包含小克里斯滕森氏菌的克里斯滕森氏菌科细菌及其用途

摘要

本发明涉及包含小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891的克里斯滕森氏菌科细菌，涉及其细胞组分、代谢物和分泌分子，并且涉及包括上述产物的组合物，并且还涉及所述菌株的用途，其用于预防和/或治疗情绪障碍或情感障碍，如抑郁症、应激障碍、焦虑性障碍和偏头痛。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年11月28日提交的西班牙专利申请序列号P201831153的权益，所述申请特此通过引用整体并入。

序列表

作为其公开内容的一部分，本申请包含所附文本文件中含有的生物学序列表，其通过引用整体并入。

技术领域

本公开涉及包含小克里斯滕森氏菌(Christensenella minuta，C.mintua)菌株DSM 32891的克里斯滕森氏菌科细菌(Christensenellaceae bacteria)以及其用于预防或治疗情绪障碍或情感障碍如抑郁症、应激障碍和焦虑性障碍的用途。本公开属于药物组合物或制剂的治疗活性的领域，并且也属于营养领域。

背景技术

情绪障碍，尤其是抑郁症，是全世界丧失能力的主要原因之一。据估计，精神障碍的总费用为7980亿欧元，其中情绪障碍每年直接或间接造成的费用约为1180亿欧元[1]。所述情绪障碍包含重度抑郁症、典型或忧郁性和非典型抑郁症、产前和产后抑郁症、双相障碍、精神病性抑郁症、心境恶劣、抑郁性人格障碍、季节性情感障碍、由物质滥用或药物使用引起的情绪障碍等。另外，当前疗法的功效在某种程度上受到限制。据估计，仅约50％的抗抑郁治疗有效；许多患者保留亚临床症状，并且其它患者示出无改善。

抑郁症是复杂的病理学，其特征为存在异质性症状，这表明存在不同形式的抑郁症或表型(例如，特征为下丘脑-垂体-肾上腺轴[HPA]的更大的极度活跃的典型抑郁症和特征为食欲/体重的更大的代谢失调和增加的非典型抑郁症)[2,3]。然而，对于作为这些病理基础的分子机制知之甚少。抑郁症还示出与精神障碍(例如，焦虑)和身体病症(例如，心脏代谢病症，如代谢综合症、糖尿病和脑血管疾病)的高合并症，这些会对疾病的进程产生不利影响，降低治疗应答并增加罹患所述疾病的风险。

人类的流行病学研究表明，肠道菌群结构的改变(营养不良)与精神病症(如情绪障碍或情感障碍)之间存在关联，其中尤其是抑郁症[4-9]。据认为，营养不良与抑郁症之间的这些关联在很大程度上取决于社会心理环境因素(童年创伤、与工作有关的应激、睡眠不足)和生活方式(不健康饮食、久坐的生活方式、药剂)以及其它个体特征如相关人员的基因组、年龄和性别，以及合并症的存在[2,10]。在动物模型中，应激引起的HPA轴响应增加(公认的抑郁症风险因素)会导致肠道营养不良；生物失调的微生物群进而助长了行为障碍和情绪障碍[11]。动物研究还示出，肠道菌群的特定结构通过协调免疫、内分泌或神经系统对话的机制来影响对应激、加重或改善其神经化学或行为后果的应答[8,12,13]。

已示出，根据所使用的菌株，使用常规益生菌(乳杆菌和双歧杆菌)治疗抑郁症具有不同的作用。双歧杆菌可能是最常用于评估其对抗焦虑和抑郁效果；然而，所获得的结果并不总是结论性的或足够大的[14,15]。

除双歧杆菌外，其它细菌物种对这些应用可能是所关注的，但是建立不同细菌组与抑郁症之间关联的观察性研究不是结论性的，其示出患有所述抑郁症的受试者有所增加或减少。因此，例如，Yu等人(2017)[16]，在诱导抑郁症的小鼠模型中观察到低比例的细菌组马文布氏菌(Marvinbryantia)、棒状杆菌、嗜冷杆菌、克里斯滕森氏菌、乳酸菌、螺旋藻消化链球菌科(Peptostreptococcaceae incertae sedis)、厌氧贪食菌属(Anaerovorax)、螺旋藻梭菌(Clostridialesincertae sedis)和粪球菌属。然而，Mironova等人(2017)[17]发表的结果示出，与帕金森氏病(Parkinson's disease)和轻度抑郁症或无抑郁症的患者相比，患有帕金森氏病和中度抑郁症患者的微生物群示出小克里斯滕森氏菌、双孢梭状芽胞杆菌和缬草酸杆菌的丰度更高。

因此，继续寻找更有效的预防和治疗策略。此类策略可以改善情绪障碍的管理，从而减少其经济和社会影响。

具体实施方式

本发明涉及小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891(小克里斯滕森氏菌DSM 32891)，涉及所述菌株的细胞组分、代谢物和分泌分子，并且涉及包括上文提及的产物的组合物以及其用于预防和/或治疗情绪障碍(如抑郁症)、应激障碍和焦虑性障碍的用途。

发明人已经发现，小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891有减弱暴露于严重的社会应激的动物抑郁行为的能力。将细菌(小克里斯滕森氏菌菌株DSM32891)口服施用于具有诱导抑郁症状的社会应激的动物模型已经表明了此作用(参见实例2)。

另外，本发明人已经示出，施用小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891调制在暴露于10天社会应激(实例3)的动物激素应激应答，指示也可以通过施用此菌株治疗涉及激素应激应答的疾病和病状。

因此，一方面，本发明涉及小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891，下文称为“根据本发明的菌株”、“小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891”或“菌株DSM 32891”。

从健康人的粪便中分离出小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891。该菌株于2018年8月7日由申请人保藏在布达佩斯条约(Budapest Treaty)下的国际保存机构莱布尼兹研究所DSMZ——德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganismsand Cell Cultures)(德国布伦瑞克Inhoffenstraβe 7B,38124)。分配的保藏号为DSM32891。

根据本发明的菌株的科学分类是：域：细菌；门：厚壁菌门；类别：梭菌；目：梭菌目；科：克里斯滕森氏菌；物种：小克里斯滕森氏菌。

本发明的另一方面涉及从小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891衍生的菌株，其中所述菌株保持或改善了贯穿本发明描述的能力。衍生的微生物可以通过现有技术中已知的诱变方法自然地或有意地产生，如但不限于在诱变剂或产生应激的药剂存在的情况下原始微生物的生长，或通过针对修饰特定基因的基因工程。根据优选的实施例，从小克里斯滕森氏菌菌株DSM32891衍生的菌株是基因修饰的突变体。术语突变菌株或衍生菌株可以互换使用。

本发明的另一方面涉及包括16S rRNA序列的细菌，所述16S rRNA序列与小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891的16S rRNA序列(SEQ ID NO:3)具有特定百分比序列同一性，如与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或至少99.5％同一性的16S rRNA序列。除非另有说明，否则与SEQ ID NO:3具有上述百分比同一性，例如，至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或至少99.5％同一性的此类细菌可以用本公开的实施例(包含本文所公开的菌株、方法、用途和组合物)中的小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891代替。

