水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用

摘要

本申请公开水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用。先在水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取靶标片段，以pBWA(V)H‑cas9为表达载体，将水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取的靶标片段的靶序列插入到pBWA(V)H‑cas9载体上，得到的pBWA(V)H‑cas9‑OsMAPKKK5重组质粒转化到转基因受体籼稻炳1B中，筛选得到OsMAPKKK5基因突变株的株高为97.5±2.66cm,千粒重21.83±0.42g,相比籼稻炳1B的株高最高提高14.1%，千粒重最高提高21.7%。

说明书

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，具体涉及水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用。

背景技术

水稻是世界上许多国家的主要粮食作物，大约有60％的人口以大米为主食，因此提高水稻产量一直是育种家们的主要目标。上世纪五六十年代第一次绿色革命，矮杆基因sd1的利用、作物的矮化育种，使水稻不易倒伏，从而实现产量的大幅度提高；后来杂交稻的利用，使水稻产量进一步提升。目前水稻育种进入平台期，产量徘徊不前。育种实践表明，在目前高产品种的基础上，适当增加株高、提高生物量，并增加千粒重，有望实现水稻产量的进一步提高。

株高是水稻的重要农艺性状，与水稻产量密切相关。千粒重直接影响水稻产量，粒型还与稻米的外观品质和食用品质密切相关，不同地域的消费者对稻米的外观和口感有着不同的偏爱。千粒重由籽粒大小决定，籽粒大小包括粒长、粒宽、粒厚。由于颖壳决定了籽粒的储存能力，因此它在决定籽粒大小方面起着主导作用。株高和粒型作为两个重要的水稻产量相关的性状，越来越多的调控基因被克隆。阐明水稻的株高和粒型形成的遗传与机制，对提高水稻产量和改良稻米品质同时具有十分重要的意义，也是水稻功能基因组学研究的热点之一。在本实验中，我们克隆了OsMAPKKK5基因，构建了OsMAPKKK5突变株。

本申请在OsMAPKKK5基因的CDS区域选取靶标片段，将该靶标片段构建到载体，然后转入籼稻品种炳1B中，以期获得株高和粒型改良的突变株。

发明内容

为了改良水稻的株高和粒型，本申请提供一种水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用。

本申请的一种水稻OsMAPKKK5基因在在改良水稻的株高和粒型方面的应用，采用如下技术方案：

一种水稻OsMAPKKK5基因在在改良水稻的株高和粒型方面的应用，首先在水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取靶标片段，然后以采用pBWA(V)H-cas9质粒为表达载体，将水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取的靶标片段即第二外显子2334个核苷酸中的23个核苷酸为靶序列插入到pBWA(V)H-cas9质粒后得到的pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒，然后将pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒转化到籼稻炳1B中，经PCR检测以及一代测序筛选得到的株高提高、粒型改善的OsMAPKKK5基因突变株。

本申请中以籼稻炳1B为例进行说明，但不限制在其他水稻品种中应用获得的株高和粒型改良的突变株。

上述的一种水稻OsMAPKKK5基因在在改良水稻的株高和粒型方面的应用，具体包括如下步骤：

(1)、靶标序列的选取

水稻OsMAPKKK5基因(GenBank:XM_015776316.2)，该登陆基因序列全长7153bp，其中编码区长2334bp，5’端非编码区长305bp，3’端非编码区长536bp，序列如SEQ.ID NO1.所示；编码区CDS区域选取的靶标序列全长23bp，序列如SEQ.ID NO2.所示；编码777个氨基酸，序列如SEQ.ID NO3.所示。

水稻OsMAPKKK5基因结构见图1所示，其中黑框表示翻译区，白框表示非翻译区，线段表示内含子；

(2)、含有OsMAPKKK5基因中靶标序列的表达载体的构建

采用pBWA(V)H-cas9为载体，利用水稻OsPDCD5基因的CDS区域的靶标序列如SEQ.ID NO2.所示作为靶标位点，构建用于水稻OsPDCD5基因打靶的pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5质粒，最终得到pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒；

其中所述pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒含有具有所述靶标序列的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，其结构图如图2所示。

(3)、pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的转化

将pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒转化农杆菌EHA105(购于上海唯地生物技术有限公司,Agrobacterium tumefaciens),具体操作方法为：

①按体积百分比为10％的比例，将10μL含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的溶液加入到100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，依次冰上放置30min、浸入液氮中5min，37℃水浴5min，完成转化，得到含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞；

②按体积百分比为22％的比例，将110μL上述得到的含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞加入到500μL不加抗生素的LB液体培养基(生工Sangon Biotech,B540111)控制温度为28℃、转速为150-160rpm，培养3-4h，得到培养液；③将②所得的培养液控制转速4000rpm离心10min收集菌体，将离心收集到的菌体用为培养液体积11％的离心后所得的上清混匀，然后涂在含有20ug/ml利福平、40ug/ml庆大霉素和50ug/ml卡那霉素的LB平板培养基上(这里所述的LB平板培养基的配制方法：1000mlLB液体培养基+15g agar powder(Genebase Gene Tech,A-2180)+三种抗生素)28℃培养36-72h，在LB平板培养基上形成菌斑；

