方案中，R

正交保护的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体

EP17163506.3(其通过引用并入本文)提供了氧杂氮杂磷杂环戊烷单体，其在氧杂氮杂磷杂环戊烷手性助剂上包含正交保护的胺基。在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体为正交保护的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体。

双环氧杂氮杂磷杂环戊烷单体

在一些实施方案中，单体为双环氧杂氮杂磷杂环戊烷单体，例如，在一些实施方案中，R

其中R、R

在一些实施方案中，R

上方的Z基团为核苷，其中核苷的3'氧为式1、1a、1b、2a或2b中所示的环外氧。在一些实施方案中，Z基团为LNA核苷部分。在一些实施方案中，Z基团为DNA核苷部分。因此，在一些实施方案中，本发明使用的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体可以表示为式3a或3b的化合物：

其中R、R

附图说明

图1描绘了一系列图：图1A、1B、1C、1D和1E，其基于超高效液相色谱-质谱串联分析。所述图显示了在本发明方法中使用各种偶联活化剂和溶剂使9-mer完全硫代磷酸化的DNA T寡核苷酸与L-DNA T单体偶联得到10-mer寡核苷酸后对粗物质的分析。

图2描绘了一系列图：图2A、2B和2C，其基于超高效液相色谱-质谱串联分析。所述图显示了在本发明方法中使用各种偶联活化剂和溶剂使15-mer完全硫代磷酸化的DNA T寡核苷酸与L-DNA T单体偶联得到16-mer寡核苷酸后对粗物质的分析。

图3描绘了一系列图：图3A、3B、3C和3D，其基于超高效液相色谱-质谱串联分析。所述图显示了在本发明方法中使用各种偶联活化剂和溶剂使15-mer完全硫代磷酸化的DNA T寡核苷酸与L-DNA T单体偶联得到16-mer寡核苷酸后对粗物质的分析。

图4描绘了一系列图：图4A、4B和4C，其基于超高效液相色谱-质谱串联分析。所述图显示了在本发明方法中使用各种偶联活化剂和溶剂使15-mer完全硫代磷酸化的DNA T寡核苷酸与LNA

图5描绘了一系列图：图5A和5B，其基于超高效液相色谱-质谱串联分析。所述图显示了在本发明方法中使用各种偶联活化剂和溶剂使15-mer完全硫代磷酸化的DNA T寡核苷酸与LNA

图6描绘了一系列图：图6A、6B、6C、6D和6E，其基于超高效液相色谱-质谱串联分析。所述图显示了在本发明方法中使用各种偶联活化剂和溶剂使15-mer完全硫代磷酸化的DNA T寡核苷酸与LNA

图7描绘了根据实施例和图1使用不同活化剂的理论偶联收率图。

图8描绘了使用本发明的偶联步骤合成寡核苷酸。

发明详述

在第一个方面，本发明涉及合成立体限定的、糖修饰的寡核苷酸的方法，包含下列步骤：将式(1a)或(1b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体:

其中Nuc为包含被保护的5’-羟基的核苷，并且通过其3’位连接至式1a或1b的氧原子；

R选自硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、砜、C

R

R

或者，R

与固定在固体支持物上的核苷偶联，其中该偶联在吡啶鎓的酸盐偶联活化剂存在下进行。

在另一个方面，本发明涉及用于合成立体限定的、糖修饰的寡核苷酸的方法，包含下列步骤：将式(1a)或(1b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体:

其中Nuc为包含被保护的5’-羟基的核苷，并且通过其3’位连接至式1a或1b的氧原子；

R选自硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、砜、C

R

R

或R

与固定在固体支持物上的核苷偶联，其中该偶联在吡啶鎓的酸盐偶联活化剂存在下进行。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂选自盐酸吡啶鎓盐、氢溴酸吡啶鎓盐、三氟乙酸吡啶鎓盐、三氟甲磺酸吡啶鎓盐和甲磺酸吡啶鎓盐。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1M的三氟甲磺酸吡啶鎓盐。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约0.3M的三氟甲磺酸吡啶鎓盐。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约1M的三氟甲磺酸吡啶鎓盐。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约0.05至约0.50M的氢溴酸吡啶鎓盐，例如约0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、045或0.50M。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约0.25M的氢溴酸吡啶鎓盐.