所述小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891或任何突变体或其衍生物可以以产生所描述作用的任何形式使用，例如根据本发明的优选的实施例，小克里斯滕森氏菌菌株DSM32891呈活细胞(可培养的或不可培养的)的形式或者根据本发明的另一个优选的实施例，所述菌株呈非活细胞(已通过现有技术中已知的任何技术例如但不限于加热、冷冻或紫外线辐射灭活的“死”细胞)的形式。

本发明的另一方面涉及获自根据本发明的菌株或获自包括至少一种根据本发明的菌株的微生物的组合的细胞组分、代谢物、分泌分子或其组合中的任何一种。

在细菌的细胞组分中，可以包含细胞壁组分(例如但不限于肽聚糖)、核酸、膜组分或其它如蛋白质、脂质、碳水化合物及其组合如脂蛋白、糖脂或糖蛋白。代谢物包含由于在生长期间、其在技术过程(例如但不限于食物或药物生产过程)中的使用、产品储存期间或胃肠道运输期间的代谢活性产生的细菌所产生或修饰的任何分子。所述代谢物的实例是但不限于有机酸和无机酸、蛋白质、肽、氨基酸、酶、脂质、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。分泌分子包含细菌在其生长期间、其在技术过程(例如，食物或药物生产)中的使用、产品储存或胃肠道运输过程中向外输出或释放的任何分子。所述分子的实例是但不限于有机酸和无机酸、蛋白质、肽、氨基酸、酶、脂质、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。

本发明的另一方面涉及一种组合物，在下文中称为“根据本发明的组合物”，其包括根据本发明的菌株和/或根据本发明的菌株的细胞组分、代谢物或分泌分子或其组合中的任何一种。

通常定义的组合物是至少由任何浓度的根据本发明的菌株构成的一组组分；或根据本发明的菌株的至少细胞组分、代谢物或分泌分子或其组合中的任何一种；或其组合。

在优选的实施例中，根据本发明的所述组合物的根据本发明的菌株的浓度介于10

在另一个具体实施例中，根据本发明的组合物还可以包括不同于根据本发明的菌株的至少一种其它另外的微生物和/或细胞组分、其代谢物或分泌分子或其任何组合。例如但不限于，可以形成所述组合物一部分的另外的微生物选自以下组中的至少一种：

-克里斯滕森氏菌科的另一种物种，特别是克里斯滕森氏菌属并且特别是物种小克里斯滕森氏菌的至少一种菌株；

-至少一种肠道、饮食或环境来源的乳酸菌或双歧杆菌。乳酸菌选自包括以下但不限于以下的列表：双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属或链球菌属的细菌；

-肠道、饮食或环境来源的原核生物的其它系统发育组、属或物种的至少一种菌株，例如但不限于古生菌、厚壁菌、拟杆菌、变形菌、放线菌、疣微菌、梭杆菌、产甲烷菌、螺旋体、纤维杆菌门、脱铁杆菌门、异常球菌属、栖热菌属、蓝菌门、甲烷短杆菌、消化链球菌属、瘤胃球菌属、粪球菌属、萨博得林氏菌(Subdolingranulum)、多尔氏菌(Dorea)、布雷德菌属(Bulleidia)、厌氧菌、孪生球菌、罗斯氏菌(Roseburia)、链状细菌、小类杆菌属、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、葡萄球菌、微球菌、丙酸菌属、肠杆菌科、粪杆菌属、拟杆菌属、副杆状菌属、普氏菌属(Prevotella)、优杆菌属、艾克曼氏菌(Akkermansia)、芽孢杆菌属、丁酸弧菌属或梭菌属；

-至少一种真菌或酵母菌株，例如但不限于，属于酵母属、假丝酵母、毕赤酵母属、德巴利氏酵母属、球拟酵母属、曲霉属、根霉、毛霉菌或青霉属的那些。

所述另外的微生物可以是与对应于根据本发明的菌株的微生物相同物种或不同物种或生物分类群的菌株。包括在组合物中的细胞可以是活的或非活的，并且可以处于发育或生长状态的任何阶段(潜伏、指数、静止等)，而与所呈现的形态无关。在具体实施例中，所述另外的微生物包括至少一种肠道细菌或乳酸细菌。

任选地，在另一个具体实施例中，根据本发明的组合物还可以包括至少一种生物活性组分(活性物质、活性成分或治疗剂)，例如食物、植物制品和/或药物的组分。

术语“生物活性组分”是指在专利申请领域中具有生物活性的化合物，所述化合物可以改善或补充小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891的活性，包含食物的成分或组分(例如但不限于多不饱和脂肪酸、共轭亚油酸、益生元、纤维、瓜尔豆胶、葡甘露聚糖、壳聚糖、吡啶甲酸铜、钙等)、其它益生菌、植物、植物的提取物或组分以及药物。

在具体实施例中，根据本发明的组合物是药物组合物。药物组合物是至少由任何浓度的根据本发明的菌株构成的一组组分；或根据本发明的菌株的至少细胞组分、代谢物或分泌分子或其组合中的任何一种，其在改善受试者的身体、生理或心理健康方面具有至少一种应用，其导致所述受试者的总体健康状况的改善或疾病风险的降低。所述药物组合物可以是药物。

术语“药物”具有比如本发明中定义的“药物组合物”更有限的含义，因为药物或药品必须具有预防或治疗作用。本发明涉及的药物可以用于人或兽医用途。“用于人用途的药物”是任何物质或物质的组合，其呈现为具有用于治疗或预防人类疾病的性质或其可以用于人类或施用于人类以便恢复、纠正或改变产生药理、免疫或代谢作用的生理功能或建立医学诊断。术语“用于兽医用途的药物”是任何物质或物质组合，其呈现为具有与动物疾病有关的治疗或预防性质或其可以施用于动物以便重新建立、纠正或改变产生其药理、免疫或代谢作用的生理功能或建立兽医诊断。还考虑的“兽药”是“准备用于并入饲料中的含药饲料的预混合物”。

除了对所述药物组合物可能需要使用其它治疗剂的治疗功效的要求外，可能存在另外的基本原因，这些原因在大多数情况下需要或建议使用根据本发明的化合物与生物活性组分的组合，其中要求对所述生物活性组分具有活性，如构成药物。显然，根据本发明的所述化合物涉及根据本发明的菌株或者涉及自其衍生的菌株或者涉及从根据本发明的菌株获得的细胞组分、代谢物或分泌分子或其组合中的任何一种。

在具体实施例中，所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的媒剂和/或赋形剂。

“媒剂”或载体优选地是惰性物质。媒剂的功能是促进其它化合物的并入，以允许更好的剂量和施用或给予药物组合物稠度和形式。示例性载体包含冷冻保护剂或冻干保护剂。因此，媒剂是在药物中用于将根据本发明的药物组合物的组分中的任何一种稀释到固定体积或重量的物质；或者可替代地，即使不稀释所述组分，所述媒剂也能够允许更好的剂量和施用或给予药物稠度和形式。当呈递形式是液体时，药学上可接受的媒剂是稀释剂。