用牙签挑菌斑于LB液体培养基中进行菌斑PCR鉴定，PCR鉴定成功的菌斑即为转化子，所述的转化子为含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105，命名为EHA105/cas9-OsMAPKKK5；

挑取有阳性条带的PCR鉴定成功的菌斑1个进行1.5ml EP管接菌并置于28℃摇床中培养，这样就得到了含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105种子液；

上述1.5ml EP管中含有1ml的含有20ug/ml利福平、40ug/ml庆大霉素和50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基；

(4)、炳1B成熟种子愈伤的诱导与培养

取炳1B成熟种子去壳，在无菌条件下，先用75％乙醇浸洗10-15min，无菌水清洗3-5次，然后再转入体积百分比为0.1％的氯化汞水溶液中浸泡20-30min后用无菌水清洗3-5次，得到无菌的炳1B成熟种子；

然后将上述所得的无菌的炳1B成熟种子接种于诱导培养基中，控制温度为26-28℃黑暗条件下进行诱导愈伤15-20天，然后转入新的诱导培养基或继代培养基，继续诱导愈伤7-10天，得到愈伤组织；

(5)、农杆菌侵染

①将500μL含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105种子液接种至50mlYEP液体培养基中，控制温度为26-28℃培养12-16h,收集菌液,并用YEP液体培养基(YEP液体培养基：按每升计算含有：牛肉浸膏10g，酵母提取液10g，NaCl 5g，pH＝7.0，余量为水)进行稀释,至含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌的菌液浓度为OD600≈0.5；

②将(4)中得到的籼稻炳1B愈伤组织在无菌滤纸上晾一下，然后一次性转入到OD600≈0.5的含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌的菌液中并混合均匀，然后控制温度为28℃、转速为150rpm浸泡10～30min，然后倒出菌液，得到被感染的愈伤组织；

③将步骤②所得的被感染的愈伤组织在无菌滤纸上放置至菌液吸干，然后转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在培养箱中控制温度为26-28℃暗培养5～7天，得到被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织；

上述共培养过程③中注意不要经常开培养箱，以免温度变化太大，产生水膜；

(6)、抗性愈伤组织的筛选

①将上述所得的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织分别加入到100ml的三角瓶中，并用无菌水清洗3-5次，倒净无菌水，再用含50mg/L利福平与50mg/L卡那霉素抗性的无菌水清洗2-3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤组织转移至初级筛选培养基中，进行初级筛选15-20min，重复上述动作2-3次，得到弱抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织；

②然后将①中得到的弱抗性愈伤组织倒在无菌滤纸上吸干2h左右，得到干燥的弱抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织；

③将干燥的弱抗性愈伤组织转入次级筛选培养基中，控制温度为26-28℃的条件下进行次级筛选15-20天，筛选完成后，得到强抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织。

(7)、抗性愈伤组织的分化

将上述所得的强抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织移入初级分化培养基中，在26℃、16h光照/每天的条件下培养15～20天，然后移入至次级分化培养基，继续在26℃、16h光照/每天的条件下培养15～20天，直至长出1-5cm绿芽，剥去周围多余的愈伤，剪去根，可留约0.5cm长，然后移入生根壮苗培养基中进行生根培养，得到幼苗；

得到的幼苗高约10-15cm，根系旺盛，对得到过于细小的幼苗通过剪根、剪叶和再次转培，使幼苗强壮；

将上述得到的幼苗加入1cm深的常温灭菌水，在25-30℃、相对湿度＞50％的环境中过渡培养2天，然后清洗附着于根部的培养基，将其移栽于有灭菌土的容器中，并移至温室进行培养115-125天，得到T0代转化植株；

在温室28℃条件下培养T0代转化植株至结出种子，得到T1代种子，检测植株是否含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒，并将其中阳性的T1种子进行加代繁殖，得到T2代种子，检测植株是否已完全将OsMAPKKK5基因敲除，并将其中的阳性种子加代繁殖，得到T3代种子，cas9-MAPKKK5-2-1或cas9-MAPKKK5-3-8即为株高提高、粒型改善的OsMAPKKK5基因突变株。

本申请仅以籼稻柄1B为例进行说明，得到的2个比籼稻炳1B株高提高、粒型改善的OsMAPKKK5基因突变株分别是cas9-OsMAPKKK5-2-1植株、cas9-OsMAPKKK5-3-8植株，但并不限制OsMAPKKK5基因在其他水稻品种中用于提高株高、改善粒型的应用。