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约0.25至约1M的盐酸吡啶鎓盐，例如0.25、0.30、0.35、0.40、045、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95或1M。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂为约0.50M的盐酸吡啶鎓盐.

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂在选自乙腈、乙腈中的吡啶鎓、甲基咪唑及其混合物的溶剂中。

在本发明方法的一个实施方案中，吡啶鎓的酸盐偶联活化剂在乙腈中。

在本发明方法的一个实施方案中，本方法的式(1a)和(1b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体为:

其中R、R

在本发明方法的一个实施方案中，糖修饰选自以下的LNA糖修饰：

其中B为核碱基，且Z和Z*独立地为核苷酸。

在本发明方法的一个实施方案中，糖修饰选自：β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA、(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和ENA。

在本发明方法的一个实施方案中，糖修饰为MOE:

其中B为核碱基，且Z和Z*独立地为核苷酸。

在本文所述的本发明方法的每个实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体可以具有式(3a)或(3b):

其中Nuc如本文所定义，R

在一个实施方案中，本发明为用于合成立体限定的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸包含核糖修饰，其选自β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA、(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和MOE，该方法包含下列步骤：将式(3a)或(3b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体:

其中Nuc为包含被保护的5’-羟基的核苷并且通过其3’位连接至式1a或1b的氧原子，且R

在一个实施方案中，本发明为用于合成立体限定的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸包含核糖修饰，其选自β-D-氧基-LNA、(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和MOE，该方法包含下列步骤：将式(3a)或(3b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体:

其中Nuc为包含被保护的5’-羟基的核苷并且通过其3’位连接至式1a或1b的氧原子，且R

在一个实施方案中，本发明为用于合成立体限定的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸包含核糖修饰，其选自β-D-氧基-LNA、(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和MOE，该方法包含下列步骤：将式(3a)或(3b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体:

其中Nuc为包含被保护的5’-羟基的核苷并且通过其3’位连接至式1a或1b的氧原子，且R

在本文所述每个实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体可具有式(4a)或(4b):

其中B为核碱基，PG为羟基保护基，且R

在一些或全部实施方案中，固定在固体支持物上的核苷可以具有式(5):

其中B’为核碱基。

在一个实施方案中，本发明为用于合成立体限定的寡核苷酸的方法，包含下列步骤：将式(4a)或(4b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体：

其中R

其中B’为核碱基，且该偶联在作为活化剂的在乙腈中0.25M的氢溴酸吡啶鎓盐存在下进行。

本发明的另一个方面为组合物，其包含吡啶鎓的酸盐活化剂、溶剂和式(1a)或(1b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷，其中吡啶鎓的酸盐活化剂、溶剂和式(1a)或(1b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷如本文所述。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含在乙腈中0.50M的盐酸吡啶鎓盐活化剂和式(3a)或(3b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷：

其中R

在一个实施方案中，本发明的组合物包含在乙腈中约0.25M的氢溴酸吡啶鎓盐活化剂和式(3a)或(3b)的化合物:

其中R

本发明的另一个方面是吡啶鎓的酸盐活化剂用于使如本文所定义的式(1a)或(1b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体与固定在固体支持物上的核苷偶联的用途。

在一个实施方案中，盐酸吡啶鎓盐活化剂以在乙腈中0.50M使用，用于使固定在固体支持物上的核苷与式(3a)或(3b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体偶联:

其中R

在一个实施方案中，氢溴酸吡啶鎓盐活化剂以在乙腈中约0.25M使用，用于使固定在固体支持物上的核苷与式(3a)或(3b)的氧杂氮杂磷杂环戊烷单体偶联:

其中R

本发明的另一个方面为根据本发明方法制备的寡核苷酸。

在一些实施方案中，B或B’为核碱基，其选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。

在一些实施方案中，B或B’为嘌呤核碱基。在一些实施方案中，B或B’为嘧啶核碱基。在一些实施方案中，B或B’为腺嘌呤。在一些实施方案中，B或B’为胸腺嘧啶。在一些实施方案中，B或B’为鸟嘌呤。在一些实施方案中，B或B’为胞嘧啶。在一些实施方案中，当B或B’为胞嘧啶时，B为5-甲基-胞嘧啶。

在一些实施方案中，B或B’不为胞嘧啶，例如，当单体为D-DNA单体时，例如具有式20或22。在一些实施方案中，例如当单体为D-DNA-C时，B不为乙酰基(Ac)保护的胞嘧啶。

应当理解，为了用于寡核苷酸合成，核碱基B或B’可以在亚酰胺单体中被保护(胸腺嘧啶通常使用无保护基的)。适合的保护基包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基三苯甲基(DMT)或酰基保护基，例如异丁酰基(iBu)，或乙酰基保护基(Ac)或苯甲酰基保护基(Bz)。

在一些实施方案中，例如当单体为L-LNA-G时，B不为DMF保护的鸟嘌呤(G)。R

R

R

或在一些实施方案中，R

其中R

在一些实施方案中，当掺入寡核苷酸时，核苷(Z)赋予互补RNA靶标的结合亲和力高于等价的DNA核苷。这类核苷称作高亲和力核苷。高亲和力核苷的实例包括2’-O-MOE、2’-氟、2’-O-甲基和LNA核苷。在其中核苷为高亲和力核苷的实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，核苷为包含2’–4’桥(双基)的LNA核苷(也称作双环核苷)。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，其中核苷(Nuc)为双环核苷(LNA)，例如β-D-氧基LNA，R为芳基，例如苯基，且R

在一些实施方案中，式(1a)或(1b)的化合物选自式4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a和7b。

在一些实施方案中，式(1a或1b)的化合物选自式8a、8b、8c或8d；或9a、9b、9c或9d:

在一些实施方案中，式(1a或1b)的化合物选自式(10a)或(10b)的式:

在一些实施方案中，核碱基B为腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤。在一些实施方案中，核碱基B为胸腺嘧啶。在一些实施方案中，单体为D-DNA-A单体(例如该单体具有式9c，且核碱基B为腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤)。实施例示例：D-DNA-A单体(例如具有式9c)、L-LNA-A单体和L-LNA-T单体(例如具有式8a或8b)在用于乙腈/芳族杂环溶剂中时显示出改善的偶联，正如本发明所示。

DMF保护的L-LNA-G

如PCT/EP2017/060985中所示例的，DMF保护的L-LNA-G单体难溶于乙腈溶剂。L-LNA单体可以由单体的手性助剂的立体化学或掺入寡核苷酸时该单体形成的核苷间键的立体化学所定义(两个特征在结构上关联，并且L单体导致生成Sp硫代磷酸键)。L-LNA单体表示为式3a，其中在R

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体不为包含DMF保护的鸟嘌呤核碱基的L-LNA单体。

在一些实施方案中，DMF保护的鸟嘌呤基团(B)具有如下结构:

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体不为式11或12的单体:

其中R、R

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体为式13或14的单体:

其中X、Y、R、R

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体为式15或16的单体:

其中X、Y、R

酰基保护的L-LNA-G

如实施例所示，DMF保护的L-LNA-G单体难溶于乙腈溶剂。然而，我们先前已经鉴定，在L-LNA-G单体的鸟嘌呤核苷上使用酰基保护基可以解决溶解性问题。

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体为包含酰基保护的鸟嘌呤核碱基的L-LNA单体，例如异丁酰基保护的鸟嘌呤。