本公开的示例性组合物包含本公开的细菌，例如小克里斯滕森氏菌细菌菌株DSM32891，和“冻干保护剂”，其是当与细菌例如本公开的细菌组合时，在脱水(例如，冻干)和/或随后的储存时，显著降低其化学和/或物理不稳定性的物质。示例性冻干保护剂包含糖及其对应的糖醇，如蔗糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；氨基酸，如精氨酸或组氨酸；溶致盐，如硫酸镁；多元醇，如丙二醇、甘油，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)；以及其组合。另外的示例性冻干保护剂包含明胶、糊精，改性淀粉和羧甲基纤维素。优选的糖醇是通过还原单糖和二糖例如乳糖、海藻糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽糖获得的那些化合物。糖醇的另外的实例是葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。冻干保护剂通常以“冻干保护量”添加到冻干前的调配物中。这意指，在冻干保护量的冻干保护剂存在的情况下，将细菌冻干后，与如果在冻干保护剂不存在的情况下以相同的方式脱水和储存相比，细菌在更大程度上保留了活力(重建时形成菌落的能力)。

本公开的示例性组合物包含本公开的细菌，如小克里斯滕森氏菌细菌菌株DSM32891，和“冷冻保护剂”，所述冷冻保护剂是用于保护所述细菌在冷冻和解冻期间不受损害的物质。冷冻保护剂可以是任何添加剂，只要它能防止细菌在冷冻和解冻期间不受损害即可。冷冻保护剂的实例包含但不限于糖(例如，蔗糖、果糖、海藻糖)、多元醇(例如，甘油、山梨糖醇、甘露糖醇)、多糖(例如，纤维素、淀粉、树胶、麦芽糊精)、聚醚(例如，聚丙二醇、聚乙烯乙二醇、聚丁二醇)、抗氧化剂(例如，天然抗氧化剂，如抗坏血酸、β-胡萝卜素、维生素E、谷胱甘肽、化学抗氧化剂)、油(例如，菜籽油、葵花籽油、橄榄油)、表面活性剂(例如，Tween20、Tween80、脂肪酸)、蛋白胨(例如，大豆蛋白胨、小麦蛋白胨、乳清蛋白胨)胰蛋白胨、维生素、矿物质(例如，铁、锰、锌)、水解产物(例如，蛋白质水解产物，如乳清粉，麦芽提取物、大豆)、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核苷酸、核碱基(例如，胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷)、酵母提取物(例如，酵母属、克鲁维酵母属或圆酵母属的酵母提取物)、牛肉提取物、生长因子和脂质。

术语“赋形剂”是指在给予所述药物组合物稠度或添加使所述药物组合物更令人满意的香料的意义上帮助吸收根据本发明的组合物的组分中的任何一种，稳定所述组分或帮助制备药物组合物的物质。因此，赋形剂可以具有将组分例如淀粉、糖或纤维素保持在一起的功能、甜味功能、着色剂功能、药物的保护功能例如将所述药物与空气和/或水分隔离、用于丸剂、胶囊剂或其它任何呈递形式例如磷酸氢钙的填充剂功能、用于促进组分在肠中的溶解和吸收的崩解剂功能，不排除本段未提及的其它类型的赋形剂。因此，术语“赋形剂”定义为以盖仑形式(galenic form)包含的材料，所述材料被添加到活性成分或其缔合物中，以使其制备和稳定性成为可能，以改变其感官性质或确定药物组合物的理化性质及其生物利用度。“药学上可接受的”赋形剂必须允许药物组合物的化合物的活性，即，必须与所述组分相容。

另外，如本领域技术人员将理解的，当存在时，赋形剂和媒剂必须是药理学可接受的，即，必须允许和评估赋形剂和媒剂以免对施用所述赋形剂或媒剂的生物造成伤害。

药物组合物或药物可以以任何临床上允许的施用形式和治疗有效量呈递。例如，所述药物组合物或药物可以呈适合于口服、舌下、经鼻、鞘内、支气管、直肠、经皮、吸入或肠胃外施用的形式，优选地呈适合于口服施用的形式。根据本发明的药物组合物可以固体、半固体、液体或气体形式调配，如片剂、胶囊、粉末、团粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微珠或气雾剂。适合于口服施用的形式选自包括以下但不限于以下的列表：滴剂、糖浆、汤药、酏剂、混悬液、临时混悬液、可饮用小瓶、片剂、胶囊、团粒、扁囊、丸剂、片剂、锭剂、糖锭或冷冻干燥形式。在具体实施例中，根据本发明的组合物以适合于口服、舌下、经鼻、支气管、淋巴、直肠、透皮、吸入或肠胃外施用的形式呈递。

在更具体的实施例中，根据本发明的组合物以适合于口服施用的形式呈递。适合于口服施用的形式是指可以允许口服施用的物理状态。适合于口服施用的所述形式选自包括以下但不限于以下的列表：滴剂、糖浆、汤药、酏剂、混悬液、临时混悬液、可饮用小瓶、片剂、胶囊、团粒、扁囊、丸剂、囊片、锭剂、糖锭或冷冻干燥形式。

“盖仑形式”或“药物形式”是使活性成分和赋形剂适于形成药物的布置。所述形式定义为制造商呈递药物组合物的形式与所述药物组合物的施用形式的组合。在本发明中，表述“有效量”或“治疗有效量”是指药物组合物的组分的量，当将其施用于哺乳动物，优选地人时，足以产生如下文所定义的哺乳动物优选地人所关注的疾病或病理状况的预防和/或治疗。治疗有效量将例如根据以下的活性而变化：根据本发明的菌株；以任何呈递形式的细胞组分、代谢物、分泌分子或其组合中的任何组合；治疗有效量还将根据以下而变化：化合物的代谢稳定性和作用持续时间；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用方式和时间、排泄速度、药物组合；特定障碍或病理病状的严重程度；以及接受疗法的受试者，但是可以由本领域技术人员根据他或她自己的知识和此描述来确定。

作为药物组合物的替代，根据本发明的组合物也可以是营养组合物。

术语根据本发明的“营养组合物”是指这样的食料，其在向采用所述营养组合物的受试者提供营养的同时，有益地影响生物的一种或多种功能，从而提供更好的健康和幸福状态。因此，所述营养组合物可以用于预防和/或治疗疾病或引起疾病的因素。因此，术语根据本发明的“营养组合物”可以用作功能性食料或用于特定营养目的的食料或药用食料的同义词。

在具体实施例中，所述营养组合物是食料、补充剂、营养品、益生菌或共生素。

在更具体的实施例中，食料选自包括以下的列表：乳制品、植物制品、肉制品、开胃酒、巧克力、饮料或婴儿食物。乳制品选自包括以下但不限于以下的列表：源自发酵乳(例如但不限于酸奶或奶酪)或未发酵乳(例如但不限于冰淇淋、黄油、人造黄油、乳清)的产品。植物制品是例如但不限于任何呈递形式的谷物，无论发酵或不发酵。饮料可以是但不限于任何果汁或未发酵的牛奶。