本申请具有以下有益效果：

一种水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用，由于将OsMAPKKK5基因的CDS区域选取靶标序列构建到载体并转入野生型籼稻炳1B中，所得到的cas9-OsMAPKKK5-2-1植株、cas9-OsMAPKKK5-3-8植株，株高、粒型均有所改良，相对于野生型籼稻炳1B来说，cas9-OsMAPKKK5-2-1植株、cas9-OsMAPKKK5-3-8植株的株高分别平均增加7.8％、4.1％，最大可达14.1％和10.5％；粒长分别平均增加4.3％、3.6％，最大可达6.8％、6.7％；粒宽分别平均增加3.7％、2.5％,最大可达6.5％、5.7％，其粒型得到改善；

进一步相对于野生型籼稻炳1B来说，所得到的cas9-OsMAPKKK5-2-1植株、cas9-OsMAPKKK5-3-8植株的千粒重有明显的提高，千粒重最高分别提高了15.4％、12.7％，最大可达21.7％和20.4％。。

附图说明

图1为水稻OsMAPKKK5基因结构；

图2为pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的结构图；

图3为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的种子颗粒对照图；

图4为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的稻穗形态对照图；

图5为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的整个植株形态对照图；

图6a为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的株高柱状图；

图6b为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的千粒重柱状图；

图6c为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的粒长柱状图；

图6d为野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的粒宽柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本申请进行进一步阐释，但并不限制本申请。

本申请各实施例中所用各种培养基组成如下表所示：

(注：115℃高压灭菌20min)

本申请的具体实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

水稻OsMAPKKK5转基在改良水稻的株高和粒型方面的应用，具体包括如下步骤：

(2)、pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5载体的构建：

①酶切位点Eco31I(BsaI)设计在cas9-MAPKKK5-F:cagtGGTCTCaggcATCCGCAGCCGCGGTTGACC,其序列如SEQ ID NO.4所示和cas9-MAPKKK5-R:cagtGGTCTCaaaaCCTGGTCAACCGCGGCTGCG,其序列如SEQ ID NO.5所示中，然后使用引物cas9-MAPKKK5-F和cas9-MAPKKK5-R扩增OsMAPKKK5基因的CDS区域中23bp的靶标序列，核苷酸序列为：ATCCGCAGCCGCGGTTGACCAGG，获得包含有酶切位点Eco31I(BsaI)的PCR产物：

cagtGGTCTCaggcaATCCGCAGCCGCGGTTGACCAGGttttGAGACCagtg，将该PCR产物命名为OsMAPKKK5。

②琼脂糖电泳后割胶回收PCR产物OsMAPKKK5，并使用试剂盒(生工SangonBiotech,B518131)纯化该DNA片段，得到PCR纯化产物OsMAPKKK5。

配制酶切连接体系，总体积20μL的酶切连接体系中各原料组成及含量如下表：

将按上述组成和含量配制的20μL酶切连接体系在PCR仪(Bio-Rad S0000ThermalCycler)经过37℃for 20min，5cycles；37℃for 10min；20℃for 10min；37℃for 20min处理后，得到pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5连接产物。

④吸取步骤中的5μL的pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5连接产物加到大肠杆菌DH5α感受态细胞(购于上海唯地生物技术有限公司)中，冰上孵育30min，42℃热激1min，冰上孵育2min，加入900μL LB培养基，37℃培养1h进行大肠杆菌DH5α感受态细胞的活化复苏。

将复苏后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布在含有LB固体培养基(含有卡那霉素)的培养皿在37℃培养箱倒置培养12h，得到的大肠杆菌DH5α单克隆进行菌斑PCR鉴定。

⑤挑取8个菌斑进行菌斑PCR鉴定(李华，刘延琳等，菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定方面的应用，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2004年9月第32卷，35-37页)是否连接成功。

鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA，其序列如SEQ ID NO.6所示,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，其序列如SEQ ID NO.7所示，扩增片段长度为422bp，PCR鉴定成功的阳性条带序列与标准序列比对,标准序列如SEQ ID NO.8所示。

取琼脂糖电泳检测有阳性条带的对应的其中3个菌斑，接菌至盛有700μL含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基(生工Sangon Biotech,B540111)的1.5mlEP管中，37℃摇床培养3h，取菌液测序，结果与序列如SEQ ID NO.8的一致性判断。

将测序结果与序列如SEQ ID NO.8一致的菌液作为测序结果正确的菌液，取500μL进行保菌(500μL 50％甘油+500μL LB菌液)处理，取200μL菌液接种到2ml LB液体培养基中在37℃摇床进行扩大培养12h，之后利用质粒提取试剂盒(生工Sangon Biotech,B518191)提取质粒，得到pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒，其结构示意图如图2所示，其含有35S启动子，U6启动子，OsMAPKKK5基因的靶序列，cas9蛋白，T-nos终止子，筛选基因卡纳霉素等。

(2)、pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的转化

将pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒转化农杆菌EHA105(购于上海唯地生物技术有限公司,Agrobacterium tumefaciens),具体操作方法为：

①按体积百分比为10％的比例，将10μL的pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒加入到100μL的农杆菌EHA105感受态细胞中，依次冰上放置30min、浸入液氮中5min，37℃水浴5min，完成转化，得到含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞。