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体为式23、24、25、26、27、28、29或30的L-LNA-G单体:

其中R、R

在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷单体选自L-LNA-T、D-DNA-A、D-DNA-C、L-LNA-C和L-LNA-G(DMF保护的L-LNA-G除外)或L-DNA-C和L-DNA-T氧杂氮杂磷杂环戊烷单体。正如实施例中所示例的，当用于本发明的偶联溶剂组合物中时，除通常对于氧杂氮杂磷杂环戊烷单体观察到的溶解性和稳定性益处外，这些单体还显示改善的偶联效率。

溶剂组合物(溶液)

在一些实施方案中，本发明方法的偶联步骤b)使用包含氧杂氮杂磷杂环戊烷单体、乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶液。

在一些实施方案中，乙腈溶液还包含活化剂。用于亚磷酰胺寡核苷酸合成的大量活化剂为已知的，它们典型地包含酸性唑类催化剂，例如1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苄硫基四唑和4,5-二氰基咪唑，这些活化剂在氧杂氮杂磷杂环戊烷合成中不是必然有用的。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂具有约4至约7的pKa。在一些实施方案中，芳族杂环溶剂在20℃下在水中具有约7至约17的pKa。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂为芳族杂环碱。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂为芳族杂环酸。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂选自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂为吡啶。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂为吡咯。

在一些实施方案中，芳族杂环溶剂为3-甲基吡啶。

在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度(v/v)约为0.1％至约50％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为0.5％至约40％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为0.5％至约30％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为0.5％至约25％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为0.5％至约10％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为0.5％至约5％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为1％至约5％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为1％至约4％(v/v)。在一些实施方案中，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度约为0.5％(v/v)至约10％(v/v)，例如约1％(v/v)至约5％(v/v)，例如约2-3％(v/v)，例如约2.5％(v/v)。在这些实施方案中，任选地，芳族杂环碱溶剂是吡啶。

在一些实施方案中，其中芳族杂环溶剂为吡啶，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度(v/v)约为0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2-3％，例如约2.5％或约3.5％，或约2-4％。

在一些实施方案中，其中芳族杂环溶剂为吡咯，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度(v/v)约为0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如2-4％或约2-3％，例如约2.5％。

在一些实施方案中，其中芳族杂环溶剂为3-甲基吡啶，乙腈中芳族杂环溶剂的浓度(v/v)约为0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如2-4％或约2-3％，例如约2.5％。

吡啶鎓酸盐活化剂

活化剂是在寡核苷酸合成的偶联步骤之前或过程中使用的试剂，该试剂活化氧杂氮杂磷杂环戊烷单体，以使该单体与连接至固体支持物或寡核苷的5'末端基团偶联。

在本发明的方法中，活化剂为吡啶鎓的酸盐。吡啶鎓的酸盐可以选自氢碘酸吡啶鎓盐，樟脑磺酸吡啶鎓盐，盐酸吡啶鎓盐，氢溴酸吡啶鎓盐，三氟乙酸吡啶鎓盐，三氟甲磺酸吡啶鎓盐和甲磺酸吡啶鎓盐。也可以使用其他吡啶鎓的酸盐。

另外的活化剂

还可以添加另外的活化剂，例如，在一些实施方案中，另外的活化剂选自CMPT(N-(氰基甲基)吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(CMPT)、三氟甲磺酸N-(苯基)咪唑鎓盐(PhIMT)、三氟甲磺酸苯并咪唑鎓盐(BIT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑和5-(苄硫基)-1H-四唑。

在一些实施方案中，另外的活化剂为4,5-二氰基咪唑(DCI)。

在一些实施方案中，溶剂组合物包含约0.5至约2M DCI(或权利要求13的其他活化剂)，例如约1M DCI(或权利要求13的其他活化剂)。

在一些实施方案中，溶剂组合物还包含N-甲基咪唑，例如浓度约为0.01至约1M N-甲基咪唑的N-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。