术语“补充剂”，即术语“膳食补充剂”、“营养补充剂”或“食物补充剂”中的任何一种的同义词，是旨在补充营养的“食物成分”。膳食补充剂的一些实例是但不限于维生素、矿物质、植物制品、氨基酸和食物组分(如酶和腺体提取物)。所述补充剂不呈递为常规食料的替代物或餐食或营养饮食的单一组分，而是呈递为膳食补充剂。

在本发明中使用的术语“营养品”是指已经从食料中分离出来并且以对健康有益的剂量形式使用的物质。

本发明中使用的术语“益生菌”是指活微生物，当以合适的量提供时，所述微生物促进宿主生物的健康。

本发明中使用的术语“共生素”是指含有益生元和益生菌的混合物的那些食料。通常，所述食料含有益生元组分，所述益生元组分促进所述食料与之组合的益生菌的生长和/或代谢活性，并最终促进益生菌的作用，例如但不限于低聚果糖或低聚半乳糖与双歧杆菌的可能缔和。

本发明的另一方面涉及根据本发明的菌株或源自其的组分或根据本发明的组合物用于制造药物、营养组合物或食料的用途。

本发明的另一方面涉及小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891、从根据本发明的菌株获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其组合中的任何一种或根据本发明的组合物，用作药物。术语药物已经在先前定义，并且适用于本发明的当前方面。

另一方面，本发明涉及根据本发明的菌株，由其衍生的菌株，从根据本发明的菌株获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其组合中的任何一种或根据本发明的组合物，其用于预防和/或治疗情绪障碍(如抑郁症)、应激障碍和焦虑性障碍。

在本发明中，术语“治疗”是指对抗由受试者(优选地哺乳动物并且更优选地人)所关注的疾病或病理病状引起的作用，这包含：

(i)抑制疾病或病理病状，即减慢其发展；

(ii)减轻疾病或病理病状，即引起疾病或病理病状或其症状的消退；

(iii)稳定疾病或病理病状。

在本发明中，术语“预防”是指预防疾病的出现，即，预防在受试者(优选地哺乳动物并且更优选地人)中产生疾病或病理病状，特别是当所述受试者具有病理病状的诱因时。

在本发明中，情绪障碍或紊乱包含但不限于抑郁症、重度抑郁症、非典型抑郁症、典型或忧郁性抑郁症、精神病性抑郁症、紧张性抑郁症、产前和产后抑郁症、双相障碍、季节性情感障碍、心境恶劣、抑郁性人格障碍、双重抑郁症、未指定的抑郁症、复发性短暂抑郁症、轻度抑郁症、物质滥用或通过使用药物引起的情绪障碍等。

本公开的示例性方法提供了预防或治疗与创伤和与应激源有关的疾病相关的病症，其中明确列出了暴露于创伤或应激事件作为诊断标准。此类病症在本文中被称为“应激障碍”并且包含例如反应性依恋障碍、去抑制型社会参与障碍、创伤后应激障碍(PTSD)、急性应激障碍和调节障碍。

还提供了本公开的用于预防或治疗焦虑性障碍的方法，所述焦虑性障碍如惊恐发作、惊恐障碍、广场恐惧症、社交恐惧症或社交焦虑性障碍、强迫症、创伤后应激障碍(ASD)、广泛性焦虑性障碍或急性应激障碍。

不旨在受理论的限制，据信上述应激障碍和焦虑性障碍的特征在于肾上腺素、去甲肾上腺素、血清素和/或多巴胺水平的改变，使得预期本发明的小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891对这些激素的调节作用会治疗、改善或减轻这些病状或其症状中的一种或多种。

适于根据本发明治疗的受试者包含患有或有风险患有本文所公开的多种病症中的任一种的哺乳动物受试者，包含人，所述病症包含情绪障碍(如抑郁症)、焦虑性障碍和应激障碍。在本发明的方法中，小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891或包括小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891的组合物，可以单独或与心理治疗药物组合以有效治疗特定病症的量施用，所述心理治疗药物包含但不限于来自抗抑郁药、稳定情绪药、抗焦虑药、抗惊厥药、抗精神病药、抗瘾药、食欲抑制药物和阿片激动剂的一般类药物。(参见例如R J.Baldessarini《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》,第9版,第18章,麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill),1996中)。

本公开的方法可以用于治疗或预防人或非人动物的病症。示例性非人动物包含但不限于伴侣动物、牲畜、动物园动物、哺乳动物等，如狗、猫、豚鼠、雪貂、仓鼠、猪、牛、山羊、绵羊、马、小鼠、大鼠等。

所述病症的治疗或预防可以包括施用有效量的小克里斯滕森氏菌菌株DSM32891。所施用的细菌的量可以包括介于10

另一方面，本发明涉及根据本发明的菌株、由根据本发明的菌株衍生的菌株、从根据本发明的菌株获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其组合中的任何一种或根据本发明的组合物，用作治疗或预防情绪障碍(如抑郁症)、应激障碍和焦虑性障碍的佐剂。

在示例性实施例中，供使用的细菌或其组合物可以以任何临床上允许的施用形式和治疗有效量用于施用。例如，所述其细菌或组合物可以用于口服、舌下、经鼻、鞘内、支气管、直肠、经皮、吸入或肠胃外施用，优选地口服施用。根据本发明的药物组合物可以固体、半固体、液体或气体形式调配，如片剂、胶囊、粉末、团粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微珠或气雾剂。适合于口服施用的形式选自包括以下但不限于以下的列表：滴剂、糖浆、汤药、酏剂、混悬液、临时混悬液、可饮用小瓶、片剂、胶囊、团粒、扁囊、丸剂、片剂、锭剂、糖锭或冷冻干燥形式。在具体实施例中，根据本发明的组合物以适合于口服、舌下、经鼻、支气管、淋巴、直肠、透皮、吸入或肠胃外施用的形式呈递和/或通过此类施用途径施用。优选的施用途径将小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891或其组合物递送到胃肠道，例如通过口服、舌下或直肠施用。

在更具体的实施例中，根据本发明的组合物以适合于口服施用的形式呈递和/或口服施用。适合于口服施用的形式是指可以允许口服施用的物理状态。适合于口服施用的所述形式选自包括以下但不限于以下的列表：滴剂、糖浆、汤药、酏剂、混悬液、临时混悬液、可饮用小瓶、片剂、胶囊、团粒、扁囊、丸剂、囊片、锭剂、糖锭或冷冻干燥形式。

在本发明中，“佐剂”被理解为是有助于改善用于治疗情绪障碍(如抑郁症)、应激障碍和焦虑性障碍以及偏头痛的其它药物的有效性或效率的化合物，所述化合物将允许通过施用根据本发明的菌株的调配物使用具有互补作用的机制降低其施用的剂量和/或频率或增加其功效。

另一方面，本发明涉及根据本发明的菌株、由根据本发明的菌株衍生的菌株、从根据本发明的菌株获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其组合中的任何一种或根据本发明的组合物的用途，用于制备食料。术语药物已经先前在本说明书中定义，并且适用于本发明的当前方面。在示例性实施例中，本公开提供了保藏号为DSM 32891的小克里斯滕森氏菌菌株的分离的细菌。