②按体积百分比为22％的比例，将110μL上述得到的含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞加入到500μL不加抗生素的LB液体培养基(生工Sangon Biotech,B540111)控制温度为28℃、转速为150rpm培养3h，得到培养液。

③将②所得的培养液控制转速4000rpm离心10min收集菌体，将离心收集到的菌体用60μL离心后所得的上清混匀，然后涂在含有20ug/ml利福平、40ug/ml庆大霉素和50ug/ml卡那霉素的LB平板培养基上(这里所述的LB平板培养基的配制方法：1000ml LB液体培养基+15g agar powder(Genebase Gene Tech,A-2180)+三种抗生素)28℃培养36-72h，在LB平板培养基上形成菌斑。

用牙签挑菌斑于LB液体培养基中进行菌斑PCR鉴定，PCR鉴定成功的菌斑即为转化子，所述的转化子为含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105，命名为EHA105/cas9-OsMAPKKK5。

挑取8个菌斑同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定所用引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA，其序列如SEQ ID NO.6所示,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，其序列如SEQ ID NO.7所示，扩增片段长度为422bp，PCR鉴定成功的阳性条带序列与标准序列比对,标准序列如SEQ ID NO.8所示。

挑取有阳性条带的PCR鉴定成功的菌斑1个进行1.5ml EP管接菌并置于28℃摇床中培养，这样就得到了含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105种子液。

上述1.5ml EP管中含有1ml的含有20ug/ml利福平、40ug/ml庆大霉素和50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基。

(3)、炳1B成熟种子愈伤的诱导与培养

取炳1B成熟种子去壳，在无菌条件下，先用75％乙醇浸洗10min后，用无菌水清洗5次，然后再转入体积百分比浓度为0.1％的氯化汞水溶液中浸泡20min后用无菌水清洗3次，得到无菌的炳1B成熟种子。

然后将上述所得的无菌的炳1B成熟种子接种于诱导培养基平板中，每直径90mm的诱导固体培养基平板上接种10粒无菌的炳1B成熟种子，接种10个平板，控制温度为26℃、黑暗条件下培养约20天，至愈伤可用，将诱导的愈伤剥下来转入继代培养基平板中，进行继代培养，继续诱导愈伤7天，得到愈伤组织。

上述如果剥下的愈伤较大时，可以通过镊子等工具将其分为小份愈伤；

注：诱导固体培养基在倒平板后在无菌操作台吹干1h以上，同时转入的愈伤应在无菌滤纸上吸干，保证继代时愈伤和诱导固体培养基之间没有水膜。

(4)、农杆菌侵染

①将500μL含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105种子液接种至50mlYEP液体培养基中，控制温度为26℃培养12h,收集菌液,并用YEP液体培养基进行稀释,至含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌的菌液浓度为OD600≈0.5,期间每隔5min测OD600。

②将步骤①中得到的籼稻炳1B愈伤组织在无菌滤纸上晾一下，然后一次性转入到OD600≈0.5的含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌的菌液中并混合均匀，然后控制温度为28℃、转速为150rpm浸泡20min，然后倒出菌液，得到被感染的愈伤组织。

③将步骤②所得的被感染的愈伤组织在无菌滤纸上放置至菌液吸干，然后转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在培养箱中控制温度为26℃、暗培养约6天，被感染的愈伤组织与YEP液体培养基接触部分有菌膜，得到被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织。

上述共培养过程③中注意不要经常开培养箱，以免温度变化太大，产生水膜。

(5)、抗性愈伤组织的筛选

①将上述所得的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织分别加入到100ml的三角瓶中，并用无菌水清洗3次，倒净无菌水，再用含50mg/L利福平与50mg/L卡那霉素抗性的无菌水清洗2次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤组织转移至初级筛选培养基中，进行初级筛选15min，重复上述动作2次，得到弱抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织。

②然后将①中得到的弱抗性愈伤组织倒在无菌滤纸上吸干2h左右，得到干燥的弱抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织。

③将干燥的弱抗性愈伤组织转入次级筛选培养基中，控制温度为26℃的条件下进行次级筛选15天，筛选完成后，得到强抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织。

(6)、抗性愈伤组织的分化

将上述所得的强抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织移入初级分化培养基中，在26℃、16h光照/每天的条件下培养15天，然后移入至次级分化培养基，继续在26℃、16h光照/每天的条件下培养15天，直至长出1-5cm绿芽，剥去周围多余的愈伤，剪去根，可留约0.5cm长，然后移入生根壮苗培养基中进行生根培养，得到10-15cm幼苗。

对得到过于细小的幼苗通过剪根、剪叶和再次转培，使幼苗强壮。

将得到的10-15cm幼苗加入1cm深的常温灭菌水，在26℃、相对湿度＞50％的环境中过渡培养2天，然后清洗附着于根部的培养基，将其移栽于有灭菌土的容器中，并移至温室进行培养115-125天，得到T0代转化植株。

(7)、转化植株筛选与检测

①采用PCR扩增检测候选的T0代转化植株,所使用的扩增引物为：

Hyg-CX-S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT，其序列如SEQ ID NO.9所示；