在一些实施方案中，活化剂包含N-甲基咪唑。在一些实施方案中，活化剂包含4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑或5-(苄硫基)-1H-四唑。在一些实施方案中，活化剂包含4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑或5-(苄硫基)-1H-四唑和N-甲基咪唑。

在一些实施方案中，所用的N-甲基咪唑的浓度为0.01M至约1M N-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。在一些实施方案中，乙腈溶液包含N-甲基咪唑，其浓度为0.01M至约1MN-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。

在一些实施方案中，活化剂为DCI或四唑或5-(苄硫基)-1H-四唑，其可以以约0.5至约2M、例如约1M的浓度使用(例如在本发明的乙腈溶液中)。

根据本发明合成的立体限定的糖修饰的寡核苷酸可以为包含2’-糖修饰的寡核苷酸的寡核苷酸。换句话说，它们可以为2’-糖修饰的寡核苷酸。

根据本发明合成的立体限定的糖修饰的寡核苷酸可以为包含锁核酸核苷(LNA核苷)的寡核苷酸。换句话说，它们可以为锁核酸核苷酸(LNA核苷酸)。

在一些实施方案中，活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)。在一些实施方案中，溶剂组合物包含约0.5至约2M DCI，例如约1M DCI。应当认识到，为了优化偶联功效，可能有必要如实施例中所示优化活化剂的用量。在一些实施方案中，DCI活化剂的使用浓度在0.5M至1MDCI之间。在一些实施方案中，当活化剂为DCI时，溶剂组合物还包含N-甲基咪唑(NMI)，例如浓度为0.01至约1M N-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。NMI为可增强其他活化剂例如DCI的溶解度的试剂。

本发明的方法为合成具有比现有技术更高的偶联效率的立体限定的寡核苷酸提供了路径，正如发明人进行的实验所证明的。图8描述了制备立体限定的寡核苷酸的通用方法的非限制性实例。参照总结发明人进行的实验的实施例1和图1，可以看出将9-mer与单体偶联以获得10-mer可以使用盐酸吡啶鎓盐得到优于其它非吡啶鎓的酸盐活化剂更好的收率(94,7％)，所述其它非吡啶鎓的酸盐活化剂例如DCI+NMI、三氟甲磺酸苯基咪唑鎓盐、三氟甲磺酸苯并咪唑鎓盐+NMI或三氟甲磺酸苯并咪唑鎓盐。参照图1B，得到的10-mer和剩余的9-mer和副产物二聚体(18-mer)的峰比其他偶联活化剂更有利。

实施例2和图2、特别是图1B显示相同的结论。

实施例3、4和图3、4也证实不同浓度吡啶鎓的酸盐活化剂优于DCI+NMI。

实施例5、6和图5、6显示在吡啶鎓的酸盐活化剂中氢溴酸吡啶鎓盐特别有效。

图7显示根据图6作为不同活化剂和寡核苷酸长度的函数的寡聚体的理论总体反应收率。该图表明，偶联收率的微小变化对总的寡聚体收率产生了显著影响。

下列非限制性实施例进一步示例本发明。

实施例

实施例1

为了检查活化剂对偶联效率和总偶联纯度的影响，在固体支持物上进行L-DNA T的单偶联反应，该固体支持物上预先已使用立体无规的2-氰基乙基亚磷酰胺合成了9-mer完全硫代磷酸化的DNA T。合成以0.2μmol规模在AKTA OligoPilot 100上进行。进行2次偶联反应(10分钟偶联时间)并在两个偶联反应之间进行硫醇化和洗涤步骤，然后进行硫醇化、封端和脱三苯甲基化。此后，用20％的二乙胺的乙腈溶液处理固体支持物。

活化剂选自图中所示的如下之一。

A)1M 4,5-二氰基咪唑(DCI)+0.1N-甲基咪(NMI)