在示例性实施例中，本公开提供了源自保藏号为DSM 32891的小克里斯滕森氏菌菌株的菌株的分离的细菌。在示例性实施例中，本公开提供了分离的细菌，所述分离的细菌包括保藏号为DSM 32891的小克里斯滕森氏菌菌株或源自其的菌株的基因修饰的突变体。

所述分离的细菌可以是活的或非活的。

在示例性实施例中，本公开提供了从本文所描述的细菌获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任何组合。

在示例性实施例中，本公开提供了组合物，所述组合物包括保藏号为DSM 32891的小克里斯滕森氏菌菌株的细菌。所述组合物还可以包括至少一种生物活性组分。所述组合物可以包括至少一种微生物，所述至少一种微生物具有与所述细菌不同的菌株，所述细菌可以是肠道细菌或乳酸菌。所述组合物可以是药物组合物。所述组合物可以进一步包括至少一种药学上可接受的媒剂和/或赋形剂。所述组合物可以以适合于口服、舌下、经鼻、支气管、淋巴、直肠、透皮、吸入或肠胃外施用的形式呈递。所述组合物可以是营养组合物。所述组合物可以是食料、补充剂、营养品、益生菌或合生素。所述食料可以选自由以下构成的列表：乳制品、植物制品、肉制品、开胃酒、巧克力、饮料或婴儿食物。所述组合物的细菌浓度可以介于10

所述细菌可以被冷冻干燥，其中所述组合物任选地包括冻干保护剂，如糖、糖醇、氨基酸或多元醇。所述冻干保护剂可包括糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、海藻糖、右旋糖酐、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、乳果糖、麦芽糖、葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇或异麦芽酮糖；氨基酸，如精氨酸或组氨酸；溶致盐，如硫酸镁；多元醇，如丙二醇、甘油，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)；或明胶、糊精、右旋糖酐、改性淀粉、羧甲基纤维素或羟丙基-β-环糊精或其组合。

所述药学上可接受的媒剂和/或赋形剂可以包括冷冻保护剂如甘油或选自糖的冷冻保护剂，如蔗糖、果糖、海藻糖；糖醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇；多糖，如纤维素、淀粉、树胶、麦芽糊精；聚醚，如聚丙二醇、聚乙二醇、聚丁二醇；抗氧化剂，如天然抗氧化剂如抗坏血酸、β-胡萝卜素、维生素E、谷胱甘肽、化学抗氧化剂；油，如菜籽油、葵花籽油、橄榄油；表面活性剂，如Tween20、Tween80、脂肪酸等；蛋白胨，如大豆蛋白胨、小麦蛋白胨、乳清蛋白胨；色氨酸、维生素、矿物质如铁、锰、锌；水解产物，如蛋白质水解产物，如乳清粉、麦芽提取物、大豆；氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核苷酸、核碱基如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷；酵母提取物；牛肉提取物；生长因子；脂质；以及其组合。

在示例性实施例中，本公开提供了一种用作药品的如本文所公开的细菌或组合物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种治疗方法，其包括将如本文所公开的分离的细菌或组合物施用于有需要的受试者。

在示例性实施例中，本公开提供了一种如本文所公开的分离的细菌或组合物，其用于预防和/或治疗情绪障碍。

在示例性实施例中，本公开提供了一种预防和/或治疗情绪障碍的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种如本文所公开的分离的细菌或组合物，其用作治疗心理状态的改变的佐剂。

一种治疗和/或预防心理状态改变的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

所述情绪障碍可以选自包括以下的列表：抑郁症、重度抑郁症、非典型抑郁症、典型或忧郁性抑郁症、精神病性抑郁症、紧张性抑郁症、产前和产后抑郁症、双相障碍、季节性情感障碍、心境恶劣、抑郁性人格障碍、双重抑郁症、未指定的抑郁症、复发性短暂抑郁症、轻度抑郁症、精神状态改变和通过物质滥用或通过使用药物如滥用药物引起的情绪障碍。

在示例性实施例中，本公开提供了如本文所公开的分离的细菌或组合物的用途，其用于制备食物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种制备食物的方法，其包括混合如本文所公开的分离的细菌或组合物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种如本文所公开的分离的细菌或组合物，其用于预防和/或治疗应激障碍。

在示例性实施例中，本公开提供了一种治疗或预防应激障碍的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

所述应激障碍可以选自反应性依恋障碍、去抑制型社会参与障碍、创伤后应激障碍(PTSD)、急性应激障碍和调节障碍。

在示例性实施例中，本公开提供了一种如本文所公开的分离的细菌或组合物，其用于预防和/或治疗焦虑性障碍。

在示例性实施例中，本公开提供了一种治疗或预防焦虑性障碍的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

所述焦虑性障碍可以选自惊恐发作、惊恐障碍、广场恐惧症、社交恐惧症或社交焦虑性障碍、强迫症、创伤后应激障碍(ASD)、广泛性焦虑性障碍或急性应激障碍。

在示例性实施例中，本公开提供了一种用作药物的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种克里斯滕森氏菌科细菌，特别是分离的克里斯滕森氏菌科细菌或包括克里斯滕森氏菌科细菌的组合物，其用于预防和/或治疗情绪障碍、应激障碍、焦虑性障碍和/或偏头痛。

在示例性实施例中，本公开提供了一种治疗或预防情绪障碍、应激障碍、焦虑性障碍和/或偏头痛的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的细菌或组合物。

在示例性实施例中，本公开提供了一种克里斯滕森氏菌科细菌或包括克里斯滕森氏菌科细菌的组合物，其用作用于治疗情绪障碍和/或应激障碍和/或焦虑性障碍和/或偏头痛的佐剂。

在示例性实施例中，本公开提供了一种治疗或预防情绪障碍和/或应激和/或焦虑的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的分离的细菌或组合物。

所述情绪障碍可以选自包括以下的列表：抑郁症、重度抑郁症、非典型抑郁症、典型或忧郁性抑郁症、精神病性抑郁症、紧张性抑郁症、产前和产后抑郁症、双相障碍、季节性情感障碍、心境恶劣、抑郁性人格障碍、双重抑郁症、未指定的抑郁症、复发性短暂抑郁症、轻度抑郁症、精神状态改变和通过物质滥用或通过使用药物如滥用药物引起的情绪障碍。

在本文所公开的方法和用途中，所述克里斯滕森氏菌科细菌可以是克里斯滕森氏菌属的细菌。所述克里斯滕森氏菌科细菌可以选自物种小克里斯滕森氏菌、提蒙类克里斯滕森氏菌(Christensenella timonensis)、马赛类克里斯滕森氏菌(Christensenellamassiliensis)或其任何组合。所述克里斯滕森氏菌科细菌可以是保藏号为DSM 102344的马赛类克里斯滕森氏菌菌株或保藏号为DSM 102800的提蒙类克里斯滕森氏菌菌株、其任何组合。所述克里斯滕森氏菌科细菌可以具有小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891或其衍生物或突变体或保藏号为DSM 22607的小克里斯滕森氏菌或其衍生物或突变体或其任何组合。