Hyg-CX-A：AAGATCGTTATGTTTATCGGCACT，其序列如SEQ ID NO.10所示；

检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得10个含pBWA(V)H-cas9-MAPKKK5的阳性转化植株。

将该10颗含潮霉素筛选标记的转化植株(即为T0代，编号为T0-1,T0-2,…T0-10)在温室28℃条件下培养至转化株结出种子，即T1代，收获的T1代种子(每个编号播20粒种子育秧，随机选10粒插秧)于2017年6月在海南岛进行加代繁殖，得到T2代种子，同时取对应单株的叶片，检验单株DNA的靶标区域是否发生了纯合突变，保留纯合种子，于2017年10月播种于江苏省太仓市基地，得到T3代种子。

②OsMAPKKK5的CDS区域突变的植株筛选与检测

将上述步骤①中的取得对应T1代种子单株的叶片，抽提基因组DNA，并使用OsMAPKKK5检测引物MAPKKK-seq-F:GTCCCCGTCCTCTTCGTC，其序列如SEQ ID NO.4所示和MAPKKK-seq-R:CATGTTACTCGCGGTCCTC，其序列如SEQ ID NO.5所示，进行进行PCR，将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，325bp的目的条带序列如SEQ ID NO.8所示。

上述PCR测序的目的是检测步骤(1)中的取得的单株的OsMAPKKK5的23bp靶序列是否发生突变；比对测序结果与标准SEQ ID NO.2序列后，我们发现步骤(7)得到的10颗植株中有7个植株OsMAPKKK5的23bp靶序列有发生变化，也就是说这7个植株为OsMAPKKK5基因的靶序列发生突变的植株，分别是cas9-MAPKKK5-1、cas9-MAPKKK5-2、cas9-MAPKKK5-3、cas9-MAPKKK5-5、cas9-MAPKKK5-6、cas9-MAPKKK5-7、cas9-MAPKKK5-8，而其中只有cas9-MAPKKK5-2和cas9-MAPKKK5-3是纯合株系，此为T1代；

将cas9-MAPKKK5-1、cas9-MAPKKK5-2、cas9-MAPKKK5-3、cas9-MAPKKK5-5、cas9-MAPKKK5-6、cas9-MAPKKK5-7、cas9-MAPKKK5-8的种子种下，成熟后取每个株系中表现为预期性状(植株变高)的植株叶片，提取DNA进行测序，最终选取编号为cas9-MAPKKK5-2-1和cas9-MAPKKK5-3-8作为研究对象。

对籼稻炳1B，cas9-MAPKKK5-2-1和cas9-MAPKKK5-3-8的23bp处的靶序列测序结果如下：

其中籼稻炳1B是野生型，为OsMAPKKK5原始的23bp靶序列，其序列如SEQ ID NO.2所示，cas9-MAPKKK5-2-1和cas9-MAPKKK5-3-8分别为OsMAPKKK5靶序列发生突变的突变株。

与野生型籼稻炳1B相比，cas9-MAPKKK5-2-1突变株和cas9-MAPKKK5-3-8突变株是在23bp靶序列3’端的第6-7个碱基中插入一个T碱基，其序列如SEQ ID NO.11所示。

(8)、OsMAPKKK5转基因T3代群体产量及品质性状的调查与统计将上述的cas9-MAPKKK5-2-1突变株的种子(T3代)、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的种子(T3代)以及野生型籼稻炳1B(作为对照)在于2019年6月播种，直播于江苏省复旦大学太仓基地秧田，7月份插秧，每个区域田插秧30株，行株距为6寸×6寸，每行10株，重复3次(共种90颗)，在大田条件下生长。

在成熟期统计各小区10个单株计算平均值，然后混收每个重复的植株的种子(就是30株的种子收在一起，该种子为T3代)，统计株高，千粒重，粒长，粒宽，并计算平均值，其平均值的柱状图分别如图6a、6b、6c、6d所示，其中***代表该数据与炳1B相比，pvalue<0.01，极显著水平，以上统计结果下表所示。

野生型籼稻炳1B、cas9-MAPKKK5-2-1突变株、cas9-MAPKKK5-3-8突变株的性状统计表从上表可以看出，相对于野生型籼稻炳1B来说，cas9-OsMAPKKK5-2-1植株、cas9-OsMAPKKK5-3-8植株的株高分别平均增加7.8％、4.1％，最大可达14.1％和15.0％；粒长分别平均增加4.3％、3.6％，最大可达6.8％、6.7％；粒宽分别平均增加3.7％、2.5％,最大可达6.5％、5.7％，由此可见粒型得到改善；

进一步相对于野生型籼稻炳1B来说，所得到的cas9-OsMAPKKK5-2-1植株、cas9-OsMAPKKK5-3-8植株的千粒重有明显的提高，千粒重分别平均提高了15.4％、12.7％，最大可达21.7％和20.4％，从而进一步验证了粒型得到改善。