B)0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

C)0.2M三氟甲磺酸N-苯基咪唑鎓的MeCN溶液

D)0.2M三氟甲磺酸苯并咪唑鎓的MeCN溶液+0.1M NMI

E)0.2M三氟甲磺酸苯并咪唑鎓的MeCN溶液

将L-DNA T溶于3.5％吡啶在MeCN中的溶液，浓度为0.15M。使用0.1M氢化黄原素的吡啶:MeCN(1:1)溶液进行硫化，使用20％NMI的MeCN溶液作为Cap A以及吡啶/Ac2O/MeCN(3:5:2)作为Cap B进行封端。使用3％V/V二氯乙酸的二氯甲烷溶液进行脱三苯甲基化。

使用浓氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行总体脱保护24h。通过UPLC-MS分析对粗物质进行分析。根据在260nm处的UV吸光度检测到的色谱图主要由3个峰组成，即全长T10寡聚体、得自失败的偶联反应的T9寡聚体和作为偶联反应杂质得到的T18寡聚体。这3个峰根据在260nm处的峰的吸光度积分来定量，并且如下给出作为用于偶联反应的活化剂的函数。

观察到对于活化剂B(0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液)得到期望的T10寡聚体的最高UV％与最低水平的T9偶联失败物质和T18杂质。

实施例2

为了检查活化剂对偶联效率和总偶联纯度的影响，在固体支持物上进行L-DNA T的单偶联反应，该固体支持物上预先已使用立体无规的2-氰基乙基亚磷酰胺合成了15-mer完全硫代磷酸化的DNA T。合成以0.2μmol规模在AKTA OligoPilot 100上进行。进行2次偶联反应(10分钟偶联时间)并在两个偶联反应之间进行硫醇化和洗涤步骤，然后进行硫醇化、封端和脱三苯甲基化。此后，用20％的二乙胺的乙腈溶液处理固体支持物。

活化剂选自图中所示的如下之一。

A)1M 4,5-二氰基咪唑(DCI)+0.1N-甲基咪唑(NMI)

B)0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

C)0.2M三氟甲磺酸N-苯基咪唑鎓的MeCN溶液

D)0.2M三氟甲磺酸苯并咪唑鎓的MeCN溶液+0.1M NMI

E)0.2M三氟甲磺酸苯并咪唑鎓的MeCN溶液

将L-DNA T溶于3.5％吡啶在MeCN中的溶液，浓度为0.15M。使用0.1M氢化黄原素的吡啶:MeCN(1:1)溶液进行硫化，使用20％NMI的MeCN溶液作为Cap A以及吡啶/Ac2O/MeCN(3:5:2)作为Cap B进行封端。使用3％V/V二氯乙酸的二氯甲烷溶液进行脱三苯甲基化。

使用浓氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行总体脱保护24h。通过UPLC-MS分析对粗物质进行分析。根据在260nm处的UV吸光度检测到的色谱图主要由3个峰组成，即全长T16寡聚体、得自失败的偶联反应的T15寡聚体和作为偶联反应杂质得到的T30寡聚体。这3个峰根据在260nm处的峰的吸光度积分来定量，并且如下给出作为用于偶联反应的活化剂的函数。

观察到对于活化剂B(0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液)得到期望的T16寡聚体的最高UV％与最低水平的T15偶联失败物质和T30杂质。

实施例3

为了检查活化剂对偶联效率的影响，在固体支持物上进行L-LNA T的单偶联反应，该固体支持物上预先已使用立体无规的2-氰基乙基亚磷酰胺合成了15-mer完全硫代磷酸化的DNA T。合成以0.2μmol规模在AKTA OligoPilot 100上进行。进行2次偶联反应(10分钟偶联时间)并在两个偶联反应之间进行硫醇化和洗涤步骤，然后进行硫醇化、封端和脱三苯甲基化。此后，用20％的二乙胺的乙腈溶液处理固体支持物。