在本文所公开的方法和用途中，所述克里斯滕森氏菌科细菌可以呈活细胞的形式和/或呈非活细胞的形式。

在本文所公开的方法和用途中，所述克里斯滕森氏菌科细菌可以包括与保藏号为DSM 32891的所述小克里斯滕森氏菌菌株的16S rRNA序列(SEQ ID NO:3)具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或至少99.5％同一性的16S rRNA序列，或可以包括保藏号为DSM 32891的所述小克里斯滕森氏菌菌株。

本文所公开的方法和用途可以用于选自人或非人动物的受试者。示例性非人动物包含伴侣动物、牲畜、动物园动物、哺乳动物、狗、猫、豚鼠、雪貂、仓鼠、猪、牛、山羊、绵羊、马、小鼠和大鼠。

在本文所公开的方法和用途中，可以包括施用介于10

在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变体并不旨在排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，本发明的其它目标、优点和特征将部分地从描述中以及部分地从本发明的实践中变得清楚。提供以下实例和附图作为说明，并且不旨在限制本发明。

附图说明

图1：在蔗糖偏好试验(SPF)中评估在暴露于急性社会应激的C57BL/6小鼠(n＝10/组)中施用短双歧杆菌MF217(1×10

图2：在悬尾试验(TST)中评估在暴露于急性社会应激的C57BL/6小鼠(n＝10/组)中施用短双歧杆菌菌株MF217(1×10

图3A-3D：评估在暴露于社会应激的C57BL/6小鼠中施用小克里斯滕森氏菌DSM32891(1×10

实例

接下来，将通过一些试验来说明本发明，这些试验表明了根据本发明的示例性产物的性质和有效性。这些实例旨在说明而非限制本发明，本发明仅由权利要求书限制。

实例1.克里斯滕森氏菌的分离和鉴定

专利目标的生物材料是从健康志愿者的粪便中分离的，将所述生物材料加工并接种到肠道菌群培养基(GMM)中，所述生物材料的组合物基于具有发明人设计的修改的先前出版物[18],[19]中推荐的介质。所述修改由在厌氧室中发酵处理过的粪便，同时保持恒定的pH，持续24小时组成。发酵的GMM培养基用作含0.5％纤维蛋白血的苛养厌氧菌琼脂(FAA)培养基的补充，所述培养基用于在厌氧室中在37℃下温育板72小时之后接种粪便的系列稀释液并分离菌落。从生长的菌落中分离出小克里斯滕森氏菌DSM 32891。

通过在ABI 3730XL测序仪中通过桑格(Sanger)测序技术使用27f(SEQ ID NO:1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1401r(SEQ ID NO:2:5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3')引物对16S rRNA基因(1.26Kb)进行测序来进行鉴定。通过将获得的序列与NCBI数据库和BLASTn算法中的序列进行比较，分离出的菌株DSM 32891被鉴定为物种小克里斯滕森氏菌，具有100％同一性百分比。完整序列(SEQ ID NO:3)如下所示：

>小克里斯滕森氏菌DSM 32891的16S rRNA基因序列

ACTTCATGTGGGCGGGTTGCAGCCCACAATCCGAACTGGGACCGGCTTTTTGAGATTCGC

TTCCCCTTACGGGTTCGCTGCCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAGA

CATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGTCCCCGGCAGTC

TCACTAGAGTTCCCGCCTTTACGCGCTGGCAACTAGCAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG

GACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCTCTG

CCCCGAAGGGAAACTGTATCTCTACAGTCGTCAGAGGATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCT

TCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

TTGAGTTTCAACCTTGCGATCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTAATGCGTTTGCTTCGGC

ACGGAACCCTATCGGGCCCCACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT

ATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTTACAGTCCAGAAAGT

CGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTC

CACTTCCCTCTCCTGTACTCAAGTCACACAGTTTCAAATGCAACCCCGGGGTTAAGCCCC

GGTCTTTCACATCTGACTTACATGACCACCTACGCACCCTTTACGCCCAGTAATTCCGGA

CAACGCTTGCTCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGAGCTTCCTC

CTATGGTACCGTCATTTCTTTCGTCCCATAGGACAAAGGTTTACAATCCGAAGACCTTCT

TCCCTCACGCGGCGTTGCTGGGTCAGGGTTTCCCCCATTGCCCAATATTCCCCACTGCTG

CCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTC

GGCTACCCATCGTTGACTTGGTGGGCCGTTACCTCACCAACTATCTAATGGGACGCGAGC

CCATCCTGCATCGAATAAATCCTTTTACCTCAAAACCATGCGGTTTCGTGGTCTCATGCG

GTATTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTGTCCCCCGTTGCAGGGCAGGTTGCTCACGCGTTAC

TCACCCGTCCGCCACTCGGTATACCCACAGTTCCTCCCGAAGGATTCACAAAGGGCAACC T

实例2.小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891在由社会应激诱导的抑郁症动物模型中的作用。

已进入青春期的雄性C57BL/6小鼠(出生后第32天，法国莱斯昂辛斯的查尔斯河(Charles River,Les Oncins,France))用于此研究。所述小鼠保持在温度(23℃)、相对湿度(40-50％)和12小时光照/黑暗周期的受控条件下并且用标准饮食(D12450K，丹麦布罗加登的研究饮食公司(Research diet,Brogaarden,Denmark))喂养11周(第一周将所述小鼠保持在准备防止可能的人畜共患病的房间中的隔离区)。将小鼠随机分为四个实验组(n＝10)。用于比较目的对照组(C)、应激组(S)、用小克里斯滕森氏菌DSM 32891处理的组(S+C.min)和用短双岐杆菌(Bifidobacterium breve，B.breve)MF217处理的组(S+短双岐杆菌)。用口服剂量的悬浮在10％脱脂牛奶中的根据本发明的细菌菌株(1×10

为了诱导急性社会应激，使用了基于居民-入侵者范式的动物社交挫败模型[20]。在此模型中，允许两只动物(居民)之一在其自己的笼子中建立领土。接下来，将研究小鼠(入侵者)(在此情况下为C57BL/6雄性)逐一引入居民小鼠的笼中。为此，使用了侵略性的CD-I菌株成年雄性(四周龄)(法国莱斯昂辛斯的查尔斯河)(作为居民侵略者)，其先前已被隔离并且训练为更具侵略性。持续连续四天，进行了动机争胜性相遇(将原初小鼠引入居民的笼中，持续十分钟)，其中允许所述小鼠之间的物理接触，并且其中入侵者小鼠遭受高水平的应激(反映在高水平的皮质酮生产中)。动机争胜性相遇发生在中性房间里，并且不是在通常饲养所述小鼠的动物设施里。实验小鼠(入侵者)在遭受对手的侵略(威胁/攻击)之后，显示出逃避或逃逸行为，以及防御/顺从行为。用来定义动物是否被挫败的标准是采用指示挫败的特定姿势。所述姿势的特征在于前肢无力、头部成角度向上并且耳朵缩回的直立顺从姿势[21]。

对照组没有遭受社交挫败；然而，与用于进行动机争胜性相遇的小鼠完全相同，此组中的所有小鼠被引入笼子中，持续十分钟。持续十分钟，所述小鼠在没有与任何对手接触的情况下探察笼子。