对上述所得的cas9-OsMAPKKK5-2-1、cas9-OsMAPKKK5-3-8突变株的种子与野生型籼稻炳1B的种子颗粒进行拍照，所得的对照图如图3所示，从图3中可以看出相对于野生型籼稻炳1B来说cas9-OsMAPKKK5-2-1、cas9-OsMAPKKK5-3-8突变株的种子粒径的粒长和粒宽均增大，从而进一步证明了cas9-OsMAPKKK5-2-1、cas9-OsMAPKKK5-3-8突变株的粒型得到改善，从而千粒重也有明显的提高，同时对上述所得的cas9-OsMAPKKK5-2-1、cas9-OsMAPKKK5-3-8突变株与野生型籼稻炳1B在成熟期植株的稻穗和整个植株进行拍照，所得的对照图如图4、5所示，从图4、5中可以看出cas9-OsMAPKKK5-2-1、cas9-OsMAPKKK5-3-8突变株均比野生型籼稻炳1B的株高要高。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 苏州今新生物科技有限公司

<120> 水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻株高和粒型中的应用

<141> 2021-03-31

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2944

<212> DNA

<213> 水稻OsMAPKKK5基因全长cDNA序列(Oryza sativa)

<400> 1

gtggggaaag aaagagcgga agaaaaaaaa aacatcaaca gcaaaaccga ctcccgagaa 60

gcggagaggg aaaaaaaaat tcgcccaaat ggcgggggtc gtcgtcgtcg tcttcgtctc 120

cgatccccct ctcctcatcc gcctccaccc ctcacatcgc cattgccact gtgatcacta 180

gggtttcgcg ctgctcctcg aggtaaggat tcgctcgcct tcgccgatgc ggtggtggaa 240

gcgctcggtc tccccttccc cgtccccgtc ctcttcgtcc gcgtccgcgt ccacgcccgc 300

gtccccggcg cgggcctcga cctcccgcgt tggcggcggt gtccccagcc gccgccggga 360

tgtggtgggg tttggttggg gtggggggag tgatccgcag ccgcggttga ccaggcagag 420

gcggctgcgg cacgtcgacg acatcgaggt cggggtctcg gcgctcgggc tggattcctc 480

cccctcgccc gccgcgccct cgtcgtgccc ctccagtagg gattcggtgg ggttcggcct 540

cctgaccgcg agctccacgc cgatctcgag gaccgcgagt aacatggagg tggcgccgcc 600

gaggtcgtcg tcgtctcccg tgctgctgcc gcacccgctg cccctgcccg atgaggggga 660

ctcgccctgc cgcggctccg ggagatccct cccgtcgccc aagctattcg aaggagactg 720

caacgggtcg gccgtggagt cgaacttgct cggggtttcc gagatcggga gcgacagagc 780

atcgttgttt ccgagagtga tggctaaaac ggtgcaaaaa aaccctgagc atggtgactt 840

gcgatcaaat ggcacaaatg ggattaactg tggacaacgg aggaaggcat ttaaagagaa 900

attacaggat aagagctcag ctgaaacatt gacattcaga ttgaacatac ccgctaaaag 960

tgctccaagc agtggatttt caagccctgt acagagtcct cgaagactga gtagtgtaga 1020

ctttttgtcc actgcaacat ccacccaagg tgccaattta tcgtcagcac agtcagtctg 1080

gtctcctgat ctatatggat cttcacctcg ttgtgcgtca cctgaaaaaa ttatgggtag 1140

tcaggagcga tctcctcgct ccagtccatt gagaagccct gttctaagat caaaaaaccc 1200

aagtgcacct ccttcaccaa tgcatccaaa gttgttcccg gagaaccatg tttctcgtcc 1260

tgagggcaat gggagtgtaa atttccatcc attacccctc ccacccgcct ctgtaagccc 1320

aaagcagacg aattttagtc accagccagt tccaaaagtt gatgcaccct caatggctgg 1380

tcagtggcaa aaaggaaagc tcattggcag tggaacattt ggatgtgtat atgaggccgc 1440

caatagacac actggagctc tgtgtgccat gaaagaggtc aacataattc ccgatgatgc 1500

taaatcagct gagtctctca agcaattgga gcaggaaata aaatttctta gtcaattcaa 1560

gcatgaaaac atagtgcagt actacggcag tgaatatatt gaagatcgat tctacatata 1620

cctggaatat gttcaccctg gttcaattaa taaatatgtt aatcaacatt gtggagcaat 1680

gacagaatca gtaatccgca gcttcacccg ccatatactt aaaggccttg cctttttaca 1740

tagtcagaag attatgcata gagatatcaa aggagcaaat ttgcttgttg atgtgaatgg 1800

tgtagtcaaa ttggctgact ttggaatggc taagcatttg agtactgcag ctcctaatct 1860

ttcactgaag ggaactccat actggatggc tcctgaggtt gttcaggcta cacttgtcaa 1920

agatgtaggg tatgatcttg ctgtggatat ctggagccta ggttgcacaa ttattgagat 1980

gttcacagga aagcctcctt ggagtggtct tgaagggcct gctgcaatgt ttaaggtgtt 2040

gcataaagat ccgtcaattc cagacagttt atccccggag gggaaggaat ttctgagatg 2100

ctgcttcaga agaaatccag ctgagagacc aacagcaagc aagttgctgg agcatccatt 2160

tgtccacaat tcgaataact tcaaccagca cagtgcttta cattctccca ctggacttaa 2220