活化剂选自图中所示的如下之一。

A)1M 4,5-二氰基咪唑(DCI)+0.1N-甲基咪唑(NMI)

B)0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

C)0.25M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

D)0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

将L-LNA T溶于3.5％吡啶在MeCN中的溶液，浓度为0.15M。使用0.1M氢化黄原素的吡啶:MeCN(1:1)溶液进行硫化，使用20％NMI的MeCN溶液作为Cap A以及吡啶/Ac2O/MeCN(3:5:2)作为Cap B进行封端。使用3％V/V二氯乙酸的二氯甲烷溶液进行脱三苯甲基化。

使用浓氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行总体脱保护24h。通过UPLC-MS分析对粗物质进行分析。将全长产物峰的UV吸光度与T15峰的UV吸光度进行比较，得到偶联效率的相对测量值。

观察到使用活化剂D(0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液)得到最高的偶联效率，尽管与盐酸吡啶鎓盐相比，该活化剂的浓度已经降至0.25M。

实施例4

为了检查活化剂对偶联效率的影响，在固体支持物上进行L-LNA

活化剂选自图中所示的如下之一。

A)1M 4,5-二氰基咪唑(DCI)+0.1N-甲基咪唑(NMI)

B)0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

C)0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

将L-LNA

使用浓氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行总体脱保护24h。通过UPLC-MS分析对粗物质进行分析。将全长产物峰的UV吸光度与T15峰的UV吸光度进行比较，得到偶联效率的相对测量值。

观察到使用活化剂C(0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液)得到最高的偶联效率。

实施例5

为了检查活化剂对偶联效率的影响，在固体支持物上进行L-LNA

活化剂选自图中所示的如下之一。

A)0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

B)0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

将L-LNA

使用浓氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行总体脱保护24h。通过UPLC-MS分析对粗物质进行分析。将全长产物峰的UV吸光度与T15峰的UV吸光度进行比较，得到偶联效率的相对测量值。

可以观察到，用活化剂B(0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液)可获得最高的偶联效率，并且还可以观察到，与实施例4相比，偶联时间的增加导致偶联效率的提高。

实施例6

为了检查活化剂对偶联效率的影响，在固体支持物上进行L-LNA

活化剂选自图中所示的如下之一。

A)0.5M盐酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

B)0.25M氢溴酸吡啶鎓盐的MeCN溶液

C)0.25M三氟乙酸吡啶鎓盐

D)0.25M对甲苯磺酸吡啶鎓盐

E)0.25M三氟甲磺酸吡啶鎓盐

将L-LNA

使用浓氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行总体脱保护24h。通过UPLC-MS分析对粗物质进行分析。将全长产物峰的UV吸光度与T15峰的UV吸光度进行比较，得到偶联效率的相对测量值。

实施例7

使用

全部合成步骤根据标准的寡核苷酸合成进行:

-脱三苯甲基化

-偶联

-氧化/硫化

-封端

用于合成循环的试剂:

-解封闭：3％二氯乙酸的甲苯溶液(v/v)

-活化剂：参见下表

-立体无规的亚磷酰胺：0.2M在乙腈中的溶液

-立体限定的亚磷酰胺：参见下表

-Cap A：N-甲基咪唑/乙腈2/8(v/v)

-Cap B1：乙酐/乙腈4/6(v/v)

-Cap B2：吡啶/乙腈6/4(v/v)

-硫化剂：0.1M氢化黄原素的乙腈/吡啶1/1溶液(v/v)

-氧化剂：碘/水/吡啶12.7/1/9(w/v/v)

寡核苷酸合成完成后，脱保护/裂解步骤在32％氨水溶液中在65℃下进行6小时。优化结果如下表中所示:

在下表中，当进行一次以上偶联时，使用偶联、氧化、洗涤(COW)的顺序。

CMPT：N-(氰基甲基)-吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐

Pyr：吡啶鎓

OTf：三氟甲烷磺酸盐