在进行动机争胜性相遇之前，所述动物禁食了12个小时。社交挫败之后，立即将动物暴露于食物、水和含3％蔗糖的水中两个小时。

进行了3％蔗糖偏好试验，以评估与抑郁行为相关的享乐/失乐行为。失乐行为(无法感到愉悦)被认为是抑郁症最明显的症状之一[22]。不同的动物研究已示出，沮丧的动物少消耗3％蔗糖水，这被认为是失乐行为。

所述试验由以下组成：剥夺动物的水12小时，然后将所述动物暴露于两种选项下：水或含3％溶解的蔗糖的水。在两个小时的试验期间更换了具有蔗糖和水的瓶子，以确保没有与位置偏好相关的影响。在这两个小时期间摄入的3％蔗糖量将指示享乐/失乐行为。较低的蔗糖摄入将指示快感缺乏。蔗糖偏好的计算为摄入的蔗糖相对于所消耗液体总量的百分比，通过体重进行校正。

结果(图1)指示，受应激的动物(S)摄入的蔗糖比对照小鼠(C)显著少3％(p<0.01)，这指示失乐并且因此抑郁性行为。用短双岐杆菌处理受应激的小鼠(S+B.bre)部分纠正了快感缺乏，但这种改善不显著。然而，用小克里斯滕森氏菌处理受应激的小鼠(S+C.min)确实可以完全纠正抑郁性行为(p<0.05)，这指示相对于短双岐杆菌，有效性更高。

用胶带将小鼠从桌子的边缘悬挂下来，将胶带放置在距尾尖大约1cm的位置，由此所述小鼠无法逃脱或悬挂在附近表面上。量化了旨在试图逃跑的行为，持续五分钟的静止时间也被量化。在试验持续的五分钟内记录不动的时间(作为减动力的量度)。此测试通常用于评估小鼠的抑郁性行为[21]。

结果(图2)指示，相对于所述小鼠移动的时间(p<0.001)，受应激的动物(S)保持静止的时间显著更多，而对照小鼠(C)没有示出显著差异。这指示了抑郁性行为，因为动物没有试图逃脱，而是放弃了，示出几乎没有生存的动力。用短双岐杆菌(S+B.bre)处理受应激的小鼠不能改善这种抑郁性行为，在静止时间与维持小鼠移动的时间之间存在显著差异(p<0.001)。然而，用小克里斯滕森氏菌(S+C.min)处理受应激的小鼠确实可以纠正这种抑郁性行为，从而减少了小鼠静止的时间，使得两次测量之间的差异减小并且不显著。

这些结果表明，与可能的常规益生菌(如短双岐杆菌)相比，用小克里斯滕森氏菌口服治疗在改善急性社会应激诱导的抑郁模型中的抑郁行为方面示出更大的功效。

两种试验的结果首次表明，用小克里斯滕森氏菌进行的处理会纠正已暴露于急性社会应激的小鼠的抑郁性行为。数据表明，与传统的益生菌相比，小克里斯滕森氏菌将是更好的选择作为用于改善情绪障碍，如抑郁性行为。

实例3.菌株小克里斯滕森氏菌DSM 32891对由社会应激诱导的抑郁症动物模型中的应激标志物的作用。

此实例报告了小克里斯滕森氏菌DSM 32891对社会应激和抑郁症动物模型(10天)中应激标志物的作用。

在此研究中，使用了雄性C57BL/6小鼠(法国莱斯昂辛斯的查尔斯河)。将小鼠保持在受控温度(23℃)、相对湿度(40-50％)和12小时光照/黑暗周期的条件下，并且用标准饮食(D12450K，丹麦布罗加登的研究饮食公司)喂养。将小鼠随机分为3个实验组(n＝15/组)。所述三组为：对照组(C)、受应激组、未经处理(S)和用小克里斯滕森氏菌DSM 32891(S+M)治疗的受应激组。

S+M组的小鼠每天用悬浮在PBS+20％甘油中的小克里斯滕森氏菌DSM 32891细菌菌株(1×10

施用了小克里斯滕森氏菌或安慰剂对受应激小鼠的处理，持续38天。处理2周之后开始进行社交挫败方案(10天)。所使用的模型改编自居民-入侵者范式[20]，并且相遇的时间减少到5分钟。使用成年雄性菌株CD-1(4周龄)作为侵略性小鼠(法国莱斯昂辛斯的查尔斯河)，先前对其进行了分离并训练为更具侵略性。在连续的10天期间，进行了动机争胜性相遇(将攻侵略性小鼠引入居民的笼子中5分钟)，其中使它们之间发生物理接触，并且其中居民小鼠遭受了很大程度的应激。动机争胜性会面发生在中性房间里，并且不是在通常所住的动物房间里。实验小鼠在遭受对手的侵略(威胁/攻击)之后示出逃避或逃逸行为，以及防御/顺从行为。用来定义动物是否被挫败的标准是采用意指挫败的特定姿势。它的特征在于竖直顺从姿势：前腿松弛、头部向上倾斜并且耳朵缩回[21]。

对照组没有遭受社交挫败；然而，与用于进行动机争胜性相遇的小鼠相同，此组中的所有小鼠被放置笼子中，持续5分钟。持续5分钟，所述小鼠在没有与任何对手接触的情况下探察笼子。

38个天之后，通过颈脱位法处死小鼠并收集血液样品。

在以下时间点测试血液样品中的肾上腺素、去甲肾上腺素、血清素和多巴胺水平：在社会应激前的基线、社会应激的第1天的动机争胜性相遇的4小时和社会应激的第10天的动机争胜性相遇后4小时。结果示出于图3A-3D中；在每个实验组中(C：对照组，S：用安慰剂处理的受应激动物，或S+M：用小克里斯滕森氏菌处理的受应激动物)，基线(应激前)、第1天(社交挫败的第1天之后)和第10天(社交挫败的第10天之后)时间点的结果从左到右示出。

结果指示，社交挫败后10天，受应激动物(S)的血液中肾上腺素水平增加(图3A)。用小克里斯滕森氏菌进行处理防止肾上腺素水平增加。通过去甲肾上腺素水平观察到类似的趋势(图3B)。

另外，社交挫败后10天，受应激动物(S)的血液中血清素水平降低(图3C)。与未经处理的受应激小鼠相比，用小克里斯滕森氏菌(S+M)处理受应激小鼠不仅预防受应激小鼠血清素水平的这种降低，而且在应激后10天增加血清素水平。用小克里斯滕森氏菌对受应激小鼠的处理也显著增加了血液中多巴胺的水平(图3D)。在对照小鼠和未经处理的受应激小鼠中均未观察到这种情况。

这些结果表明，用小克里斯滕森氏菌进行处理有效抑制应激对特定标志物(肾上腺素、去甲肾上腺素)增加的作用，并且在应激期间增加血液中血清素和多巴胺的水平。

实例4.小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891的序列表征

本实例描述小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891的基因组序列与属于克里斯滕森氏菌科的细菌的其它菌株的比较。