atccaccgat accggtcaca atgcaagaga caaaaagtcc tgtaagattg tttcatgcat 2280

gagggggaaa aatatgatta caactggtga aacaagcagt gctagatctc ccggttcatt 2340

atctaatcgg gtggcagtag gcttgacagc cctgccaaat ttggaaactc gtagcttatc 2400

ccctacgccg atgagtttga ggtccagtcc tggctctgcg gcccatacac ctagtatgca 2460

cttttctatc gcataccatc agcctagtcc attgccaagg ccaaatggaa aggaagcaat 2520

aaatttgttc accttgaagc atgacgagct gcctacctaa ggtgcggaaa cacatcatct 2580

gtccatccac ccaatctgtt ggatgcgagc ccatctctaa cttctgatcc ctgtactgcc 2640

agtcatcata attgaacatt cgctgggtct tgtaaagtac ttggcatgcg aaggacatca 2700

gcacggtacg atcgcaatag cttctgaaac ctgtaatgtt tgttttcaag gaaatgatgg 2760

cgtttccttt gtaagatatt atttagggtt agctgtaggt taaactaatg gccctgattg 2820

ttgccaacag gtaggacact agggttgtag ttgtagcttg tgttgttttt gctattgtgt 2880

aaccacacca cgatgtaatc attgttgatt ttttgaggcc cagtaataat gataaagagt 2940

tggc 2944

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 水稻OsMAPKKK5基因CDS区域的靶标序列(Oryza sativa)

<400> 2

atccgcagcc gcggttgacc agg 23

<210> 3

<211> 777

<212> PRT

<213> 水稻OsMAPKKK5基因编码氨基酸序列(Oryza sativa)

<400> 3

Met Arg Trp Trp Lys Arg Ser Val Ser Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Ala Ser Thr Pro Ala Ser Pro Ala Arg Ala Ser Thr

20 25 30

Ser Arg Val Gly Gly Gly Val Pro Ser Arg Arg Arg Asp Val Val Gly

35 40 45

Phe Gly Trp Gly Gly Gly Ser Asp Pro Gln Pro Arg Leu Thr Arg Gln

50 55 60

Arg Arg Leu Arg His Val Asp Asp Ile Glu Val Gly Val Ser Ala Leu

65 70 75 80

Gly Leu Asp Ser Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ser Cys Pro Ser

85 90 95

Ser Arg Asp Ser Val Gly Phe Gly Leu Leu Thr Ala Ser Ser Thr Pro

100 105 110

Ile Ser Arg Thr Ala Ser Asn Met Glu Val Ala Pro Pro Arg Ser Ser

115 120 125

Ser Ser Pro Val Leu Leu Pro His Pro Leu Pro Leu Pro Asp Glu Gly

130 135 140

Asp Ser Pro Cys Arg Gly Ser Gly Arg Ser Leu Pro Ser Pro Lys Leu

145 150 155 160

Phe Glu Gly Asp Cys Asn Gly Ser Ala Val Glu Ser Asn Leu Leu Gly

165 170 175

Val Ser Glu Ile Gly Ser Asp Arg Ala Ser Leu Phe Pro Arg Val Met

180 185 190

Ala Lys Thr Val Gln Lys Asn Pro Glu His Gly Asp Leu Arg Ser Asn

195 200 205

Gly Thr Asn Gly Ile Asn Cys Gly Gln Arg Arg Lys Ala Phe Lys Glu

210 215 220

Lys Leu Gln Asp Lys Ser Ser Ala Glu Thr Leu Thr Phe Arg Leu Asn

225 230 235 240

Ile Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ser Ser Gly Phe Ser Ser Pro Val Gln

245 250 255

Ser Pro Arg Arg Leu Ser Ser Val Asp Phe Leu Ser Thr Ala Thr Ser

260 265 270

Thr Gln Gly Ala Asn Leu Ser Ser Ala Gln Ser Val Trp Ser Pro Asp

275 280 285

Leu Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Cys Ala Ser Pro Glu Lys Ile Met Gly

290 295 300

Ser Gln Glu Arg Ser Pro Arg Ser Ser Pro Leu Arg Ser Pro Val Leu

305 310 315 320

Arg Ser Lys Asn Pro Ser Ala Pro Pro Ser Pro Met His Pro Lys Leu

325 330 335

Phe Pro Glu Asn His Val Ser Arg Pro Glu Gly Asn Gly Ser Val Asn

340 345 350

Phe His Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Lys Gln Thr

355 360 365

Asn Phe Ser His Gln Pro Val Pro Lys Val Asp Ala Pro Ser Met Ala

370 375 380

Gly Gln Trp Gln Lys Gly Lys Leu Ile Gly Ser Gly Thr Phe Gly Cys

385 390 395 400

Val Tyr Glu Ala Ala Asn Arg His Thr Gly Ala Leu Cys Ala Met Lys

405 410 415

Glu Val Asn Ile Ile Pro Asp Asp Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Lys