基因组比较是使用基因组到基因组距离计算器v2完成的。1式2[25]用于确定每个菌株与小克里斯滕森氏菌菌株DSM 32891之间的数字DNA-DNA杂交(dDDH)评分。如果dDDH高于70％，则菌株属于同一物种。如果dDDH高于79％，则菌株属于相同的物种和亚种。如果dDDH为100％，则菌株是相同的[26]。

示出于上表中的此分析表明，菌株DSM 32891与菌株提蒙类克里斯滕森氏菌和马赛类克里斯滕森氏菌相比，dDDH低于70％，证实它们属于不同物种。这与DSM 32891属于小克里斯滕森氏菌物种的事实是一致的。

这还示出了菌株DSM 32891和菌株DSM 22607的dDDH为96.5％，高于79％，并属于相同的亚种，但属于不同的菌株。

这证实了菌株DSM 32891是属于物种小克里斯滕森氏菌的新型菌株。

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16.Yu,M等人,“通过16S rRNA基因测序和基于LC/MS的代谢组学研究，与抑郁症相关的肠道菌群和粪便代谢表型的变化(Variations in gut microbiota and fecalmetabolic phenotype associated with depression by 16SrRNA gene sequencing andLC/MS-based metabolomics)”《药学和生物医学分析杂志(J Pharm Biomed Anal)》,2017.138:第231-239页。

17.I.Mironova、I.Z.、N.Zhukova、V.Alifirova、A.Latypova、O.Izhboldina、M.Nikitina、V.Petrov、M.Titova,“患有帕金森氏病的患者的情感障碍和微生物组(Affective disorders and microbiome in patients with Parkinson's disease)”(PR2063).《欧洲神经病学杂志(European Journal of Neurology)》,2017.24(增刊1):第445-678页。

18.Gibson GR,C.J.、Macfarlane GT.,“使用三阶段连续培养系统研究粘蛋白对人肠道细菌混合群体异化硫酸盐还原和甲烷生成的影响(Use of a three-stagecontinuous culture system to study the effect of mucin on dissimilatorysulfate reduction and methanogenesis by mixed populations of human gutbacteria)”《应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol.)》1988年11月；54(ll),1988.11月；54(11):第2750-5页。

19.Lesmes,U.等人,“抗性III型淀粉多晶型物对人肠道模型中人结肠微生物群和短链脂肪酸的影响(Effects of resistant starch type III polymorphs on humancolon microbiota and short chain fatty acids in human gut models)”《农业与食物化学杂志(J Agric Food Chem)》,2008.56(13):第5415-21页。

20.Tamashiro,K.L.、M.M.Nguyen和R.R.Sakai,“社会应激：从啮齿动物到灵长类动物(Social stress:from rodents to primates)”《神经内分泌学前沿(FrontNeuroendocrinol)》,2005.26(1):第27-40页。

21.Can,A.等人,“悬尾试验(The tail suspension test)”《可视实验杂志(J VisExp)》,2012(59):第e3769页。

22.Duncko,R.等人,“暴露于抑郁症的慢性轻度应激模型的大鼠外周器官系统功能的改变(Altered function of peripheral organ systems in rats exposed tochronic mild stress model of depression)”《细胞和分子神经生物学(Cell MolNeurobiol)》,2001.21(4):第403-11页。

23.Ngondo,S等人,“提蒙类克里斯滕森氏菌，一种从人肠道分离的新细菌物种(Christensenella timonensis,a new bacterial species isolated from the humangut)”《新细菌和新感染(New Microbe and New Infect)》2016；13:32-33。

24.Ngondo,S等人,“马赛类克里斯滕森氏菌，一种从人肠道分离的新细菌物种(Christensenella massiliensis,a new bacterial species isolated from the humangut)”《新细菌和新感染》2016；12:69-70。

25.Meir Kolthof JP等人,“具有置信区间和改进的距离函数的基于基因组序列的物种定界(Genome seguence-based species delimitation with confidenceintervals and improved distance functions)”,《BMC生物信息学(BMCBioinformatics)》第14卷,文章编号:60(2013)。

26.Meir Kolthof JP等人,“DSM 30083

27.Morotomy M等人,“按梭状芽孢杆菌顺序形成独特分支的分离自人粪便的小克里斯滕森氏菌新属、新种的描述和克里斯滕森氏菌科新科的建议(Description ofChristensenella minuta gen.nov.,sp.nov.,isolated from human faeces,whichforms a distinct branch in the order Clostridiales,and proposal ofChristensenellaceae fam.nov.)”,《国际系统与进化微生物学杂志(InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology)》(2012),62,144-149。

序列表

<110> 最高科研理事会(CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS(CSIC))

<120> 包含小克里斯滕森氏菌的克里斯滕森氏菌科细菌及其用途

<130> PPI21171003US

<150> ES P201831153

<151> 2018-11-28

<160> 3

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 小克里斯滕森氏菌(Christensenella minuta)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 小克里斯滕森氏菌(Christensenella minuta)

<400> 2

cggtgtgtac aagaccc 17

<210> 3

<211> 1261

<212> DNA

<213> 小克里斯滕森氏菌(Christensenella minuta)

<400> 3

acttcatgtg ggcgggttgc agcccacaat ccgaactggg accggctttt tgagattcgc 60

ttccccttac gggttcgctg ccctttgtac cggccattgt agcacgtgtg tagcccaaga 120

cataaggggc atgatgattt gacgtcgtcc ccaccttcct ccgagttgtc cccggcagtc 180

tcactagagt tcccgccttt acgcgctggc aactagcaat aagggttgcg ctcgttgcgg 240

gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtctctctg 300

ccccgaaggg aaactgtatc tctacagtcg tcagaggatg tcaagccttg gtaaggttct 360

tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc cgctgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 420

ttgagtttca accttgcgat cgtactcccc aggcgggata cttaatgcgt ttgcttcggc 480

acggaaccct atcgggcccc acacctagta tccatcgttt acggcgtgga ctaccagggt 540

atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcctcagtg tcagttacag tccagaaagt 600

cgccttcgcc actggtgttc ctcctaatat ctacgcattt caccgctaca ctaggaattc 660

cacttccctc tcctgtactc aagtcacaca gtttcaaatg caaccccggg gttaagcccc 720

ggtctttcac atctgactta catgaccacc tacgcaccct ttacgcccag taattccgga 780

caacgcttgc tccctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gagcttcctc 840

ctatggtacc gtcatttctt tcgtcccata ggacaaaggt ttacaatccg aagaccttct 900

tccctcacgc ggcgttgctg ggtcagggtt tcccccattg cccaatattc cccactgctg 960

cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag ttccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc 1020

ggctacccat cgttgacttg gtgggccgtt acctcaccaa ctatctaatg ggacgcgagc 1080

ccatcctgca tcgaataaat ccttttacct caaaaccatg cggtttcgtg gtctcatgcg 1140

gtattagcag tcgtttccaa ctgttgtccc ccgttgcagg gcaggttgct cacgcgttac 1200

tcacccgtcc gccactcggt atacccacag ttcctcccga aggattcaca aagggcaacc 1260

t 1261