420 425 430

Gln Leu Glu Gln Glu Ile Lys Phe Leu Ser Gln Phe Lys His Glu Asn

435 440 445

Ile Val Gln Tyr Tyr Gly Ser Glu Tyr Ile Glu Asp Arg Phe Tyr Ile

450 455 460

Tyr Leu Glu Tyr Val His Pro Gly Ser Ile Asn Lys Tyr Val Asn Gln

465 470 475 480

His Cys Gly Ala Met Thr Glu Ser Val Ile Arg Ser Phe Thr Arg His

485 490 495

Ile Leu Lys Gly Leu Ala Phe Leu His Ser Gln Lys Ile Met His Arg

500 505 510

Asp Ile Lys Gly Ala Asn Leu Leu Val Asp Val Asn Gly Val Val Lys

515 520 525

Leu Ala Asp Phe Gly Met Ala Lys His Leu Ser Thr Ala Ala Pro Asn

530 535 540

Leu Ser Leu Lys Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu Val Val Gln

545 550 555 560

Ala Thr Leu Val Lys Asp Val Gly Tyr Asp Leu Ala Val Asp Ile Trp

565 570 575

Ser Leu Gly Cys Thr Ile Ile Glu Met Phe Thr Gly Lys Pro Pro Trp

580 585 590

Ser Gly Leu Glu Gly Pro Ala Ala Met Phe Lys Val Leu His Lys Asp

595 600 605

Pro Ser Ile Pro Asp Ser Leu Ser Pro Glu Gly Lys Glu Phe Leu Arg

610 615 620

Cys Cys Phe Arg Arg Asn Pro Ala Glu Arg Pro Thr Ala Ser Lys Leu

625 630 635 640

Leu Glu His Pro Phe Val His Asn Ser Asn Asn Phe Asn Gln His Ser

645 650 655

Ala Leu His Ser Pro Thr Gly Leu Lys Ser Thr Asp Thr Gly His Asn

660 665 670

Ala Arg Asp Lys Lys Ser Cys Lys Ile Val Ser Cys Met Arg Gly Lys

675 680 685

Asn Met Ile Thr Thr Gly Glu Thr Ser Ser Ala Arg Ser Pro Gly Ser

690 695 700

Leu Ser Asn Arg Val Ala Val Gly Leu Thr Ala Leu Pro Asn Leu Glu

705 710 715 720

Thr Arg Ser Leu Ser Pro Thr Pro Met Ser Leu Arg Ser Ser Pro Gly

725 730 735

Ser Ala Ala His Thr Pro Ser Met His Phe Ser Ile Ala Tyr His Gln

740 745 750

Pro Ser Pro Leu Pro Arg Pro Asn Gly Lys Glu Ala Ile Asn Leu Phe

755 760 765

Thr Leu Lys His Asp Glu Leu Pro Thr

770 775

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物cas9-MAPKKK5-F(“人工序列”)

<400> 4

cagtggtctc aggcatccgc agccgcggtt gacc 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物cas9-MAPKKK5-R(“人工序列”)

<400> 5

cagtggtctc aaaacctggt caaccgcggc tgcg 34

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> PCR鉴定所用的引物 Pbw2+(“人工序列”)

<400> 6

ggcgtcttct actggtgcta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> PCR鉴定所用的引物 Pbw2-(“人工序列”)

<400> 7

gtctttacgg cgagttctgt 20

<210> 8

<211> 325

<212> DNA

<213> 标准序列(“人工序列”)

<400> 8

gtccccgtcc tcttcgtccg cgtccgcgtc cacgcccgcg tccccggcgc gggcctcgac 60

ctcccgcgtt ggcggcggtg tccccagccg ccgccgggat gtggtggggt ttggttgggg 120

tggggggagt gatccgcagc cgcggttgac caggcagagg cggctgcggc acgtcgacga 180

catcgaggtc ggggtctcgg cgctcgggct ggattcctcc ccctcgcccg ccgcgccctc 240

gtcgtgcccc tccagtaggg attcggtggg gttcggcctc ctgaccgcga gctccacgcc 300

gatctcgagg accgcgagta acatg 325

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> PCR扩增检测所用的扩增引物Hyg-CX-S(“人工序列”)

<400> 9

agatgttggc gacctcgtat t 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> PCR扩增检测所用的扩增引物Hyg-CX-A(“人工序列”)

<400> 10

aagatcgtta tgtttatcgg cact 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> cas9-MAPKKK5-2-1突变株和cas9-MAPKKK5-3-8突变株的靶标序列(“人工序列”)

<400> 11

atccgcagcc gcggttgtac cagg 24